JoVE Journal > Developmental Biology
Özet
Abstract
Introduction
Protocol
Sonuçlar
Discussion
Açıklamalar
Acknowledgements
Materials
Referanslar
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Gelişim Biyolojisi

In Vivo Beeldvorming van de spier-pees morfogenese in Drosophila poppen

Published: February 06, 2018
doi:
10.3791/57312
,
1Muscle Dynamics Group,Max Planck Institute of Biochemistry, 2Aix Marseille University,CNRS, IBDM

Özet

Hier presenteren we een easy-to-use en veelzijdige methode om uit te voeren levende beeldvorming van ontwikkelings processen in algemene en spier-pees genuitdrukking met name in levende Drosophila poppen.

Abstract

Samen met de pezen en het skelet spieren in staat stellen dieren inclusief de mens om te verplaatsen van hun lichaamsdelen. Spier morfogenese is het zeer behouden van dieren op de mens. Dus, de krachtige Drosophila modelsysteem kan worden gebruikt om te bestuderen van de concepten van de spier-pees-ontwikkeling die ook kan worden toegepast op menselijke spier biologie. Hier beschrijven we in detail hoe morfogenese van het volwassen spier-pees-systeem in het leven, gemakkelijk kan worden beeld ontwikkelen van Drosophila poppen. Vandaar, de methode kunt onderzoeken eiwitten, cellen en weefsels in hun fysiologische omgeving. Naast een stapsgewijze protocol met nuttige tips bieden wij een uitgebreid overzicht van fluorescently tagged marker eiwitten die geschikt zijn voor het bestuderen van de spier-pees-systeem. Nadruk wordt gelegd op de veelzijdige toepassingen van het protocol, laten we zien in het volgende voorbeeld films variërend van visualisatie van langetermijn morfogenetische gebeurtenissen – die zich voordoen op de tijdschaal van uren en dagen – naar visualisatie van korte dynamische processen zoals spier twitching voorkomende op tijdschaal seconden. Samen genomen, dit protocol moet in staat stellen de lezer te ontwerpen en uitvoeren van live-imaging experimenten voor het onderzoeken van de spier-pees morfogenese in het intact organisme.

Introduction

De spier-pees-apparaat kunt dieren inclusief de mens om te verplaatsen van hun lichaamsdelen. De moleculaire bouwstenen van de spier-pees-systeem zijn zeer bewaard. Daarom, concepten van spier-pees ontwikkeling relevant voor menselijke spier biologie, bijvoorbeeld morfogenese van de spier, spier-pees gehechtheid en myofibril zelforganisatie, kunnen worden bestudeerd met behulp van Drosophila melanogaster als een gemakkelijk toegankelijk modelsysteem. De pop systeem van Drosophila heeft verschillende experimentele voordelen. Ten eerste, aan de popstadium – wanneer de volwassen spieren worden gevormd – het organisme is sessiele en daarom gemakkelijk om het imago op een Microscoop over een periode van uren of zelfs dagen. Ten tweede, veel spieren formulier dicht genoeg onder de pop oppervlak zodat ze kunnen worden beeld binnen het organisme intact, gedeeltelijk doorschijnende. Ten derde kunnen de spieren in hun natuurlijke omgeving, waar ze zijn aangesloten op de vormende exoskelet via pees cellen en weefsel spanning wordt opgebouwd worden onderzocht. Dit is niet mogelijk in spier cel cultuur systemen. En tot slot een overvloed van genetische hulpmiddelen is beschikbaar in Drosophila. Onder deze zijn veel fluorescently tagged markers waarmee etikettering van specifieke celtypes of subcellular structuren voor in vivoimaging.

Tabel 1 geeft een overzicht van de belangrijkste merkers gebruikt voor de studie van de spier-pees morfogenese. Het omvat markeringen overexpressie met behulp van de GAL4-UAS-systeem1 en endogeen gecodeerde eiwit markeringen,2,,3,4. Het voordeel van het GAL4-UAS-systeem is dat de markeringen in het algemeen op een hoog niveau, wat resulteert in een krachtig signaal dat kan gemakkelijk worden beeld in geheel-mount poppen worden uitgedrukt. Daarnaast kan weefsel specificiteit worden bereikt door het GAL4 stuurprogramma’s zorgvuldig te kiezen. Het voordeel van de fusie-eiwitten uitgedrukt onder endogene controle is dat de dynamiek van de respectieve eiwitten bestudeerd in vivo, worden kan terwijl ze kunnen ook worden gebruikt als markeringen voor verschillende soorten cellen of specifieke subcellular structuren, bijvoorbeeld ΒPS-integrine-GFP voor spier bijlage sites. Samen bieden deze markers hoge flexibiliteit in de proefopzet en keuze van onderzoek-problemen die kunnen worden opgelost nu en in de toekomst.

