Évaluation de l’Impact de l’agrégation de protéines sur le Stress oxydatif cellulaire chez la levure
Özet
Agrégation de la protéine provoque un stress oxydatif cellulaire. Ce protocole décrit une méthode pour surveiller les États intracellulaires des protéines amyloïdogène et le stress oxydatif qui leur sont associés, à l’aide de cytométrie en flux. L’approche est utilisée pour étudier le comportement des variantes solubles et sujette à l’agrégation du peptide amyloïde-β.
Abstract
Repliement et agrégation en conformations amyloïdes ont été associés à l’apparition et la progression de maladies neurodégénératives. Cependant, il y a encore peu d’informations sur les protéines insolubles comment agrégats exercent leurs effets toxiques in vivo. Les organismes de modèle simple de procaryotes et eucaryotes, comme les bactéries et les levures, ont largement contribué à notre compréhension actuelle des mécanismes à l’origine de la formation d’amyloïde intracellulaire, propagation des agrégats et la toxicité. Dans ce protocole, l’utilisation de levure est décrit comme un modèle à disséquer la relation entre la formation d’agrégats de protéines et de leur impact sur le stress oxydatif cellulaire. La méthode associe la détection de l’État soluble/agrégés intracellulaire d’une protéine amyloïdogène la quantification du dommage oxydatif cellulaire résultant de son expression à l’aide de cytométrie en flux (FC). Cette approche est simple, rapide et quantitative. L’étude illustre la technique en mettant en corrélation le stress oxydatif cellulaire provoqué par un grand nombre de variantes de peptide amyloïde-β avec leurs propensions agrégation intrinsèque respectifs.
Introduction
Protéostasie est un déterminant fondamental du processus de remise en forme et le vieillissement cellulaire. Dans les cellules, homéostasie des protéines est maintenue par contrôle de la qualité sophistiqué protéine réseaux ayant pour but d’assurer le repliement correct des conformères les protéines mal repliées par chaperons et/ou leur protéolyse ciblée avec des mécanismes bien conservés plusieurs1 ,2,3,4,5. Un grand nombre d’études soutiennent le lien entre le déclenchement et la progression d’un large éventail de maladies humaines et l’échec de protéostasie, conduisant à un mauvais repliement des protéines et de l’agrégation. Par exemple, la présence de dépôts protéiques est considéré comme une caractéristique pathologique des nombreuses maladies neurodégénératives, comme Alzheimer, Parkinson, Huntington maladies6,7,8, prionogenic maladies et non-dégénératives amyloses9. Il a été suggéré que premières assemblées oligomères et protofibrillar dans la réaction d’agrégation sont les éliciteurs principales de cytotoxicité, établissant des interactions avec d’autres protéines aberrantes dans le milieu cellulaire bondé10. En outre, des inclusions protéiques (PI) peuvent être transmises entre les cellules, se propageant leur effet toxique11,12. Par conséquent, il est possible que la formation de PI pourrait en effet constituer un mécanisme de détoxification qui limite la présence d’espèces agrégées dangereux vers des emplacements spécifiques dans la cellule, où ils peuvent être transformés ou accumulés sans effets secondaires majeurs 13 , 14.
Norme in vitro des approches biochimiques ont fourni des renseignements importants sur les différentes espèces qui peuplent les réactions de l’agrégation et leurs propriétés15,16. Toutefois, les conditions utilisées dans ces essais sont clairement différentes de ceux qui se produisent au sein de la cellule et, par conséquent, la question leur pertinence physiologique. En raison de la conservation remarquable des voies cellulaires tels que le contrôle de la qualité protéique, autophagie ou le règlement de l’oxydo-réduction cellulaire état17,18 chez les eucaryotes19,20,21 ,22,23, la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) s’est imposé comme un modèle cellulaire simple privilégié pour étudier les déterminants moléculaires de l’agrégation des protéines et son impact cytotoxique associé dans des environnements biologiquement pertinente24,25,26.
