A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

Lisa N. Chesner; Colin Campbell

doi:10.3791/57413

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Genetik

Ein einfacher, rasches und quantitativen Assay zur Maßnahme Reparatur von DNA-Protein-Querverbindungen auf Plasmide transfiziert in Säugerzellen

Published: March 05, 2018

doi:

10.3791/57413

Lisa N. Chesner¹, Colin Campbell¹

¹Department of Pharmacology,University of Minnesota

Özet

Das Ziel dieses Protokolls ist, die Reparatur von definierten DNA-Protein-Querverbindungen auf Plasmid DNA zu quantifizieren. Lesioned Plasmide sind in Säugetieren Empfängerzelle Linien und niedermolekularen Gewicht geerntet mehrere Zeit Punkte nach Transfektion transfiziert. DNA Reparatur Kinetik werden quantifiziert, gefolgt von qPCR Strang-spezifische Primer-Erweiterung verwenden.

Abstract

Diese Methode soll bieten eine flexible, schnelle und quantitative Technik um die Kinetik der DNA-Protein Crosslink (DPC) Reparatur in Säugetieren Zelllinien zu untersuchen. Dieser Assay untersucht anstatt weltweit prüfen Entfernung der Harnblase-induzierte oder spontane chromosomalen DPC-Entfernung, die Reparatur einer homogenen, chemisch definierte Läsion, die speziell an einem Standort in einem Plasmid DNA Substrat eingeführt. Wichtig ist, ist dieser Ansatz vermeidet die Verwendung radioaktiver Stoffe und ist nicht abhängig von teuren oder hoch spezialisierte Technologie. Stattdessen verlässt sich auf standard rekombinanter DNA-Verfahren und weithin verfügbar in Echtzeit, quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) Instrumentierung. Aufgrund der inhärenten Flexibilität der Strategie genutzt, die Größe des Proteins vernetzt, sowie die Natur der chemischen Bindung und die präzise DNA kann Sequenz Kontext des Standortes Anlage variiert werden, um die jeweiligen Beiträge dieser Adresse Parameter, um die Gesamteffizienz des DPC-Reparatur. Mit dieser Methode wurden Plasmide enthält eine ortsspezifische DPC in Zellen transfiziert und niedermolekularen DNA erholt zu verschiedenen Zeitpunkten nach Transfektion. Dann wird wiederhergestellte DNA Strang-spezifische Primer Extension (SSPE) mit einer Grundierung, die komplementär zu den beschädigten Strang des Plasmids unterzogen. Seit die DPC Läsion Blöcke Taq-DNA-Polymerase kann das Verhältnis von reparierten, UN-reparierte DNA quantitativ mit qPCR beurteilt werden. Zyklus (CT) Grenzwerte dienen zum berechnen, dass Prozent zu verschiedenen Zeitpunkten in den jeweiligen Zelllinien zu reparieren. Diese SSPE-qPCR-Methode kann auch zur quantitativ bewerten die Reparatur Kinetik DNA-Addukt, dass Blöcke Taq Polymerase.

Introduction

Hier beschriebenen wird eine PCR-basierter Test SSPE-qPCR bezeichnet. Der Zweck dieser Methode ist, DPC-Reparatur auf Plasmid zu quantifizieren, die DNA in Reparatur mangelhaft und tüchtig Säugerzellen transfiziert. Dieser Assay ist rasche, quantitative, extrem flexibel und direkt Maßnahmen reparieren Aktivität. Während dieser Bericht konzentriert sich auf die Verwendung dieser Methode zur Reparatur von DPCs studieren, veranschaulichen Ergebnisse dargestellt, dass eine Reparatur einer Läsion, blockiert, die Taq Polymerase mit dieser Methodik untersucht werden kann.

Die Beweggründe für die Entwicklung dieser Methode ist es, Einblick in die Mechanismen, durch die Säugerzellen DPCs reparieren. Im Gegensatz zu anderen Arten von DNA-Schäden sind DPCs massiv diverse¹^,². Studien haben gezeigt, dass Hunderte von zellulären Proteinen vernetzt zu DNA und das für jedes Protein gibt es in der Regel zahlreiche Aminosäure-Seitenketten werden können, das kovalent an zelluläre DNA³angebracht werden kann. Darüber hinaus gibt es zahlreiche chemische Befestigungspunkte für Proteine auf das DNA-Rückgrat, darunter mehrere Positionen auf der Nukleotidbasen sowie auf die Ribose Zucker⁴^,⁵. Diese chemische Vielfalt wirft die Aussicht, der unterschiedliche biochemische Stoffwechselwege herangezogen werden können, um verschiedene Arten von DPCs zu reparieren. Es war mit diesem Anliegen im Auge, dass die SSPE-qPCR-Assay entwickelt wurde.

Verschiedene Techniken sind entwickelt worden, um einen Einblick in die Molekularbiologie der DPC Zellreparatur. Im folgenden finden einer Übersicht über die wichtigsten Ansätze, die, mit einer Zusammenfassung der wichtigsten Stärken und Schwächen entwickelt wurden, jeder besitzen. Es ist hervorzuheben, dass während dieser Zusammenfassung konzentriert sich auf Studien der DPC-Reparatur in Säugetieren Zellkultursysteme, bedeutende Beiträge zum aktuellen Modell der DPC Reparatur vorgenommen worden mit mikrobiellen und zellfreien Systemen, die nicht in diesem diskutiert werden Manuskript.