Gelabelde structuur Marker Expressie en localisatie Klasse Voorraadnummer Commentaar Ref.
Spier Mef2-GAL4 alle myoblasts en alle spieren in alle stadia GAL4 lijn BL 27390 5
1151-GAL4 volwassen spier precursoren en vroege myotubes tot ≈24 h APF GAL4 lijn, versterker trap – 6
Act79B-GAL4 springen van de spier op differentiatie GAL4 lijn – 7
Act88F-GAL4 indirecte vlucht spieren beginnen ≈14 h APF GAL4 lijn – 7
Act88F– Cameleon 3.1 indirecte vlucht spieren beginnen ≈14 h APF Act88F versterker / promotor rijden Cameleon 3.1 – CA2 + indicator 8
Act88F-GFP indirecte vlucht spieren beginnen ≈14 h APF GFP-fusion (vlieg TransgeneOme lijn) fTRG78 en fTRG10028 4
Hem– nls-GFP volwassen spier precursoren, kernenergie, tot ≈24 h APF in indirecte vlucht spieren versterker/promotor met nls-GFP verslaggever – 1.5 kb enhancer fragment 9
MHC-Tau-GFP microtubuli in de DLM sjablonen en differentiëren van de spieren versterker/promotor met Tau-GFP verslaggever BL 53739 10
ΒTub60D-GFP microtubuli in myotubes (bv. in indirecte vlucht spieren van ≈14 h AFP, sterk afneemt na ≈48 h APF) GFP-fusion (vlieg TransgeneOme lijn) fTRG958 4
MHC-GFP (weeP26) sarcomeres (dikke gloeidraad) in alle lichaamsspieren (bv. in indirecte vlucht spieren vanaf ≈30 h APF) GFP-trap – gebruik heterozygoot, etiketten van een deelverzameling van de isovorm 11
SLS-GFP sarcomeres (Z-disc) in alle lichaamsspieren (bv. in indirecte vlucht spieren vanaf ≈30 h APF) GFP-val (FlyTrap lijn) – G53, gebruik heterozygoot 2
Zasp66-GFP Z-disc in alle lichaamsspieren GFP-val (FlyTrap lijn) BL 6824 ZCL0663 2 , 12
Zasp52-GFP Z-disc in alle lichaamsspieren GFP-val (FlyTrap lijn) BL 6838 G00189 2 , 12
HTS-GFP actin bindend; uitgedrukt in epitheel, myoblasts en myotubes GFP-fusion (vlieg TransgeneOme lijn) fTRG585 4
Dlg1-GFP epitheliale cel kruispunten, myoblasts en membranen in spieren in alle stadia GFP-fusion (vlieg TransgeneOme lijn) fTRG502 4
Spier bijlage site ΒPS-integrine-GFP spier bijlage sites (bijvoorbeeld startende ≈18 h AFP in indirecte vlucht spieren) GFP-knock-in – 13
Talin-GFP en -mCherry spier bijlage sites (bijvoorbeeld startende ≈18 h AFP in indirecte vlucht spieren) GFP-val (MiMIC lijn) – 3
Talin-GFP spier bijlage sites (bijvoorbeeld startende ≈18 h AFP in indirecte vlucht spieren) GFP-fusion (vlieg TransgeneOme lijn) fTRG587 4
Ilk-GFP spier bijlage sites (bijvoorbeeld startende ≈18 h AFP in indirecte vlucht spieren) GFP-val (FlyTrap lijn) Kyoto 110951 (ZCL3111) ZCL3111, ZCL3192 2
Vinc-GFP en -RFP spier bijlage sites (bijvoorbeeld startende ≈18 h AFP in indirecte vlucht spieren) GFP-fusion (transgenic) – 13
Pees SR-GAL4 thorax pees cellen, in de hele popstadium GAL4 lijn, versterker trap BL 26663 Homozygoot dodelijk 14
Spier en pees DUF-GAL4 spieren en het epitheel, vroege begin GAL4 lijn BL 66682 kirre-rP298, oprichter cel marker 15
UAS-verslaggevers UAS– GFP-Gma actin bindende UAS lijn BL 31776 actin bindend domein van Moesin gesmolten tot GFP 16
UAS– mCherry-Gma actin bindende UAS lijn – GMA gesmolten tot mCherry 17
UAS- Lifeact-GFP actin bindende UAS lijn BL 35544 18
UAS– Lifeact-Ruby actin bindende UAS lijn BL 35545 18
UAS-CD8-GFP membraan bindende UAS lijn verschillende bestanden, bijvoorbeeld: BL 32184 19
UAS-CD8-mCherry membraan bindende UAS lijn BL 27391 en 27392 20
UAS-palm-mCherry membraan bindende via palmitoylation UAS lijn BL 34514 UAS– zwHANSje 21

Tabel 1: Fluorescently geëtiketteerde eiwit markers geschikt voor studeren spier-pees morfogenese in vivo.

