تجميع البروتين يتسبب الأكسدة الخلوية. ويصف هذا البروتوكول وسيلة لرصد الدول داخل الخلايا من البروتينات أميلويدوجينيك والأكسدة المرتبطة بها، باستخدام التدفق الخلوي. يتم استخدام النهج لدراسة سلوك المتغيرات القابلة للذوبان والمعرضة للتجميع من الببتيد اميلويد بيتا.
تم المتعلقة بالبروتين ميسفولدينج والتجميع في والتشكلات اميلويد إلى ظهور وتطور العديد من الأمراض الأعصاب. ومع ذلك، لا يزال هناك القليل من المعلومات حول بروتين غير قابل للذوبان كيف تمارس المجاميع التأثيرات السمية في فيفو. بسيطة بدائية وحقيقية النواة نموذج الكائنات، مثل البكتيريا والخميرة، ساهمت إلى حد كبير فهمنا الحالي للآليات وراء تشكيل اميلويد داخل الخلايا وإكثار المجاميع، وسمية. في هذا البروتوكول، وهو وصف استخدام الخميرة كنموذج تشريح العلاقة بين تشكيل المجاميع البروتين وأثرها على الأكسدة الخلوية. الأسلوب يجمع بين الكشف عن الدولة القابلة للذوبان أو تجميعها داخل الخلايا بروتين أميلويدوجينيك مع التقدير الكمي للأضرار الأكسدة الخلوية الناتجة عن التعبير عن استخدام التدفق الخلوي (FC). وهذا النهج بسيطة وسريعة، والكمية. وتوضح الدراسة التقنية طريق مضاهاة الأكسدة الخلوية الناتجة عن مجموعة كبيرة من بيتا اميلويد الببتيد المتغيرات مع ميول التجميع الجوهرية الخاصة بهم.
بروتيوستاسيس هو أحد المحددات أساسية لخلية عمليات الشيخوخة واللياقة البدنية. في الخلايا، والمحافظة على التوازن البروتين بمراقبة جودة البروتين المتطورة شبكات تهدف إلى ضمان ريفولدينج الصحيح لتجمعات من البروتين كونفورميرس بمرافقين و/أو بهم proteolysis المستهدفة مع عدة آليات مصانة جيدا1 ،،من23،،من45. عدد كبير من الدراسات تقديم الدعم إلى الارتباط بين ظهور وتقدم مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان وفشل بروتيوستاسيس، مما يؤدي إلى ميسفولدينج البروتين والتجميع. على سبيل المثال، وجود رواسب البروتين يعتبر علامة مميزة مرضية للعديد من اضطرابات الأعصاب، مثل الزهايمر، باركنسون، وهنتنغتون الأمراض6،7،8، أمراض بريونوجينيك، وأميلويدوسيس غير التنكسية9. يقترح أن أوائل الجمعيات أوليجوميريك وبروتوفيبريلار في رد فعل التجميع هي اليسيتورس الرئيسية من سيتوتوكسيسيتي، إقامة التفاعلات الشاذة مع غيرها من البروتينات في الوسط الخلوي مزدحمة10. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن ينتقل البروتين تضمينات (PI) بين الخلايا، ونشر11،التأثير السمي على12. ولذلك، يمكن أن يكون أن تشكيل بي قد تشكل في الواقع إليه ديتوكسيفينغ يقيد وجود الأنواع الخطرة المجمعة إلى مواقع محددة في الخلية، حيث يمكن معالجتها أو المتراكمة دون الآثار الجانبية الرئيسية 13 , 14.
القياسية في المختبر النهج البيوكيميائية قدمت أفكاراً هامة في مختلف الأنواع التي تعيش على تجميع ردود الفعل وعلى خصائص15،16. بيد أن الظروف المستخدمة في هذه الاختبارات بوضوح تختلف عن تلك التي تحدث داخل الخلية، والسؤال التالي، أهميتها الفسيولوجية. بسبب حفظ ملحوظة من المسارات الخلوية مثل مراقبة جودة البروتين، أوتوفاجي، أو تنظيم17،الدولة الأكسدة الخلوية18 بين حقيقيات النوى19،20،21 ،،من2223، برز مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) كنموذج خلوية بسيطة متميز لدراسة محددات الجزيئية لتجميع البروتين وآثارها السامة للخلايا المرتبطة بها في البيئات ذات الصلة بيولوجيا24،،من2526.
