Prueba el papel de Multicopy plásmidos en la evolución de resistencia a los antibióticos

Resistencia a los antibióticos en las bacterias es un problema de salud importante¹. A un nivel fundamental, la propagación de la resistencia a los antibióticos en bacterias patógenas es un simple ejemplo de la evolución por selección natural^2,3. En pocas palabras, el uso de antibióticos genera selección de cepas resistentes. Un problema fundamental en biología evolutiva, por lo tanto, es entender los factores que influyen en la capacidad de las poblaciones bacterianas para evolucionar la resistencia a los antibióticos. Experimentos de selección se han convertido en una herramienta muy poderosa para investigar la biología evolutiva de bacterias, y este campo ha producido penetraciones increíbles en una amplia gama de problemas evolutivos^4,5,6. En la evolución experimental, poblaciones bacterianas desde una única cepa parental son pasadas en serie bajo condiciones definidas y muy controladas. Algunas de las mutaciones que se producen durante el crecimiento de estas culturas aumentan fitness bacteriano, y éstos se propagación a través de las culturas por la selección natural. Durante el experimento, las muestras de las poblaciones se conservan criogénicamente periódicamente para crear un registro fósil congelado no evoluciona. Un gran número de métodos puede utilizarse para caracterizar la evolución de las poblaciones bacterianas, pero los dos métodos más comunes son los ensayos de aptitud, que miden la capacidad de las bacterias evolucionadas para competir contra sus antepasados lejanos y secuenciación del genoma entero, que es utiliza para identificar los cambios genéticos adaptación de la unidad. Siguiendo el trabajo pionero de Richard Lenski y colegas^7,8, el enfoque estándar en evolución experimental ha sido desafiar un número relativamente pequeño de las poblaciones de replicar (típicamente < 10) con adaptación a un nuevo desafío ambiental, tales como nuevas fuentes de carbono, temperatura o un depredador fago.

Infecciones causadas por bacterias resistentes a los antibióticos se convierten en un gran problema cuando la resistencia es lo suficientemente alta como para que no es posible aumentar las concentraciones de antibióticos a niveles letales en los tejidos del paciente. Los médicos por lo tanto están interesados en lo que permite que las bacterias desarrollar resistencia a las altas dosis de antibióticos que están por encima de esta concentración antibiótico de umbral, el punto de corte clínico. ¿Cómo estudiar esto experimentalmente? Si un pequeño número de las poblaciones bacterianas se desafió con una alta dosis de antibiótico, como en un estilo de Lenski experimento, el resultado más probable es que el antibiótico todas las poblaciones conduce a la extinción. Al mismo tiempo, si la dosis de antibiótico que se utiliza es baja, por debajo de la concentración inhibitoria mínima (CIM) de la cepa parental, entonces es poco probable que las poblaciones bacterianas evolucionará clínicamente relevantes niveles de resistencia, especialmente si resistencia lleva un costo grande. Un compromiso entre estos dos escenarios es utilizar un “rescate evolutivo” experimento^9,10,11. En este enfoque, un gran número de culturas (por lo general > 40) es desafiado con dosis de antibióticos, que aumentan con el tiempo, por lo general duplicando la concentración de antibiótico cada día¹². El sello de este experimento es que cualquier población que desarrollan mayor resistencia será conducido a la extinción. Mayoría de las poblaciones que se enfrentan de esta manera se impulsará extinto, pero una pequeña minoría persistirá por altos niveles de resistencia en evolución. En este artículo mostramos cómo este diseño experimental se puede utilizar para investigar la contribución de multicopy plásmido a la evolución de la resistencia.

Las bacterias adquieren resistencia a los antibióticos a través de dos rutas principales, las mutaciones cromosómicas y adquisición de elementos genéticos móviles, mayormente plásmidos¹³. Plásmidos desempeñan un papel clave en la evolución de resistencia a los antibióticos porque son capaces de transferir genes de resistencia entre las bacterias por conjugación^14,15. Plásmidos pueden dividirse en dos grupos según su tamaño y Biología: “pequeño”, con número de alta copia por célula bacteriana y “grande”, con baja copia número^16,17. El papel de grandes plásmidos en la evolución de resistencia a los antibióticos ha sido ampliamente documentado porque incluyen plásmidos conjugativos, que son motores principales de la difusión de la resistencia y la multi resistencia entre bacterias¹⁵. Los plásmidos multicopy pequeños también son muy comunes en las bacterias^17,18, y a menudo codifican genes de resistencia a los antibióticos¹⁹. Sin embargo, se ha estudiado el papel de los plásmidos multicopy pequeños en la evolución de resistencia a antibióticos en menor medida.

En un trabajo reciente, hemos propuesto que los plásmidos multicopy podrían acelerar la evolución de los genes que llevan por aumento de las tasas de mutación de gen debido al número más alto de la copia del gene por célula de¹². Utilizando un modelo experimental con e. coli tensión MG1655 y la β-lactamasa gen bla_TEM-1 se ha demostrado que plásmidos multicopy aceleraron la tasa de aparición de mutaciones de TEM-1 que confiere resistencia a la tercera generación cefalosporinas ceftazidima. Estos resultados indicaron que los plásmidos multicopy podrían desempeñar un papel importante en la evolución de resistencia a los antibióticos.

Aquí, presentamos una descripción detallada del método que hemos desarrollado para investigar la evolución multicopy mediada por plásmidos de resistencia a los antibióticos. Este método tiene tres etapas: primera, inserción del gen en estudio o en un plásmido de multicopy o en el cromosoma de la bacteria huésped. En segundo lugar, el uso de evolución experimental (rescate evolutivo) para evaluar el potencial de las cepas diferentes para adaptarse a la presión selectiva. Y en tercer lugar, determinar la base molecular subyacente evolución mediada por plásmido con ADN secuenciación y reconstruyendo las mutaciones sospecha individualmente en el genotipo de los padres.

Por último, aunque el protocolo descrito aquí fue diseñado para investigar la evolución de la resistencia a los antibióticos, se puede argumentar que este método podría ser generalmente útil analizar la evolución de las innovaciones adquiridas por las mutaciones en cualquier MultiCopia genes codificados por el plásmido.