Hier beschrijven we in detail hoe beeldvorming van de spier-pees morfogenese in levende poppen gemakkelijk en met succes kan worden uitgevoerd (Figuur 1). Als alternatief kunnen de poppen worden vastgesteld, ontleed en immunostained, waarmee met behulp van antilichamen om ook label eiwitten waarvoor geen live markeringen zijn beschikbaar22. In dit geval is de beeldvorming kwaliteit is over het algemeen hoger, want er geen verkeer bestaat en de structuur van belang kan worden geplaatst in de nabijheid van het dekglaasje aan. Echter dissectie en fixatie kunnen leiden tot schade en moleculaire of weefsel dynamiek, bijvoorbeeld, spier twitching, kan alleen worden bestudeerd in het levende organisme.

Protocol

1. stage poppen Instellen van een kruis met de Maagd vrouwen van 20-40 en ongeveer 20 mannen per fles van vliegen voedsel (figuur 1A). Als alternatief, indien aandelen zal worden gebruikt, spiegelen elk aandeel in nieuwe flessen. Als u genoeg poppen, stel twee flessen per genotype. Incubeer de flessen bij 25 ° C (of 27 ° C volgens de proefopzet) gedurende vijf tot zes dagen (figuur 1B).Opmerking: Houd de vliegen elke twee of drie dagen wegknippen om te voorkomen dat overbevolking en te zorgen voor een continue aanvoer van poppen. Gebruik een natte penseel wilt verzamelen van witte prepupae van de wanden van de flessen en hen overbrengen in de glazen dia’s (Figuur 1 c). De enscenering tijd zodanig dat de poppen de gewenste bereiken leeftijd bij het starten van levende imaging onder de Microscoop.Opmerking: Deze prepupae uitzien als oudere poppen in termen van hun vorm, maar ze zijn nog steeds wit als larven. Het begin van de prepupal fase is gedefinieerd als 0 h na puparium formatie (0 h APF). Verwijderen van de bosjes van vliegen voedsel vasthouden aan de poppen met een natte penseel en oriënteren van de ventrale zijde van de poppen naar de glasplaatje met een stereomicroscoop (Figuur 1 d). Negeren van poppen die zijn nog steeds (te jong) of die beginnen te verkleuren en worden bruin (te oud). Dit zorgt ervoor dat alle poppen dezelfde leeftijd (0 – 1 h APF hebben). Label de dia’s met genotype, datum en tijdstip van de winning. De glazen dia’s overbrengen in een petrischaal elke en voeg een vochtige tissues om te voorkomen dat de poppen (figuur 1E) uitdrogen. Bewaar de poppen in een incubator bij 25 ° C of 27 ° C tot ze de gewenste leeftijd bereiken. Verder met de volgende stappen 1 h voor imaging, zodat de poppen de gewenste hebben leeftijd bij het starten van levende imaging (stap 3), bijvoorbeeld om 13u APF voor de film getoond in figuur 2A-D.Opmerking: De vroegste haalbaar tijd uitgangspunt is na hoofd-eversie van de poppen die zich voordoen bij 8-10 h APF bij 27 ° C. 2. poppen voorbereiden door Imaging Zorg ervoor dat de poppen nu aan het glasplaatje vasthouden net als ze natuurlijk aan de muren van de flessen vanwege residuele vliegen voedsel vasthouden. Geen extra lijm is vereist. Als de poppen niet goed genoeg vanwege de hoge luchtvochtigheid vasthouden doen, open de petrischaal gedurende een paar minuten te laat ze drogen. U kunt ook overbrengen naar dubbelzijdige tape op een glasplaatje, maar dit is meestal niet nodig. Open venster in pop bij beeldvorming van de indirecte vlucht spieren (Figuur 1F; Ga naar sectie 2.3 voor beeldvorming van de buikspieren). De poppen die vasthouden aan het glasplaatje met de anterior naar beneden uit de buurt van de onderzoeker ontvangt krachtens een stereomicroscoop oriënteren. Aanpassen-of uitzoomen tot 2 X. Met behulp van één uiteinde van de biologie rang #5 pincet, zachtjes steken een gat in de pop behuizing dorsale is aan de vleugel waar de buik eindigt, en de thorax begint. Om te slice open het pop geval, zachtjes de verlostang verplaatsen naar de voorste eind van de thorax langs de vleugel maar te voorkomen beschadiging van het weefsel van de kwetsbare vleugel.Opmerking: Als vloeistof uit de verpopping lekt, het beschadigd is; verwijderen en opnieuw te beginnen met een verschillende Verpopping. De sectie van de pop zaak boven de thorax verheffen met de pincet en vervolgens afgesneden deze sectie met een fijne, scherpe schaar aan de andere kant van de dorsale middellijn. Open venster in pop bij beeldvorming van de buikspieren aan te spannen (Figuur 1G) De poppen die vasthouden aan het glasplaatje met de anterior naar beneden richting de onderzoeker ontvangt krachtens een stereomicroscoop oriënteren. Aanpassen-of uitzoomen tot 2 X. Met behulp van één uiteinde van de biologie rang #5 pincet, zachtjes steken een gat in de pop behuizing dorsale is