Vielleicht ist die einfachste Strategie, die ergriffen werden, um einen Einblick in die Genetik der DPC Reparatur zur Bewertung der jeweiligen Empfindlichkeit zum Zelltod im Wildtyp und mutierten Zellen, Agenten, die DPCs⁶^,⁷induzieren beobachtet. Diese Strategie ist relativ schnell, kostengünstig und erfordert keine Spezialwissen über die Fähigkeit, grundlegende Zelle Kulturtechniken durchzuführen. Gegengewicht zu diesen Vorteilen sind zahlreiche Beschränkungen dieses Ansatzes, einschließlich der folgenden. Der Test misst zunächst nicht direkt DNA-Reparatur. Die Arbeitshypothese, die hinter dieser Strategie ist, dass Inaktivierung Mutationen in Genen Codierung entsprechenden DNA-Reparatur-Proteine führt zu einer Anhäufung von DNA, dass Trigger programmierten Zelltod beschädigen. Jedoch könnte, Mutationen in Genen, die DNA-Reparatur-Proteine codieren prinzipiell verbessern (zelluläre Empfindlichkeit in xenobiotische-induzierte Zelltod oder reduzieren). Zweitens, Agenten, die ausnahmslos DPCs erstellen induzieren andere Arten von DNA-Schäden (eine Ausnahme ist 5-Aza-2′-Deoxycytadine, aber dieses Mittel verbraucht auch zelluläre Methyltransferase Level⁸). Infolgedessen ist es denkbar, dass verstärkte zelluläre Überempfindlichkeit gegenüber der betreffenden Agent Mängel in der Reparatur von interstrand Querverbindungen oder andere Läsionen widerspiegeln kann. Drittens stehen wie oben erwähnt wurde, DPCs eine stark heterogene Klasse bestehend aus verschiedene Arten von chemischen Querverbindungen mit verschiedenen Protein-Partnern. Es ist möglich, dass während der Reparatur von einem oder mehreren Untertypen dieser Läsionen in einem bestimmten genetischen Hintergrund geändert werden kann, dieser Unterschied wesentlich verändern zelluläre Überempfindlichkeit gegen Tod infolge dieser Agent möglicherweise nicht ausreichen. Zusammenfassend lässt sich sagen während diese Strategie einen attraktiven Ausgangspunkt darstellt unterstreichen die oben beschriebenen Einschränkungen die Bedeutung andere, direkte Methoden zur Untersuchung der Kinetik der DPC-Reparatur zu verfolgen.

Eine Reihe von damit verbundenen Ansätzen wurden entwickelt, um dieses Ziel zu erreichen. Ermittler haben beispielsweise Methoden zur Unterscheidung zwischen “freien” DNA und Protein gebundene DNA-⁹^,¹⁰^,¹¹entwickelt. Mit diesen Ansätzen ist es möglich, stationäre DPCs oder folgenden Exposition gegenüber einem DPC-produzierende Erreger in verschiedene genetische Hintergründe vergleichen. Die beiden Strategien, die am weitesten verbreitete beinhalten freie DNA mit einem Nitrozellulose-Membran verbindliche Strategie oder KCl/SDS Niederschlag¹²^,¹³DPC-haltigen DNA trennt. In der ehemaligen Ansatz sind Zellen lysiert und durch eine Nitrozellulose-Filter geleitet. Da Nitrozellulose Protein bindet, behält der Filter Protein-chromosomale DNA, erlaubt freien DNA zu durchqueren. In der letzteren Strategie ist freie DNA Protein-gebundenen DNA getrennt, beruht auf der Tatsache, dass SDS an Proteine aber nicht DNA bindet und durch die Zugabe von KCl ausgefällt werden kann. Infolgedessen wird Protein-chromosomale DNA unlöslich, während ungebundenen DNA in Lösung bleibt. DPC-haltigen DNA kann dann quantitated mit radioaktiven Thymidin (wenn Zellen zunächst metabolisch gekennzeichnet wurden) oder durch einen DNA-selektive Fluoreszenzfarbstoff wie Hoechst 33258. Diese Methoden sind reproduzierbar und benötigen eine kleine Anzahl von Schritten. Jedoch bieten sie keine Informationen über die Natur der chemischen Crosslink durch die Protein DNA zugeordnet ist. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, diese Tests können überschätzen, DPC fälschlich erzielte unvollständig Reparatur, d.h.proteolytische Verarbeitung bis hin zur kleineren DNA-Peptid-Querverbindungen, die möglicherweise nicht so leicht gefangen oder, als bona fide DNA ausgefällt zu reparieren zu reparieren.

Comet-Assays lässt sich DPC Bildung in Zellen¹⁴zu visualisieren. In diesen Experimenten verringern das Vorhandensein von DPCs DNA-Migration kann dann durch Vorbehandlung mit Proteinase K. umgekehrt werden Daher kann die Länge der Rute zur DPC-Bildung zu schätzen. Wie oben erwähnt, erstellen DPC-forming Drogen jedoch andere Arten von DNA-Schäden, die Schwanzlänge verändern könnte. Dieses Protokoll ist auch hochtechnische und erfordert Erfahrung und Ausbildung in der konfokalen Bildgebung.

Massenspektrometrie kann verwendet werden, um DPC Reparatur Kinetik nach der Behandlung mit Vernetzung Agenten¹⁵^,¹⁶^,¹⁷zu studieren. Diese Experimente Zellen mit DPC-bildenden Mitteln zu behandeln und DPCs über Biotin erfassen oder Phenol: Chloroform (1:1) Extraktion zu isolieren. Massenspektrometrie kann dann verwendet werden, zu identifizieren die vernetzte Proteine oder quantitate die Höhe der DPCs im Laufe der Zeit gebildet. Der große Vorteil dieses Ansatzes ist die Natur der erstellten Daten. Es ist möglich, Katalog genau die Arten von Proteinen, die nach Exposition gegenüber einem Fremdstoff, jedoch dieses Protokoll vernetzt werden ist teuer, zeitaufwändig und wird begrenzt durch die Art der Crosslink, die erkannt werden können.

