Оценка влияния агрегации белков на сотовой окислительный стресс в дрожжи
Özet
Агрегации белков вызывает сотовой оксидативного стресса. Этот протокол описывает метод для контроля внутриклеточных государства amyloidogenic белков и окислительного стресса, связанного с ними, используя проточной цитометрии. Этот подход используется для изучения поведения растворимых и подверженных агрегации вариантов пептида амилоид β.
Abstract
Сворачиванию белков и агрегация в амилоида конформации связаны с появления и прогрессирования ряд нейродегенеративных заболеваний. Однако, есть еще немного информации о как нерастворимых белков агрегатов приложить их токсические эффекты в естественных условиях. Простая модель прокариот и эукариот организмов, таких как бактерии и дрожжи, значительно способствовали нашего нынешнего понимания механизмов за внутриклеточные амилоида формирования, распространения агрегатов и токсичности. В этом протоколе использование дрожжей описан как модель анализировать взаимосвязь между формирования белков агрегатов и их влияние на сотовой оксидативного стресса. Метод объединяет обнаружения внутриклеточных растворимый/агрегированы состояния amyloidogenic белка с количественная оценка сотовой оксидативного повреждения, вызванные его выражения, с помощью проточной цитометрии (FC). Этот подход является простым, быстрым и количественные. Исследование демонстрирует технику, корреляция сотовой окислительный стресс, вызванный большой набор вариантов амилоид β пептид с их соответствующих внутренних агрегации наклонности.
Introduction
Proteostasis является основополагающим фактором, определяющим процессы фитнес и старение клеток. В клетках белок гомеостаз поддерживается контроль качества сложных белков, которые сетей, направленных на обеспечение правильного складывая смятых протеинов конформеров сопровождающих и/или их целенаправленных протеолиза с несколько хорошо сохранившихся механизмов1 ,–2,–3,–4,–5. Большое количество исследований поддерживать связь между наступлением и прогрессирование широкий спектр заболеваний человека и неудачи proteostasis, приводит к сворачиванию белков и агрегации. К примеру наличие белка месторождений считается патологическим отличительной чертой многих нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона заболеваний6,7,8, prionogenic заболевания и не дегенеративные amyloidoses9. Было высказано предположение о том, что раннего олигомерных и protofibrillar сборки в агрегации реакции являются основными elicitors цитотоксичность, установление аберрантных взаимодействиями с другими белками в переполненном клеточного окружения10. Кроме того белковых включений (PI) может передаваться между ячейками, пропагандирующих их токсический эффект11,12. Таким образом может быть, что формирование PI может действительно представляют собой механизм детоксикации, который ограничивает наличие опасных видов агрегированные в определенных местах в камере, где они могут быть обработаны или накопленные без серьезных побочных эффектов 13 , 14.
Стандарт в vitro биохимических подходов оказали важное понимание различных видов, которые заполняют агрегации реакций и их свойства,1516. Однако условия, используемые в этих анализов явно отличаются от тех, которые происходят в пределах ячейки и, таким образом, вопрос их физиологической значимости. Из-за заметным сохранение клеточных пути контроля качества белка, autophagy или регулирование сотовой окислительно-восстановительного состояния17,18 среди эукариот19,20,21 ,22,23, многообещающий дрожжей Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) стала привилегированных простой сотовая модель для изучения молекулярных детерминант агрегации белков и его связанные цитотоксическое влияние в биологически соответствующих средах24,25,26.