aan de vleugel waar de thorax eindigt, en de buik begint. Om te slice open het pop geval, zachtjes bewegen de verlostang posterieure eind van de buik.Opmerking: Als vloeistof uit de verpopping lekt, het beschadigd is; verwijderen en opnieuw te beginnen met een verschillende Verpopping. De sectie van de pop zaak boven de buik verheffen met de pincet en vervolgens afgesneden deze sectie met een fijne, scherpe schaar aan de andere kant van de dorsale middellijn. Mount poppen (Figuur 1 H) Gebruik een natte penseel maximaal vijf poppen overbrengen naar een kunststof dia met een groef (custom-built, herbruikbare, zie discussie en materiaallijst). Voeg één of twee spacer coverslips aan weerskanten afhankelijk van de diepte van de groef en de dikte van de poppen. Zet een kleine druppel water onder elke spacer dekglaasje aan om het vasthouden aan de dia en laat wat ruimte tussen de groef en de spacer coverslips aan elke kant te maken.Opmerking: De spacer coverslips kan ook worden permanent aangesloten op de dia met superlijm, vooraf. Oriënteren de poppen zodanig zijn dat de opening in het geval van pop gezichten naar boven met behulp van het penseel. Zorgen voor nauwkeurige positionering van de poppen op de juiste hoek voor goede kwaliteit van de beeldvorming. Optimaliseren van de hoek voor elk weefsel en ontwikkelingsstoornissen tijdstip.Opmerking: Een kleine hoeveelheid water in de groef maakt de positionering van de poppen gemakkelijker. Afvoer van overtollig water met de borstel daarna om te voorkomen dat verdrinking. Houd een dekglaasje aan (18 x 18 mm) boven de poppen zonder ze aan te raken. Kleine druppels (ongeveer 0.5 µL) van 50% glycerol oplossing boven elk pop geval openen op het dekglaasje aan met behulp van een precisiepipet 20 µL plaats.Opmerking: Deze procedure zorgt ervoor dat de druppels de dezelfde afstand als de poppen. Het dekglaasje aan omdraaien en plaats het boven de poppen met de hand of met behulp van pincet (standaard #5) tijdens het rusten een kant van het dekglaasje aan op de spacer coverslips naast de poppen. Vervolgens dalen zachtjes het dekglaasje aan op de poppen. Zorg ervoor dat de pop zaak openingen goed zijn bedekt met 50% glycerol voor goede kwaliteit van de beeldvorming en om te voorkomen dat de poppen uitdrogen. Vouw meer dan één uiteinde van een stukje plakband en pak het met een tang (standaard #5) aan dat einde. Voorzichtig plaats de band zodanig dat het een van de randen van de bovenste dekglaasje aan, de spacer coverslip(s), en de plastic dia aan de ene kant wordt bedekt. Druk niet op neer de cassette nog. Ten eerste, de dia omdraaien en herhaal voor de andere kant. Gebruik beide wijsvinger om de tape gelijktijdig ingedrukt aan beide zijden. Deze procedure zorgt ervoor dat de poppen niet zijn ontheemd. Controleer of de poppen zijn goed in contact met het dekglaasje aan. Voor optimale kwaliteit van de beeldvorming moeten de poppen voorzichtig worden geperst onder het dekglaasje aan. Pas het aantal spacer coverslips indien nodig. Label de dia door te schrijven op de plakband. 3. live Imaging voor poppen De montage methode kunt beeldvorming van de poppen op omgekeerde microscopen (figuur 1I) zowel op rechtop microscopen (figuur 1J). Met name geschikt voor levende imaging scant confocal microscopen, twee-foton microscopen en draaiende schijf confocal microscopen ongeacht of ze worden omgekeerd of rechtop. Gebruik voor lange films, een temperatuurgevoelig stadium indien beschikbaar. Met behulp van het oculair en een UV-lamp of transmissie licht, zoek een Verpopping en focus binnen de verpopping. Met behulp van de camera, het vinden van de gewenste structuur en het zoomniveau aanpassen. Voor lange films, het definiëren van een z-stack die de structuur van belang goed (bijvoorbeeld de indirecte vlucht spieren, hun plaatsen van de bijlage, de cellen van de pees of een combinatie van de bovengenoemde omvat) en kies een tijdsinterval. Overwegen te doen gemiddeld voor een betere beeldkwaliteit. Kies voor snelle, korte films, een enkel z-vliegtuig te bereiken een hoge framesnelheid. De kracht van de laser te geven het beste mogelijke signaal maar weinig verzadiging aanpassen. Echter kan te hoog laser macht schade aan de verpopping na verloop van tijd. Start van beeldvorming en terug van tijd tot tijd te controleren van de film en passen de z-stack positionering indien nodig. Figuur 1: Workflow voor live beeldvorming van spier-pees morfogenese in Drosophila poppen. Zie protocol voor meer informatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Representative Results