Maizels Et Al. entwickelt einen sensible “RADAR” (rapid Ansatz DNA-Addukt Erholung) Assay, quantitate Immunodetection DNA-Protein-Addukte sowie ein ELISA-basierten RADAR Assay¹⁸^,¹⁹. Diese Tests eignen sich besonders für trapping DNA-Protein-Zwischenprodukte, die vorübergehend in den Zellen bilden und erzeugen Proben geeignet für Massenspektroskopie, neue Proteine zu identifizieren Addukte. Dieser Immunodetection-Assay stützt sich auf die Verfügbarkeit von Antikörpern, die DNA-Protein-Crosslink zu erfassen und daher möglicherweise nicht in der Lage erkennen geschädigter DNA-Peptid Addukte bilden während der Reparatur. Vor kurzem, eine spezifische DPC reparieren Weg zur DNA-Replikation und eine DNA-abhängige Metalloprotease entdeckte Spartan Proteolyzed, kleinere Peptide während Reparatur²⁰^,²¹in welche DPCs sind verbunden. Vererbte Mutationen in diesem Gen sind mit Ruijs-Aalfs-Syndrom beim Menschen eine Krankheit gekennzeichnet durch genomische Instabilität, vorzeitiger Alterung und Leberkrebs²². Mäuse mit gentechnisch Spartan Gendefekten anzeigen ähnlichen Phänotypen²³

Wirtszelle Reaktivierung der transkriptionelle Aktivität wurde verwendet, um die Reparatur von definierten Läsionen auf transfizierten Plasmid DNA-Substrate²⁴^,²⁵zu studieren. In diesen Experimenten, Plasmid DPCs (oder andere Arten von DNA-Läsionen) enthalten, die die Transkription eines Reporters, wie z. B. Luciferase zu blockieren, sind in Zellen transfiziert. Lumineszenz-Messungen genommen 24-72 h später sind dann korreliert mit DPC zu reparieren. Jedoch diese indirekte Reparatur Assays sind nicht in der Lage frühestens 24 h nach Transfektion Reparatur Ereignisse zu erkennen und können nicht unterscheiden zwischen RNA-Polymerase Bypass teilweise reparierte Substrate und vollständige Reparatur.

Jede der oben beschriebenen Methoden hat Vorteile und hat dazu beigetragen, das aktuelle Modell der DPC-Reparatur. Jedoch die SSPE-qPCR-Assay umgeht einige der Einschränkungen verbunden mit diesen anderen Ansätzen und folglich bieten genauere Einblicke in DPC Reparaturmechanismen. Beispielsweise kann die SSPE-qPCR-Assay Reparatur von standortspezifischen DPCs auf DNA in intakten Säugerzellen direkt messen. Diese Methode ist vielseitig und wurde verwendet, um nach Transfektion in Hamster und humanen Zelllinien Reparatur-Ergebnisse zu erhalten. Transfektion des Plasmids kann mit Lipofektion oder Elektroporation in kultivierten Säugetierzellen Linien durchgeführt werden. Es wird auch sichergestellt, dass nur Reparatur von definierten DPCs wird gemessen, und nicht andere Arten von DNA-Schäden durch die meisten DPC-bildende Mittel induziert. Die SSPE-qPCR ist einfach durchzuführen, kostengünstig und schnell. Erzielten Ergebnisse mit dieser Assay haben bereits 2 h nach Transfektion Reparatur Ereignisse erkannt. Mit dieser Methode, können Variablen, die DPC-Reparatur-Ergebnisse beeinflussen können in einer Art und Weise untersucht werden, die sensible und effizient ist. Zum Beispiel hat die Rolle der Transkription in DPC Reparatur noch streng bewertet werden. Aufgrund der Flexibilität der SSPE-qPCR-Assay kann Ortsbild Vernetzung des der DPC manipuliert werden, um mit dieser Frage beschäftigen. Einführung der Herkunft der Replikation in der DPC-Lager-Plasmid ist darüber hinaus lässt sich den Einfluss der Replikation auf DPC Reparatur Adresse. Darüber hinaus können mehrere Querverbindungen auf dem Plasmid zu prüfen, Unterschiede in der Reparatur von einem einzigen DPC gegen mehrere Querverbindungen erstellt werden. Das sind Fragen, die schwer zu beantworten, mit der chromosomalen DNA wäre aber leicht mit der SSPE-qPCR-Assay angesprochen werden können. Insgesamt die SSPE-qPCR-Assay erfordert gereinigt, Plasmid-DNA in Mikrogramm-Mengen mit einer Läsion von einem bekannten Speicherort. Addukte neben DPC in diesem Assay verwendet werden kann, die Läsion muß jedoch in der Lage, die Erweiterung von Taq Polymerase blockiert.