Propension de l’agrégation de protéines est une fonctionnalité intrinsèquement encodée dans la séquence primaire. Ainsi, la formation de structures de type amyloïde peut être prédite basée sur l’identification et l’évaluation de l’activité de promotion à l’agrégation de polypeptides27régions. Cependant, malgré le succès des algorithmes bioinformatiques pour prévoir les propriétés de l’agrégation in vitro de séquences protéiques, elles sont loin de prévoir comment ces penchants se traduiront in vivo des effets cytotoxiques. Les études qui portent sur le lien entre l’état agrégé d’une protéine donnée et ses dommages cellulaires associées de manière systématique peuvent aider à contourner cette limitation computationnelle. Ce sujet est abordé dans la présente étude, en profitant d’un grand nombre de variantes du peptide amyloïde-β Aβ42 ne différant que par un seul résidu, mais affichant une gamme continue de propensions de l’agrégation en vivo28. En particulier, une approche axée sur les FC pour déterminer l’espèce conformationnelle représentent les dommages oxydatifs induits par agrégation sujettes aux protéines dans les cellules de levure est décrite. La méthodologie fournit de nombreux avantages comme la simplicité, la capacité de haut débit et une mesure quantitative précise. Cette approche a permis de confirmer que le jeu PI un rôle protecteur contre le stress oxydatif.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un large éventail de maladies est lié à l’accumulation de protéines mal repliées en dépôts cellulaire6,7,8,33. De nombreux efforts ont été faits à élucider les mécanismes moléculaires qui déclenchent l’apparition de ces maladies en utilisant des approches informatiques, qui ne tiennent pas les concentrations de protéine compte, ou in vitro s’approche, où la concen…
Acknowledgements
Materials
| Yeast cells BY4741 | ATCC | 201388 | Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 |
| pESC(-Ura) plasmid | Agilent Genomics | 217454 | Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3 |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma | Y1501 | Powder |
| Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids | Sigma | Y0626 | Powder |
| Raffinose | Sigma | R7630 | Powder |
| Glucose | Sigma | G7021 | Powder |
| Galactose | Sigma | G0750 | Powder |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | Solution 10X |
| CellROX Deep Red Reagent | Life Technologies | C10422 | Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm. |
| Y-PER protein extraction reagent | Thermo Scientific | 78990 | Liquid cell lysis buffer |
| Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma | A6050 | Solution |
| Bradford dye reagent | Bio-Rad | 5000205 | Dye reagent for one-step determination of protein concentration |
| β-amyloid antibody 6E10 | BioLegend | 803001 | Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS). |
| Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate | Bio-Rad | 1721011 | |
| Membrane Immobilon-P, PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
| Luminata forte | Merk | WBLUF0100 | Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF) | Sigma | 93482 | Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol |
| FACSCanto flow cytometer | BD Biosciences | 657338 | Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter |
| Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | Protein transference system |
| Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems | Bio-Rad | 1658000FC | Electrophoresis system |
Referanslar
- Frydman, J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annual Review of Biochemistry. 70, 603-647 (2001).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Wong, E., et al. Molecular determinants of selective clearance of protein inclusions by autophagy. Nature Communications. 3, (2012).
- Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. Journal of Structural Biology. 179, 152-160 (2012).
- Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction. Physiological Reviews. 82, 373-428 (2002).
- Dobson, C. M. Getting out of shape. Nature. 418, 729-730 (2002).
- Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
- Aguzzi, A., O’Connor, T. Protein aggregation diseases: pathogenicity and therapeutic perspectives. Nature Reviews Drug Discovery. 9, 237-248 (2010).
- Rapezzi, C., et al. Transthyretin-related amyloidoses and the heart: a clinical overview. Nature Reviews Cardiology. 7, 398-408 (2010).
- Deas, E., et al. Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson’s disease. Antioxidants & Redox Signaling. 24, 376-391 (2016).
- Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 301-307 (2010).
- Frost, B., Diamond, M. I. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nature Reviews Neuroscience. 11, 155-159 (2009).
- Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death. Nature. 431, 805-810 (2004).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Opinion: what is the role of protein aggregation in neurodegeneration?. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 891-898 (2005).
- Mishra, R., Sjölander, D., Hammarström, P. Spectroscopic characterization of diverse amyloid fibrils in vitro by the fluorescent dye Nile red. Molecular BioSystems. 7, 1232-1240 (2011).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid by congo red spectral shift assay. Methods in Enzymology. 309, 285-305 (1999).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker’s yeast?. Nature Reviews Neuroscience. 11, 436-449 (2010).
- Tenreiro, S., Outeiro, T. F. Simple is good: yeast models of neurodegeneration. FEMS Yeast Research. 10, 970-979 (2010).
- Moosavi, B., Mousavi, B., Macreadie, I. G. Yeast model of amyloid-β and Tau aggregation in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 47, 9-16 (2015).
- Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127, 438-452 (2013).
- Yang, J., Hao, X., Cao, X., Liu, B., Nyström, T. Spatial sequestration and detoxification of huntingtin by the ribosome quality control complex. eLife. 5, (2016).
- Braun, R. J., Büttner, S., Ring, J., Kroemer, G., Madeo, F. Nervous yeast: modeling neurotoxic cell death. Trends in Biochemical Sciences. 35, 135-144 (2010).
- Figley, M. D., Gitler, A. D. Yeast genetic screen reveals novel therapeutic strategy for ALS. Rare Diseases. 1, e24420 (2013).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6439-6444 (2008).
- Bharathi, V., et al. Use of ade1 and ade2 mutations for development of a versatile red/white color assay of amyloid-induced oxidative stress in saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33, 607-620 (2016).
- Pallarès, I., Ventura, S. Advances in the prediction of protein aggregation propensity. Current Medicinal Chemistry. , (2017).
- Villar-Piqué, A., Ventura, S. Protein aggregation propensity is a crucial determinant of intracellular inclusion formation and quality control degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1833, 2714-2724 (2013).
- Navarro, S., Villar-Piqué, A., Ventura, S. Selection against toxic aggregation-prone protein sequences in bacteria. Biochimica et Biophysica Acta. 1843, 866-874 (2014).
- Morell, M., de Groot, N. S., Vendrell, J., Avilés, F. X., Ventura, S. Linking amyloid protein aggregation and yeast survival. Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).
- Conchillo-Solé, O., et al. AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of "hot spots" of aggregation in polypeptides. BMC Bioinformatics. 8, 65 (2007).
- Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins. Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).
- Renner, M., Melki, R. Protein aggregation and prionopathies. Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).
- Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress. Redox Biology. 12, 699-711 (2017).