Verschillende weefsels kunnen verbeelde in vivo bij de ontwikkeling van vliegen poppen, waardoor ze een ideaal modelsysteem te bestuderen van de morfogenese van volwassen organen. Onder deze zijn de indirecte vlucht spieren, het epitheel van de thorax met inbegrip van de pees-cellen, de vleugel epitheel, buikspieren en de hart22,23,24,25,26 , 27. hier, wij richten ons op levende beeldvorming van spier en pees morfogenese. Voor een gedetailleerde beschrijving van de indirecte vlucht spier en buikspier genuitdrukking en aanvullende methoden voor de studie van biologie van de spier in Drosophila, verwijzen we de lezer door naar Weitkunat en Schnorrer 201422. Live imaging van indirecte vlucht spieren Voor het bestuderen van werd de langetermijnontwikkeling van de spieren van de indirecte vlucht uit de dorsolongitudinal spieren (DLM) en de dorsoventral spieren (DVMs), bolvormige Moesin actine-bindend domein gelabeld met GFP (UAS -GFP-Gma) uitgedrukt in alle spieren met behulp van de Myocyte versterker factor 2 (Mef2)-GAL4-stuurprogramma (figuur 2A-D, Film S1). Vóór imaging, werd een venster in de pop geval geopend boven de thorax, zoals weergegeven in figuur 1F. Op een twee-foton microscoop, werden z-stacks verworven elke 20 min. voor 21 h basisgewicht van ≈11 h na puparium formatie (11 h APF). In deze periode, het DLMs (groene overlays in figuur 2A’-D’) eerst initiëren gehechtheid aan de pees cellen (figuur 2A) en vervolgens gesplitst, terwijl de bijlagen spier oudere (figuur 2B). Vervolgens verkorten de myotubes (figuur 2C) tot ze eindelijk het maximaal gecomprimeerde stadium 30u APF (figuur 2D). Samen genomen, belicht deze film de ingrijpende veranderingen in de morfologie van de spieren die zich op de tijdschaal van uren voordoen. Figuur 2: Live beeldvorming van indirecte vlucht spier en pees morfogenese. (A-D) Tijd van punten uit een twee-foton-film (film S1) met behulp van Mef2-GAL4, UAS- GFP-Gma als merkstof voor actine in de spieren van de indirecte vlucht bestaande uit de dorsolongitudinal spieren (DLM, gemarkeerd in het groen in A’-D’) en de dorsoventral spieren ( DVMs, gemarkeerd in blauw in A’-D’). Schaal bars zijn 100 µm. (E-H) tijdstippen uit een twee-foton-film (film S2) met behulp van Duf-GAL4UAS-CD8-GFP als merkstof voor indirecte vlucht spieren en het epitheel van de thorax met inbegrip van de pees cellen. Panelen E “-H” een overlay met een model van de spier-pees-systeem weergeven op elk tijdstip, benadrukken de lange cellulaire extensies gevormd door de pees epitheel (magenta) in contact met de spieren (groen). Schaal bars zijn 100 µm (naar schatting van de grootte van de structuren van de verbeelde). (Ik-L) Tijd punten uit een twee-kleur, draaiende schijf confocal film (film S3) gericht op spier-pees bijlage inleiding. De pees cellen worden aangeduid met sr-GAL4UAS-palm-mCherry (magenta) en de indirecte dorsolongitudinal vlucht spieren met Mhc -Tau-GFP (groen). Schaal bars zijn 10 µm. tijd wordt aangeduid als uu: mm achter puparium formatie (APF). Merk op dat niet alle films werden verworven op een temperatuurgevoelig podium, daarom, developmental timing kan afwijken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Voor de studie van pees en spier morfogenese op hetzelfde moment, membraan-gebonden GFP (UAS -CD8-GFP) werd uitgedrukt met behulp van Dumbfounded (Duf)-GAL4 als een bestuurder, die zich zowel in de cellen van de pees en de indirecte vlucht spieren (figuur 2E -H, film S2). Een z-stack is genomen op een twee-foton microscoop iedere 20 min vanaf 16 h APF voor 20u. Terwijl de myotubes compact (groene overlay in figuur 2E”-H”), de pees cellen vorm lang cellulaire extensies die met tijd elongate (magenta overlay in figuur 2E’-H’). Samen genomen, benadrukt deze film de nauwe interactie tussen de pees en spier cellen in vivo. Voor het onderzoek naar de interactie van de spier-pees in meer detail, werd twee kleuren, high-vergroting imaging uitgevoerd. Poppen met myosin zware ketting (Mhc)-Tau-GFP in de DLM en UAS -palmitoylated-mCherry (UAS -palm-mCherry) gedreven door streep (sr)-GAL4 in de pezen waren beeld elke 5 min vanaf 12u APF 4.5 uur op een draaiende schijf confocal microscoop (figuur 2I-L, film S3). Bij 12 h APF migreren de myotubes naar hun doelcellen pees tijdens de vorming van de lange filopodia op hun toppen (figuur 2I). Vervolgens de spier en pees weefsels interdigitate (figuur 2J, K) vormen een stabiele bijlage. Als de bijlage rijpt, rasterbeelden minder filopodia vorm en de spier-pees-interface (Figuur 2 L). Dus, twee kleuren, high-vergroting imaging kan worden gebruikt om te onthullen van cellulaire dynamiek in detail in het levende organisme. Live imaging van buikspieren Voor live beeldvorming