Protocol

1. Generation der DPC-haltigen Plasmid Kombinieren Sie 80 Pmol Oligonukleotid mit einer 8-Oxoguanine-Rückstände (20 µL) mit 10 Einheiten des T4-Polynukleotid-Kinase (1 µL) in 10 X Ligase Puffer (5 µL). Fügen Sie Wasser auf ein Gesamtvolumen von 50 µL zu erreichen und bei 37 ° C für 30 min in einem beheizten Wasserbad inkubieren. Kombinieren der phosphorylierten Oligonukleotid (50 µL), 80 Pmol einzelsträngiger DNA (80 μl), 100 Einheiten Taq Polymerase (20 µL) in 10 X Taq Reaktion Puffer (25 µL), 100 mM ATP (20 µL), 10 mM dNTPs (20 µL), NEB Puffer 2 (25 µL) und 8 µg BSA (20 µL), 260 µL. total Inkubation der Probe in einem Thermocycler bei 75 ° C für 15 min, gefolgt von 37 ° C für 5 min eingestellt. Als nächstes fügen Sie 60 U T4-Polymerase (20 µL), 8.000 U T4-Ligase (20 µL), 100 mM ATP (20 µL), 10 mM dNTPs (20 µL), NEB Puffer 2 (15 µL) und 8 µg BSA (20 µL) auf insgesamt 375 µL inkubieren die Reaktion über Nacht bei 37 ° C (Abb. 1A). Erstellen Sie eine Puffer gesättigt Phenol: Chloroform Mischung 50: 50. Fügen Sie gleiche Volumina der einzelnen Komponenten, Mischung, und drehen in einer Tischplatte Zentrifuge bei 21.130 x g für 5 min. Chloroform Antriebe Wasser aus dem Puffer gesättigt Phenol, zwei Schichten bilden: eine obere, wässrige Schicht und einer unteren, organische Schicht. Die Primer Extension Reaktion, Mischung, 375 µL der unteren, organische Schicht hinzu und drehen in einer Tischplatte Zentrifuge bei 21.130 x g für 5 min.Achtung: Phenol und Chloroform sind gefährliche Stoffe und Vorsichtsmaßnahmen ergriffen werden, um Kontakt mit den Augen oder der Haut zu vermeiden. Nach Zentrifugation vorsichtig die oberste Schicht zu extrahieren und mischen mit Ammoniumacetat hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 0,3 M, gefolgt von 2 Bände von 100 % Ethanol. Speichern Sie die Lösung bei-20 ° C für mindestens 30 Minuten oder über Nacht. Drehen Sie der Probe in einer Tischplatte Zentrifuge bei 15.000 x u/min bei 4 ° C für 10 min. entfernen überstand und waschen Sie das Pellet in 1 mL 70 % igem Ethanol. Drehen Sie die Probe in einer Tischplatte Zentrifuge bei 15.000 x u/min bei 4 ° C für 5 min. Überstands zu entfernen und das Pellet in 100 µL Wasser Aufschwemmen. Kombinieren Sie 50 µL DNA aus dem vorherigen Schritt mit 16 µL 6 x Gel-Loading Dye und 34 µL Wasser und vorbehaltlich Elektrophorese auf einem 0,8 % Low-Melt Agarose-gel mit 0,5 µg/mL Interkalation Bromid. Führen Sie das Gel mit 2 V/cm auf ein 10-cm-Gel für 6 h in 1 X TAE-Puffer. Verbrauchsteuern Sie die supercoiled Band mit einer Rasierklinge und wiegen die Gel-Scheibe (Abbildung 1A). Führen Sie eine Positivkontrolle dienen als Marker für wo die kovalent geschlossene, supercoiled DNA wandert.Vorsicht: Interkalation Bromid ist ein Mutagen und Vorsichtsmaßnahmen ergriffen werden, um Kontakt mit der Haut zu vermeiden. Darüber hinaus ist es wichtig, die Zeit zu minimieren, die die Plasmid-Probe UV ausgesetzt, um die Bildung von UV Photoproducts zu reduzieren. Das Gel-Slice durch Zugabe von 10 % β-Agarase Reaktion Puffer für jeden mg Gel Gewicht zu verdauen. Bei 65 ° C für 10 min und abkühlen auf 42 ° c inkubieren Fügen Sie 10 U der β-Agarase und inkubieren Sie bei 42 ° C für 1 h. Folgenden Inkubation messen Sie das Volumen und eine Endkonzentration von 0,3 M und Chill auf dem Eis für 15 min. Zentrifugieren bei 15.000 x g für 15 min bei Raumtemperatur Ammoniumacetat hinzu, den Überstand zu sammeln, und hinzufügen 2 Bände von Isopropanol. Über Nacht bei-20 ° C kühlen. Die gereinigte, supercoiled DNA für 10 min bei 15.000 u/min x in einer Tischplatte Zentrifuge bei 4 ° C zentrifugiert und das Pellet in 40 µL Wasser Aufschwemmen. Crosslink 12 Pmol (15 µL) der DNA zu 36 Pmol Oxoguanine Glycosylase (1 µL) im Puffer mit 100 mM NaCl (3 µL), 1 mM MgCl2 (3 µL), 20 mM Tris-HCl pH 7,0 (6 µL) und 10 mM Natrium Cyanoborohydride (2 µL) zu einem Endvolumen von 30 µL bei 37 ° C erreichen 30 min26. 1 µL querverbunden Probe zu entfernen und in 500 µL Wasser zu dienen als eine 0 h Daten zeigen und analysieren auf PCR in Schritt 3 zu verdünnen. (2) kCl/SDS Niederschlag Um Vernetzungseffizienz zu visualisieren, Einschränkung verdauen 1 µg des Plasmids vernetzt mit 1 μl BspDI in 10 X Puffer bei 37 ° C für 1 h, zwei verschiedene große DNA-Fragmente zu generieren.Hinweis: Ein Fragment werden vernetzt, Protein (4,4 kb) und der andere wird nicht (2,8 kB) (Abbildung 1 b). Teilen Sie die Proben in zwei Hälften, beide um eine Endkonzentration von 0,5 % SDS hinzufügen und bei 65 ° C für 10 min inkubieren. Hinzufügen von KCl (Endkonzentration 100 mM), einer der Proben und inkubieren Sie für 5 min auf Eis. Zentrifugieren Sie beide Proben bei 12.000 x g für 5 min bei 4 ° C und laufen Sie die Überstände auf ein Agarosegel zu schätzen, die prozentuale Konjugation des Proteins zu DNA-12.Hinweis: KCl/SDS Niederschlag wird für die Qualitätskontrolle, nicht Substrataufbereitung verwendet. (3) Transfection in Säugerzellen Brunnen Sie 1 Tag vor Transfektion, Platte 0,5 x 106 Zellen/in einem 6-Well-Platte. Mischen Sie am nächsten Tag 1,5 µg (30 µL) des DPC-haltigen Plasmids (aus Schritt 1.6) mit 300 µL Serum-freie Kultur Medien. Mischen Sie in einem anderen Gefäß 12 µL Transfection Reagens und 300 µL Serum-freie Kultur Medien. Kombinieren Sie 300 µL verdünnter DNA mit 300 µL verdünnter Transfection Reagens und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Jede der zwei Brunnen 250 µL der komplexe hinzu und ein Minimum von 1 h bei 37 ° c inkubieren Nach Inkubation Medien zu entfernen, fügen Sie 1 mL 0,6 % SDS/0,01 M EDTA und bei Raumtemperatur inkubieren Sie für 10-15 min. kratzen die Zellen mit einem Kautschuk-Polizisten und transfer zum ein 1,5 mL Microfuge Rohr. Fügen Sie 200 µL 5 M NaCl (Endkonzentration von 1 M), Invert vorsichtig 5 Mal, und bei 4 ° C über Nacht27inkubieren. Zentrifugieren Sie die Proben bei 21.130 x g in einer Tischplatte Zentrifuge bei 4 ° C für 30 min, sammeln Sie überstand, Ethanol Niederschlag zu, wie oben beschrieben und in 50 µL Wasser Aufschwemmen. (4) SSPE-qPCR Mischen Sie 1 µL der wiederhergestellten DNA von jedem Zeitpunkt (einschließlich 0 h), 2 x SYBR green PCR master-Mix (30 µL), 27 µL Wasser und 1 µL (100 pMol) Grundierung komplementär zu den Schaden-Strang des Plasmids (Primer R, Abbildung 2). PCR unter Verwendung der folgenden Bedingungen erfüllen: erste Pre-Schmelze für 10 min bei 90 ° C, gefolgt von 8 Zyklen von: 90 ° C, 15 s, 65 ° C, 1 min. Am Ende des Zyklus 8 hinzufügen 1 µL (100 pMol) der zweite Grundierung auf insgesamt 60 µL (Primer L, Abbildung 2)28 (siehe Tabelle der Materialien für Reagenz Details). Mix 1 µL unverstärkt erholt jeden Zeitpunkt (einschließlich 0 h), 2 x master-Mix (30 µL), 27 µL Wasser und 1 µL jedes Primers (100 pMol) auf insgesamt 60 µL DNA. Laden Sie eine 96-Well-PCR-Platte mit den Proben von Schritte 4.1 und 4.2 (20 µL/Well, in dreifacher Ausfertigung) und durchführen Sie qPCR für 30 Zyklen mit den oben beschriebenen Bedingungen. Durchschnitt der CT-Werte aus jeder dreifacher Proben. Subtrahieren Sie die CT-Werte erzeugt im Schritt 4.1 von denen im Schritt 4.2 Delta CT Wert für jede Probe zu erhalten. Subtrahieren Sie den Zeitpunkt 0 h aus dem CT-Deltawert, jeden beliebigen Hintergrund (siehe Vertreter Ergebnisse Abschnitt für eine ausführliche Beschreibung) zu entfernen. Wandeln Sie das Delta CT-Wert in Prozent Reparatur mit Hilfe der Formel:

Representative Results

Um die SSPE-qPCR-Assay zur Zellreparatur DPC Bewertung nutzen zu können, muss eine ausreichende Menge (µg Beträge) an qualitativ hochwertigen DPC Reparatur Substrat vorbereitet werden. Um dieses Produkt zu erhalten, wurde ein Oligonukleotid mit einer 8-Oxoguanine-Rückstand geglüht, ergänzende einzelsträngiger DNA, Grundierung verlängert und Gel gereinigt, um sicherzustellen, dass nur kovalent geschlossenes kreisförmiges Produkt für Transfektionen (Abbildung verwendet wurde 1a). dieser Bericht konzentriert sich auf Substraten in dem Natriumborhydrid-Trapping verwendet wird, um eine kovalente Crosslink zwischen rekombinanten menschlichen Oxoguanine Glycosylase und einer Ribose-Einheit auf einem kreisförmigen Plasmid doppelsträngige Molekül schaffen obwohl analoge Ansätze kann verwendet werden, um chemisch unterschiedlichen DPC Substrate zu erhalten. Die Oxoguanine-Glycosylase/Natriumborhydrid Trapping-Strategie ist besonders attraktiv, in Anbetracht der extrem hohe Effizienz der Vernetzungsreaktion. Wie in Abbildung 1 bgezeigt, KCl/SDS Niederschlag durchgeführt auf einem DPC Substrat, die in zwei verdaut worden hatte Fragmente selektiv und nahezu quantitativ erschöpft das DNA-Fragment der DPC beherbergen. Diese Ergebnisse stützen die Schlussfolgerung, dass im wesentlichen 100 % der Plasmid-Substrat-Moleküle ein Protein Crosslink enthalten. Die SSPE-qPCR-Assay beschrieben im Abschnitt Protokoll nutzt CT-Werte erzeugt durch qPCR um den Prozentsatz der DPC-Reparatur nach Transfektion in Säugetierzellen zu berechnen. Wie in Abbildung 2 dargestellt, blockiert die Protein-Crosslink Taq Polymerase die ‘R’ Grundierung geglüht, die DPC-haltigen Strang zu erweitern. Eine zweite, wichtige Funktion dieser Assay ist die Einbeziehung von acht Runden von SSPE Reaktionen (mit dem R-Primer) vor der Durchführung der qPCR-Assay. Während unbeschädigt (oder reparierten) DNA während dieser SSPE Reaktionen verlängert wird, werden schaffen eine Bindungsstelle für die nachgelagerten ‘L’-Grundierung, beschädigte DNA (oder unvollständig reparierte DNA) nicht verlängert werden. Folglich erhöht SSPE Achtfache die Fülle der Stränge unbeschädigt (oder reparierten) durch. Das bedeutet, die Proben repariert, in denen die SSPE Schritt vor qPCR durchgeführt wurde, zeigt einen CT-Wert, der drei Einheiten niedriger als der für einen identischen Probe in der SSPE vor qPCR (Abbildung 2) nicht ausgeführt wurde. Die drei-Einheit Unterschied in CT-Werte für die beiden Behandlungen, genannt ΔCT, beobachtet spiegelt die Tatsache wider, dass 8 = 23. Dieses Delta CT Wert kann verwendet werden, um zelluläre DNA-Reparatur Aktivität mithilfe der Formel zu berechnen: Prozent DNA-Reparatur = (2ΔCT /23) X 100. Kontrolle Versuche bestätigt, dass eine Delta CT-Wert von ca. 3 konsequent beobachtet wurde als unbeschädigt Substrat Plasmide SSPE-qPCR (Daten nicht gezeigt) ausgesetzt waren. Tabelle 1 zeigt Beispielwerte CT, die aus DPC-haltigen Plasmid Substraten erzeugt wurden, die waren erholte sich von chinesischen Hamsters Lunge Fibroblasten 3 h und 8 h nach Transfektion (Tabelle 1A), ebenso wie von Null Proben Zeit d. h., Proben, die wie im Abschnitt Protokoll beschrieben wurden, aber nicht transfizierten Zellen (Tabelle1 b). Die Tabelle enthält auch die ΔCT und Prozent reparieren Werte (berechnet nach der Formel 2ΔCT23 X 100) von diesen Proben erreicht. Wie in Tabelle 1Adargestellt, die prozentuale Reparatur berechnet aus Proben geerntet 3 h und 8 h nach Transfektion betrug 66 % bzw. 93 %. Diese Werte werden dann subtrahiert die Prozent aus, die aus der Analyse der 0 h Probe zu bestimmen reparieren. Tabelle 1 b zeigt die CT-Werte für zwei verschiedene 0 h-Proben in denen effizienten Vernetzung war oder war nicht vor Transfektion erreicht. Effizient führte vernetzt Probe ein Delta CT-Wert von 0,8 eine schlecht vernetzt Probe in einem Delta CT-Wert von 2,5 geführt. Bisher ist es nicht möglich, genau zu bestimmen, die Quelle des Signals in 0,8 Hintergrund gewesen die effizient vernetzt 0 h Probe. Es ist unwahrscheinlich, dass diesem Hintergrund ein niedriges Niveau der entweder spontane DPC-Entfernung reflektiert, oder ist durch ein niedriges Niveau der Taq Polymerase “bypass” Synthese durch die DPC-Läsion: umfangreiche Experimente durchgeführt auf hochgereinigte einsträngige M13 Substrat konsequent ergab eine Delta CT-Wert von ca. 0,8, background d. h.im Wesentlichen identisch zu diesem”” Erweiterung gesehen in DPC-haltigen Substraten. Daher ist es wahrscheinlich, dass es ein geringer Grad an MIS Grundierung des Primers “R” bei SSPE, die Ergebnisse in der Generation der eine kleine Menge des Produkts, die nachträglich verstärkt werden kann, wenn