Склонность агрегации белков — это функция, по своей сути закодированы в первичной последовательности. Таким образом, формирование амилоид подобных структур можно предсказать на основе идентификации и оценки потенции агрегации содействия регионам в полипептиды27. Однако несмотря на успех bioinformatic алгоритмов предсказать свойства агрегации в vitro последовательностей белков, они все еще далеки от прогнозирования, как эти склонности перевести в vivo цитотоксическое влияние. Чтобы обойти это ограничение вычислительной может помочь исследования, которые касаются связи между агрегированных состояние данного белка и его связанные клеточных повреждений на систематической основе. Эта связь рассматривается в настоящем исследовании, воспользовавшись большой набор вариантов амилоид β пептида Aβ42 отличаются только в одном остатки, но отображение непрерывный спектр агрегации склонности в vivo28. В частности описывается FC-основанный подход к идентификации конформационные видов учета оксидативное повреждение, вызвал, подверженных агрегации белков в клетках дрожжей. Методология дает множество преимуществ, таких, как простота, высокой пропускная способность и точное количественное измерение. Этот подход позволил подтвердить, что PI играют защитную роль против окислительного стресса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Широкий спектр заболеваний связано с накоплением смятых протеинов в клеточных вкладов6,,78,33. Многие усилия были сделаны разгадать молекулярные механизмы, которые вызывают наступления этих болезней с использованием …
Acknowledgements
Materials
| Yeast cells BY4741 | ATCC | 201388 | Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 |
| pESC(-Ura) plasmid | Agilent Genomics | 217454 | Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3 |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma | Y1501 | Powder |
| Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids | Sigma | Y0626 | Powder |
| Raffinose | Sigma | R7630 | Powder |
| Glucose | Sigma | G7021 | Powder |
| Galactose | Sigma | G0750 | Powder |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | Solution 10X |
| CellROX Deep Red Reagent | Life Technologies | C10422 | Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm. |
| Y-PER protein extraction reagent | Thermo Scientific | 78990 | Liquid cell lysis buffer |
| Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma | A6050 | Solution |
| Bradford dye reagent | Bio-Rad | 5000205 | Dye reagent for one-step determination of protein concentration |
| β-amyloid antibody 6E10 | BioLegend | 803001 | Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS). |
| Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate | Bio-Rad | 1721011 | |
| Membrane Immobilon-P, PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
| Luminata forte | Merk | WBLUF0100 | Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF) | Sigma | 93482 | Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol |
| FACSCanto flow cytometer | BD Biosciences | 657338 | Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter |
| Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | Protein transference system |
| Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems | Bio-Rad | 1658000FC | Electrophoresis system |
Referanslar
- Frydman, J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annual Review of Biochemistry. 70, 603-647 (2001).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Wong, E., et al. Molecular determinants of selective clearance of protein inclusions by autophagy. Nature Communications. 3, (2012).
- Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. Journal of Structural Biology. 179, 152-160 (2012).
- Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction. Physiological Reviews. 82, 373-428 (2002).
- Dobson, C. M. Getting out of shape. Nature. 418, 729-730 (2002).
- Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
- Aguzzi, A., O’Connor, T. Protein aggregation diseases: pathogenicity and therapeutic perspectives. Nature Reviews Drug Discovery. 9, 237-248 (2010).
- Rapezzi, C., et al. Transthyretin-related amyloidoses and the heart: a clinical overview. Nature Reviews Cardiology. 7, 398-408 (2010).
- Deas, E., et al. Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson’s disease. Antioxidants & Redox Signaling. 24, 376-391 (2016).
- Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 301-307 (2010).
- Frost, B., Diamond, M. I. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Neuroscience. 11, 155-159 (2009).
- Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431, 805-810 (2004).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Opinion: what is the role of protein aggregation in neurodegeneration?. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 891-898 (2005).
- Mishra, R., Sjölander, D., Hammarström, P. Spectroscopic characterization of diverse amyloid fibrils in vitro by the fluorescent dye Nile red. Molecular BioSystems. 7, 1232-1240 (2011).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid by congo red spectral shift assay. Methods in Enzymology. 309, 285-305 (1999).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker’s yeast?. Nature Reviews Neuroscience. 11, 436-449 (2010).
- Tenreiro, S., Outeiro, T. F. Simple is good: yeast models of neurodegeneration. FEMS Yeast Research. 10, 970-979 (2010).
- Moosavi, B., Mousavi, B., Macreadie, I. G. Yeast model of amyloid-β and Tau aggregation in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 47, 9-16 (2015).
- Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127, 438-452 (2013).
- Yang, J., Hao, X., Cao, X., Liu, B., Nyström, T. Spatial sequestration and detoxification of huntingtin by the ribosome quality control complex. eLife. 5, (2016).
- Braun, R. J., Büttner, S., Ring, J., Kroemer, G., Madeo, F. Nervous yeast: modeling neurotoxic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 35, 135-144 (2010).
- Figley, M. D., Gitler, A. D. Yeast genetic screen reveals novel therapeutic strategy for ALS. Rare Diseases. 1, e24420 (2013).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6439-6444 (2008).
- Bharathi, V., et al. Use of ade1 and ade2 mutations for development of a versatile red/white color assay of amyloid-induced oxidative stress in saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33, 607-620 (2016).
- Pallarès, I., Ventura, S. Advances in the prediction of protein aggregation propensity. Current Medicinal Chemistry. , (2017).
- Villar-Piqué, A., Ventura, S. Protein aggregation propensity is a crucial determinant of intracellular inclusion formation and quality control degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1833, 2714-2724 (2013).
- Navarro, S., Villar-Piqué, A., Ventura, S. Selection against toxic aggregation-prone protein sequences in bacteria. Biochimica et Biophysica Acta. 1843, 866-874 (2014).
- Morell, M., de Groot, N. S., Vendrell, J., Avilés, F. X., Ventura, S. Linking amyloid protein aggregation and yeast survival. Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).
- Conchillo-Solé, O., et al. AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of "hot spots" of aggregation in polypeptides. BMC Bioinformatics. 8, 65 (2007).
- Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins. Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).
- Renner, M., Melki, R. Protein aggregation and prionopathies. Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).
- Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress. Redox Biology. 12, 699-711 (2017).