van de buikspieren (Figuur 3film S4), Mef2-GAL4> UAS-CD8-GFP werd gebruikt als een marker en een venster boven de buik in de pop geval als aangegeven in figuur 1Gwerd geopend. Vergelijkbaar met de indirecte vlucht spier film vertegenwoordigd in figuur 2A-D, de vorming en groei van de buikspieren kunnen worden gevolgd via vele uren van ontwikkeling (55 h in film S4). Gedurende deze tijd zekering de myoblasts aan formulier groeiende myotubes (figuur 3A). De tips van myotube migreren naar bedrijfsdoelstellingen van de pees, en nadat u hebt gekoppeld aan de cellen van de pees, de contractiele eenheden van de spieren, de sarcomeres, worden gevormd (figuur 3B-D). Figuur 3: Live beeldvorming van de buikspier morfogenese. (A-D) Tijd van punten uit een film (film S4) met behulp van Mef2-GAL4UAS-CD8-GFP als merkstof buikspier morfogenese volgen. Panelen A’-E’ Toon overlays met modellen van een buikspier set (groen) die DOVO tijdens het popstadium vormt. Schaal bars zijn 100 µm. tijd wordt aangegeven als uu: mm APF. De film werd overgenomen bij kamertemperatuur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Live beeldvorming van spiertrekkingen van spieren In tegenstelling tot Figuur 2 en Figuur 3, blijkt uit Figuur 4 spier dynamiek die zich voordoen op de tijdschaal seconden: de live-opname van spiersamentrekkingen. Poppen uiting van βPS-integrine-GFP onder endogene controle waren beeld met een resolutie van de tijd van 0,65 s in een enkel z-vliegtuig op een confocal microscoop (Film S5). In het voorbeeld is weergegeven in Figuur 4, waren de plaatsen van de bijlage van drie DVMs (figuur 4A) beeld voor 10 min vanaf 42 h APF. Gedurende deze tijd, vijf kramp evenementen werden waargenomen (figuur 4B-F), waaruit blijkt dat de sarcomeres al goed genoeg worden geassembleerd ter ondersteuning van gecoördineerde contracties op dit tijdstip in ontwikkeling. Vandaar, beeldvorming van spier twitching kan worden gebruikt als een functionele uitlezing voor sarcomerogenesis al tijdens de indirecte vlucht spier ontwikkeling28, in tegenstelling tot bijvoorbeeld de vliegproeven, die kan alleen worden uitgevoerd na eclosion. Figuur 4: Live beeldvorming van spiertrekkingen van spieren. (A) eerst tijd-punt uit een film (film S5) tonen spiertrekkingen van dorsoventral indirecte vlucht spieren bij het gebruiken van de APF 42 h βPS-integrine-GFP als een marker. Zijn de spier bijlage sites van DVM II 2, DVM III 1 en DVM III 2 in het gezichtsveld. (B-F) Kleur overlays van vijf afzonderlijke kramp evenementen, elk met het frame vóór de kramp (magenta) en het eerste frame van de kramp gebeurtenis (groen). Merk op dat de afzonderlijke spiervezels twitch onafhankelijk van elkaar. Pijlen wijzen de twitching motie. De resolutie van de tijd van de film is 0,65 s. schaal bars zijn 25 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Live imaging van endogeen tagged eiwitten Vergelijkbaar met βPS-integrine-GFP, een grote collectie van fusion eiwitten uitgedrukt in Drosophila onder endogene controle geweest gegenereerde2,3,4. Deze vliegen lijnen kunnen worden gebruikt om te studeren, bijvoorbeeld de subcellular localisatie of de expressieprofielen van proteïnen van belang. De collectie is vooral handig als specifieke antilichamen niet beschikbaar zijn of eiwit dynamiek moeten worden onderzocht in vivo zonder fixatie. Figuur 5 ziet u drie voorbeelden van endogeen uitgedrukt fusion eiwitten uit de bibliotheek TransgeneOme (fTRG) vliegen, Hu li tai shao (Hts)-GFP (figuur 5A, B), Talin-GFP (figuur 5C, D) en βTubulin60D-GFP ( Figuur 5E, F). De uitdrukking van deze eiwitten kan bestudeerd worden in alle weefsels die uitdrukking geven aan hen natuurlijk. Hier, laten we het epitheel van de thorax (figuur 5AC, E) en de indirecte vlucht spieren of hun plaatsen van de bijlage (figuur 5BD, F) als voorbeeld. Figuur 5: Live imaging van endogeen gelabeld eiwitten. (A, B) Maximale projecties van z-stacks gehouden met poppen Hts-GFP uitdrukken. (C, D) Maximale projecties van z-stacks gehouden met poppen Talin-GFP uitdrukken. (E, F) Maximale projecties van z-stacks gehouden met poppen βTubulin60D-GFP uitdrukken. Panelen-A, C en E tonen de thorax epitheel op 18, 24 en 18 h APF, respectievelijk en panelen B, D en F Toon de indirecte vlucht spieren of hun plaatsen van de bijlage bij 30 h APF. Schaal bars zijn 25 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Het gepresenteerde protocol beschrijft hoe om het imago van de spier-pees morfogenese in levende Drosophila poppen met behulp van een verscheidenheid van fluorescently tagged eiwitten. Deze in vivo imaging strategie kan worden gebruikt om ontwikkelings processen in hun natuurlijke omgeving van het hele organisme te bestuderen.