der ‘L’-Primer hinzugefügt wird und qPCR durchgeführt. Anstrengungen zur Beseitigung von diesem Hintergrund durch die Manipulation von PCR-Zustände haben bis heute versäumt, diesen Mangel zu beseitigen. Jedoch erlaubt die Subtraktion Strategie beschriebenen genaue Schätzung der DPC-Reparatur-Aktivität. Es lohnt sich, feststellend, dass ineffiziente Vernetzung des Proteins auf dem Plasmid führt zu einer erhöhten Background-Wert. Dies wird dargestellt in den Beispieldaten in Tabelle 1 b wo ineffizient Protein-DNA-Vernetzung in einem höheren Delta CT Wert mal 0 führte zur Verfügung gestellt. Experimente sind daher ausnahmslos durchgeführt vor dem einleiten Transfektionen und Substrate mit Delta-CT-Werte erhaben über die 0,8 Schwellenwert werden verworfen. Wie in der qPCR-Protokoll erwähnt, gliedert sich jede Probe in 3 Vertiefungen Pipettieren Konsistenz sicherzustellen. Diese Wiederholungen werden dann gemittelt, um den CT-Wert für diese Probe zu erhalten. Repliziert, dass abweichen mehr als ± 0,1 aus dem Datensatz eliminiert werden. Wenn alle drei Wiederholungen mehr als ± 0,1 voneinander abweichen, ist die SSPE-qPCR-Assay erneuert, bis konsistente Werte erreicht sind. Die Erfahrung zeigt, dass mindestens 3 unabhängige Transfektionen müssen durchgeführt werden, um zuverlässige Mittelwerte zu erhalten, die dann statistische Analysen zu den Einfluss verschiedener Parameter auf DPC Reparatur Effizienz bestimmen unterworfen werden können. Abbildung 1: Generation von einem DPC-haltigen Plasmid. (A) ein Oligonukleotid mit einer 8-Oxo-Guanin-Rückstände (rot) ist geglüht einzelsträngiger DNA (Fett schwarzer Kreis) und erweitert um doppelsträngigen Plasmid (Grundierung Erweiterungsprodukt durch gestrichelte Linie angegeben) zu erstellen. Nach Elektrophorese in Interkalation Bromid ist die Band entsprechend supercoiled DNA (rot markiert) aus einem Low-Melt Agarosegel ausgeschnitten und verdaut mit β-Agarase. Bahnen: Molekulargewicht (1) (2) einzelsträngige DNA-Marker (3) doppelsträngige DNA, (4) Grundierung erweiterte Probe. (B) Oxoguanine Glycosylase (abgekürzt hOGG1, als ein orangefarbener Kreis dargestellt) ist vernetzt auf der 8-Oxo-Guanin-Rückstand über Natrium-Cyanoborohydride und das daraus resultierende DPC Substrat verdaut 2.800 Basenpaare, freie DNA-Fragment und ein 4.400 generieren Basenpaar Fragment an das Protein angebracht. SDS ist der Probe hinzugefügt, die dann in zwei Teile unterteilt ist, von denen mit KCl behandelt und zentrifugiert, Sediment DPC-haltigen DNA (dargestellt als eine orange Pellet). Der Überstand von diesem letzteren Beispiel (dargestellt als blaue Flüssigkeit in Zentrifugenröhrchen) und der Probe nicht ausgesetzt, KCl werden Gelelektrophorese unterzogen. Bahnen: (1) Molekulargewicht Marker, (2) -KCl, (3) + KCl. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Quantifizierung der beschädigten Plasmid über SSPE-qPCR. Plasmid DNA denaturiert und eine Grundierung, die komplementär zu den beschädigten Strang (R) geglüht und verlängert. Dieser Vorgang wird für eine Gesamtmenge von 8 Zyklen wiederholt. Mit einem beschädigten Substrat (oben) Taq Polymerase wird durch die DPC-Läsion blockiert und nicht in voller Länge Produkt Stränge produzieren. Im Gegensatz dazu wird mit einem reparierten Substrat (unten), Taq Polymerase in voller Länge Produkt Stränge, enthält die Bindungsstelle für Grundierung L. produzieren Nach 8 Zyklen Grundierung L hinzugefügt und Zyklus Schwellenwerte werden über qPCR ermittelt. Beispielergebnisse Verstärkung für beschädigte und unbeschädigte Substrate sind auf der rechten Seite illustriert, mit die rote Linie, die die DNA, die erlebte Primer Extension vor qPCR und blau repräsentieren DNA, die keine Grundierung vor qPCR erweitert wurde. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Tabelle 1A Zeit -Primer extension + Grundierung Erweiterung Δ CT Prozentuale Reparatur (2ΔCT23X 100) 3 h 23,5 21.1 2.4 66 8 h 29,4 26.5 2.9 93 Tabelle 1 b Zeit -Primer extension + Grundierung Erweiterung Δ CT Prozent Hintergrund (2ΔCT23X 100) 0 h 15.4 14.6 0,8 22 0 h 15.4 12.9 2.5 71 Tabelle 1: Berechnung Prozent reparieren mit CT-Werte generiert von SSPE-qPCR. (A) Reparatur eines Substrats, DPC-haltige transfected in Chinese Hamster Lunge Fibroblasten V79 3 h und 8 h nach Transfektion. (B) SSPE-qPCR 0 h Proben nicht in Zellen transfiziert. In einer Probe die Effizienz der Vernetzungsreaktion zwischen DNA und Oxoguanine Glycosylase war hoch (in diesem Beispiel ergab einen niedrigen CT-Deltawert), während in der Probe, die die Effizienz der Protein-Vernetzung war gering (in diesem Beispiel ergab eine relativ hohe Delta CT-Wert). Siehe Text des Vertreters Ergebnisse für Details.