الميل تجميع البروتين سمة ترميز أصلاً في التسلسل الرئيسي. وهكذا، يمكن التنبؤ تشكيل هياكل مثل اميلويد استناداً إلى تحديد وتقييم الفاعلية لتعزيز تجميع المناطق البروتينية27. ومع ذلك، رغم نجاح خوارزميات بيوينفورماتيك للتنبؤ بخصائص التجميع في المختبر لتسلسل البروتين، هم لا تزال أبعد ما تكون عن التنبؤ بكيفية ترجمة هذه الميول في فيفو تأثير السامة للخلايا. قد تساعد الدراسات التي تتناول العلاقة بين الدولة مجمعة بروتين معين وعن الأضرار الخلوية المرتبطة بها بطريقة منهجية للالتفاف حول هذا القيد الحسابي. تناولت هذه الدراسة، مع استفادة مجموعة كبيرة من المتغيرات من بيتا اميلويد الببتيد Aβ42 متباينة في رواسب واحد فقط، ولكن عرض نطاق متواصل من تجميع المزيف في فيفو28هذا الاتصال. على وجه الخصوص، يرد وصف لنهج القائم على التيسير لتحديد الأنواع conformational المحاسبة لأضرار الأكسدة بالبروتينات المعرضة للتجميع في خلايا الخميرة. المنهجية التي توفر العديد من المزايا مثل البساطة والقدرة الإنتاجية العالية، والقياس الكمي الدقيق. مكن هذا النهج لتأكيد أن تلعب بي بدور وقائي ضد الأكسدة.
مجموعة واسعة من أمراض ترتبط بتراكم البروتينات تجمعات في الرواسب الخلوية6،،من78،33. وقد بذلت جهود كثيرة لكشف الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى ظهور هذه الأمراض باستخدام النهج الحسابية التي لا تأخذ بعين الاعتبار تركيزات الب…
Yeast cells BY4741 | ATCC | 201388 | Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 |
pESC(-Ura) plasmid | Agilent Genomics | 217454 | Yeast expression plasmid with a Gal promotor. Selectable marker URA3 |
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma | Y1501 | Powder |
Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids | Sigma | Y0626 | Powder |
Raffinose | Sigma | R7630 | Powder |
Glucose | Sigma | G7021 | Powder |
Galactose | Sigma | G0750 | Powder |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | Solution 10X |
CellROX Deep Red Reagent | Life Technologies | C10422 | Free radical cell-permeant fluorescent sensor, non-fluorescent while in a reduced state, and exhibits bright fluorescence upon oxidation by reactive oxygen species (ROS), with absorption/emission maxima at 644/665 nm. |
Y-PER protein extraction reagent | Thermo Scientific | 78990 | Liquid cell lysis buffer |
Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma | A6050 | Solution |
Bradford dye reagent | Bio-Rad | 5000205 | Dye reagent for one-step determination of protein concentration |
β-amyloid antibody 6E10 | BioLegend | 803001 | Mouse IgG1. The epitope lies within amino acids 3-8 of beta amyloid (EFRHDS). |
Goat anti-mouse IgG-HRP conjugate | Bio-Rad | 1721011 | |
Membrane Immobilon-P, PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
Luminata forte | Merk | WBLUF0100 | Premixed, ready to use chemiluminescent HRP detection reagent |
Phenylmethanesulfonyl fluoride solution (PMSF) | Sigma | 93482 | Protease inhibitor. Dissolved at 0.1 M in ethanol |
FACSCanto flow cytometer | BD Biosciences | 657338 | Equipped with a 488 nm blue laser for the detection of GFP, and 635 nm red laser / 530/30 nm BP filter and 660/20 BP filter |
Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | Protein transference system |
Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems | Bio-Rad | 1658000FC | Electrophoresis system |