Het is van cruciaal belang voor een succesvolle experiment om te vinden van de juiste developmental tijdstip om te analyseren. Bijvoorbeeld, initiëren dorsolongitudinal indirecte vlucht spieren gehechtheid aan hun doelen van de pees op ≈16 h APF23 terwijl buikspieren later ontwikkelen en aan beide uiteinden alleen tussen 30 en 40 h APF26 hechten. Bijgevolg eerder gepubliceerde literatuur moet worden gebruikt voor het vinden van de juiste tijdstippen van ontwikkeling om te analyseren of, als het weefsel of de structuur van belang niet in detail voordat onderzocht is, de algehele ontwikkeling moet eerst worden gekenmerkt.

Voor montage poppen met succes op de op maat gemaakte kunststof dia’s, is het belangrijk dat de groeven geschikte afmetingen hebben: de noodzaak van de groeven om 1.0-1.5 mm breed en 0,3 – 0,4 mm diep. Deze diepte kan de exacte afstand tot de bovenste dekglaasje aan met spacer coverslips zo nodig aan te passen. Ten minste één spacer dekglaasje aan moet echter worden gebruikt om te voorkomen dat het aftappen van de 50% glycerol uit de buurt van het monster door capillaire krachten. De juiste positionering van de poppen in de groef vereist sommige ervaring en moet worden geoptimaliseerd, zodanig dat de structuur van belang is zo dicht mogelijk bij het dekglaasje aan.

Als een groot aantal poppen wordt verondersteld te worden beeld in één Microscoop sessie, kunnen alle worden vooraf gemonteerd en vervolgens opgeslagen in een incubator tot imaging om ervoor te zorgen de juiste developmental timing. De poppen moeten overleven de gehele procedure en ook op zijn minst proberen om eclose als op de dia na imaging gehouden. Het overlevingspercentage kan worden gebruikt als een uitlezing om te controleren of de imaging voorwaarden schadelijk voor de poppen.

De imaging instellingen moeten zorgvuldig worden gekozen volgens de experimentele eisen. Voor korte films dient een hoge framesnelheid versus een hoge signal-to-noise verhouding te worden afgewogen, terwijl relatief hoge laser macht kan worden gebruikt zonder teveel schade aan de poppen. Echter voor lange films, de kracht van de laser moet worden gehouden op een matig niveau en de poppen moeten niet continu worden beeld maar op bepaalde tijdstippen, bijvoorbeeld, iedere 20 min. Om ervoor te zorgen dat de structuur van belang niet uit het gezichtsveld verplaatst wordt, kan het nodig zijn om aan te passen de positionering van de z-stack tussen tijdstippen zijn. Om onze kennis, de opening van de pop zaak per se heeft geen invloed op ontwikkelingsstoornissen timing. Echter moet een temperatuurgevoelig stadium worden gebruikt voor lange films om juiste developmental timing. Rekening houdend met deze overwegingen, kunnen zeer informatieve films worden verworven.

De gepresenteerde protocol kan worden gebruikt om te visualiseren van niet alleen de spier-pees morfogenese, maar ook andere ontwikkelingslanden weefsels, bijvoorbeeld, de vleugel epitheel29. Slechts drie wijzigingen van dit protocol zijn verplicht: (1) opening van de pop geval boven de vleugel in plaats van de thorax of abdomen, (2) positionering van poppen met de wing richting de top dekglaasje aan, en (3) het gebruik van verschillende TL marker eiwitten. Met de vooruitgang van de CRISPR/Cas9-technologie, zal meer en meer endogeen tagged fluorescente proteïnen beschikbaar zijn, omdat het eenvoudiger om te richten van endogene loci in Drosophila30,31 is geworden , 32. in de toekomst, hierdoor kunnen ophelderen van de dynamiek van talrijke proteïnen, cellen en weefsels van de gehele in hun fysiologische omgeving in detail.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Manuela Weitkunat voor de overname van film S3. We zijn dankbaar Reinhard Fässler voor genereuze steun. Dit werk werd gesteund door de EMBO Young Investigator programma (F.S.), de European Research Council onder het zevende kaderprogramma van de Europese Unie (FP/2007-2013) / ERC Grant 310939 (F.S.), de Max-Planck-Gesellschaft (S.B.L., F.S.), het Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (F.S.), excellence initiatief Aix-Marseille Universiteit AMIDEX (F.S.), de LabEX-Informeer (F.S.) en de Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).