Discussion

Die SSPE-qPCR-Methode bietet zahlreiche Vorteile gegenüber anderen Ansätzen durch die Untersuchung der Reparatur einer homogenen Bevölkerung mit einer einzelnen, definierten DPC-Läsion. Es ist bemerkenswert, dass neben der Steuerung der Identität des Proteins und die Art der chemischen Crosslink verwendet, um das Protein an die DNA zu verbinden, es möglich ist, leicht Sequenz Rahmen manipulieren die DPC-Läsion eingeführt. Wir haben den Einfluss auf die DPC-Reparatur von Einführung der Läsion auf entweder die Vorlage oder Codierung Strang ein Plasmid flussabwärts eine aktive Promoter Locus untersucht. Ebenso sind wir bei der Untersuchung des Einfluss auf die DPC-Reparatur von Replikation mit einem M13 Plasmid enthält einen SV40-Ursprung der Replikation in HEK293T Zellen transfiziert. Der Test beschriebenen hier direkt Maßnahmen DPC Reparatur, im Gegensatz zu anderen Strategien wie Host Zelle Reaktivierung, dass indirekt Schätzungen Aktivität²⁴^,²⁵reparieren. Darüber hinaus ist das System robust, sensibel und quantitative. Im Gegensatz zu anderen Systemen, die DPC-Entfernung zu messen, dieser Test erkennt nur vollständige Reparatur Ereignisse, d. h., es erfordert nicht nur, dass die DPC-Läsion entfernt werden, sondern, dass die Integrität der duplex DNA vollständig werden¹⁷wiederhergestellt. Und zwar deshalb, weil abasic Standorte und Kerben oder Pausen im Phosphodiester-Rückgrat den Test so effektiv wie die ursprüngliche DPC Läsion²⁹blockieren.

Während dieser Bericht konzentriert sich auf eine bestimmte Art von DPC, die von Natriumborhydrid Trapping von einer Enzymreaktion Mittelstufe erstellt wurde, entwickeln wir derzeit Ansätze zur Reparatur der DPCs mit anderen Proteinen und Läsionen in der Studie die Protein-Bindung an die DNA erfolgt durch die Nukleosid-Basis, anstatt die Ribose-Position. Mit reduktive Aminierung, schufen wir Proteine und Peptide vernetzt am Guanin oder Cytosin Basis einer DNA-Primer-³⁰. Diese Oligonukleotide wurden gereinigt, Homogenität und zur Erzeugung von supercoiled DNA-Protein und DNA-Peptid Querverbindungen mit Plasmiden. Während die Effizienz dieser Reaktionen im Verhältnis zu dem oben ausführlich beschriebene Oxoguanine Glycosylase Crosslink Ansatz etwas reduziert wird, sie waren jedoch erfolgreich und ermöglichen die Prüfung der Reparatur dieser Substrate in Wildtyp und Nukleotid Exzision Reparatur-defizienten Säugetieren Zelllinien. Wir haben die SSPE-qPCR-Assay genutzt, um die Reparatur von Oxoguanine Läsionen und eine synthetische Ribose-Cholesterin-Konjugat, die bisher gezeigt wurde, über die zelluläre Nukleotid Exzision Reparatur Maschinen³¹repariert werden zu untersuchen. Wie Abbildung 2 grafisch zeigt, reparieren Sie jede Läsion, dass Blöcke Grundierung Erweiterung von Taq Polymerase im Prinzip mit SSPE-qPCR-Assay gemessen werden kann.

Aktuelle Modelle der DPC Reparatur legen nahe, dass größere DPCs (> 10 kDa) proteolytische Verarbeitung zu kleineren Peptid-Läsion vor Entfernung³²^,³³^,³⁴ausgesetzt sind. Verantwortlich für diese Proteolyse wahrscheinlichste Kandidaten sind das Proteasom oder eine spezifische Protease in menschlichen Zellen namens Spartan²⁰^,²¹^,³⁵^,³⁶^,³⁷^, ³⁸. weitere Untersuchungen über die Rollen von diese Proteasen mit der SSPE-qPCR-Test durchgeführt werden können. Proteasom-Inhibitoren könnte verwendet werden, um die Zellen vor Transfektion mit DPC-haltige Untergründe vorbehandeln. Alternativ könnte Spartan Knockdown Zelllinien mit beschädigten Plasmide, seine Rolle bei der Proteolyse von größeren DPCs aufzuklären transfiziert werden.

Unabhängig von der Methode verwendet, um die Crosslink zu erstellen oder die Natur der DNA-Läsion ist es hervorzuheben, dass die SSPE-qPCR-Methodik entscheidend von der Fähigkeit ist, erhebliche Mengen an homogenen DPC-Plasmid Substrat zu erzeugen. Schritte notwendig, für diese Analyse gehören Reinigung der kovalent, geschlossen-kreisförmigen Plasmid nach Grundierung Ausdehnung um irgendwelche geklaut zu beseitigen oder linear Plasmid Moleküle. Diese Verunreinigungen müssen beseitigt werden, um sicherzustellen, dass Nachbesserung DPC beobachtet unter der Regie von Nick oder Doppel-Strang unter der Regie von Pause Reparaturprozesse nicht zusteht. Mißerfolg, ausreichende Mengen von supercoiled DNA nach Grundierung Erweiterung Reaktionen erhielt kann überwunden werden, durch das Verhältnis von Oligonukleotid-einzelsträngige DNA Variation. Ein weiterer wichtiger Schritt für die SSPE-qPCR-Methode ist die Vernetzungseffizienz des Proteins, das Plasmid. In dieser Studie wurde eine effiziente, enzymatische Reaktion verwendet, Crosslink Oxoguanine Glycosylase Protein, ein 8-Oxo-Guanin-Läsion. Sub-optimale Vernetzung kann verbessert werden, indem man die Menge des Proteins hinzugefügt, um die Reaktion.

Während die Ergebnisse in diesem Bericht beschriebenen verlassen sich auf Lipofektion, DPC Reparatur Substrate in Empfängerzellen einzuführen, es gibt keinen Grund, a-priori, andere Transfektionen Methoden nicht eingesetzt werden konnte. Wir haben Voruntersuchungen durchgeführt und festgestellt, dass Elektroporation³⁹ auch genutzt werden kann. Aber es ist erwähnenswert, dass nach unserer Erfahrung, Elektroporation Transfection Leistungsfähigkeit sinkt im Vergleich zu Lipofektion und fanden wir es notwendig Träger DNA (bis zu 5 µg) zusätzlich zu den 1,5 µg DPC Substrat verwenden, um Reparaturdaten zu erhalten. Insgesamt bietet die oben beschriebene SSPE-qPCR-Methode eine innovative Möglichkeit, ausschließlich DPC Reparatur auf Plasmid DNA zu untersuchen und neue Einblicke in die DNA-Schäden-Reaktion zu erzeugen.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (ES023350) finanziert. Lisa Chesner unterstützt Ausbildung Grant 5T32HL007741. Wir danken Natalia Tretyakova (University of Minnesota) und Ashis Basu (University of Connecticut) und ihre Lab-Mitglieder für die Unterstützung und Beratung während des frühen und Zwischenstufen dieser Arbeit.

Materials

8-oxoguanine modified oligo	Midland Certified Reagent Company	NA	Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’
T4 PNK	NEB	M0201S
Single-stranded M13	NEB	N4040S
Taq polymerase	NEB	M0267L
ATP, 100mM	Thermo Scientific	R0441
dNTP Mix, 10mM each	Thermo Scientific	R0192
BSA	NEB	B9001S
T4 polymerase	NEB	M0203L
T4 ligase	NEB	M0202L
β-agarase	NEB	M0392S
Oxoguanine glycosylase 1	NEB	M0241S
SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4309155	green PCR master mix
Primer R	UMN Genomic Center	NA	5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’
Primer L	UMN Genomic Center	NA	5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’
Lipofectamine Reagent	Invitrogen	18324-012	transfection reagent
BspD1	NEB	R0557S
NEB buffer 2	NEB	B7002S
StepOnePlus Real Time PCR System	Applied Biosystems	4376600
UltraPure Buffer-Saturated Phenol	Invitrogen	15513-047
Chloroform, reagent ACS, spectro grade	ACROS	40463-5000

Referanslar

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DNA-protein Crosslinks Plasmid DNA Mammalian Cells DNA Repair Trans-Pacific Primer Extension QPCR Assay Adducts Polymerase Blocking House Cell Reactivation 8-oxoguanine T4 Polynucleotide Kinase Primer Extension Phenol-chloroform Extraction

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Chesner, L. N., Campbell, C. A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (133), e57413, doi:10.3791/57413 (2018).