Materials

Stereomicroscope Leica MZ6 product has been replaced by Leica M60
fly food in bottles (or vials) – – standard culture medium
paint brush da Vinci 1526Y size 1
microscope slides Thermo Scientific VWR: 631-1303 76 x 26 mm
double-sided tape (optional) Scotch 6651263 12 mm x 6.3 m
petri dishes Greiner Bio-One 632102 94 x 16 mm
paper tissues Th.Geyer 7695251
forceps #5 (Dumont, inox, standard) Fine Science Tools 11251-20 0.1 mm x 0.06 mm tip
forceps #5 (Dumont, inox, biology grade) Fine Science Tools 11252-20 0.05 mm x 0.02 mm tip
Cohan-Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-02 straight tip
plastic slides with a groove (reusable) custom-built – 75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove
coverslips Marienfeld 107032 18 x 18 mm, No. 1.5H
glycerol Sigma-Aldrich 49781 dilute to 50 % in water
adhesive tape Tesa 57370-02 1.5 mm x 10 m
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referanslar

  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (26), 15050-15055 (2001).
  3. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat. Meth. 8 (9), 737-743 (2011).
  4. Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. eLife. 5, e12068 (2016).
  5. Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo. Dev. Biol. 176 (1), 143-148 (1996).
  6. Roy, S., Raghavan, K. V. Homeotic genes and the regulation of myoblast migration, fusion, and fibre-specific gene expression during adult myogenesis in Drosophila. Development. 124 (17), 3333-3341 (1997).
  7. Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Dev. Biol. 361 (2), 191-207 (2012).
  8. Gordon, S., Dickinson, M. H. Role of calcium in the regulation of mechanical power in insect flight. P. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (11), 4311-4315 (2006).
  9. Jin, H., et al. Genome-Wide Screens for In Vivo Tinman Binding Sites Identify Cardiac Enhancers with Diverse Functional Architectures. PLoS Genet. 9 (1), e1003195 (2013).
  10. Chen, E. H., Olson, E. N. Antisocial, an intracellular adaptor protein, is required for myoblast fusion in Drosophila. Dev. Cell. 1 (5), 705-715 (2001).
  11. Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. Green Fluorescent Protein Tagging Drosophila Proteins at Their Native Genomic Loci With Small P Elements. Genetik. 165 (3), 1433-1441 (2003).
  12. Katzemich, A., Liao, K. A., Czerniecki, S., Schöck, F. Alp/Enigma Family Proteins Cooperate in Z-Disc Formation and Myofibril Assembly. PLoS Genet. 9 (3), e1003342 (2013).
  13. Klapholz, B., et al. Alternative mechanisms for talin to mediate integrin function. Curr. Biol. 25 (7), 847-857 (2015).
  14. Schnorrer, F., Kalchhauser, I., Dickson, B. J. The transmembrane protein Kon-tiki couples to Dgrip to mediate myotube targeting in Drosophila. Dev. Cell. 12 (5), 751-766 (2007).
  15. Menon, S. D., Chia, W. Drosophila rolling pebbles: a multidomain protein required for myoblast fusion that recruits D-Titin in response to the myoblast attractant Dumbfounded. Dev. Cell. 1 (5), 691-703 (2001).
  16. Bloor, J. W., Kiehart, D. P. zipper Nonmuscle myosin-II functions downstream of PS2 integrin in Drosophila myogenesis and is necessary for myofibril formation. Dev. Biol. 239 (2), 215-228 (2001).
  17. Millard, T. H., Martin, P. Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure. Development. 135 (4), 621-626 (2008).
  18. Hatan, M., Shinder, V., Israeli, D., Schnorrer, F., Volk, T. The Drosophila blood brain barrier is maintained by GPCR-dependent dynamic actin structures. J. Cell Biol. 192 (2), 307-319 (2011).
  19. Lee, T., Luo, L. Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker for Studies of Gene Function in Neuronal Morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  20. Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
  21. Förster, D., Luschnig, S. Src42A-dependent polarized cell shape changes mediate epithelial tube elongation in Drosophila. Nat. Cell Biol. 14 (5), 526-534 (2012).
  22. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  23. Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Curr. Biol. 24 (7), 705-716 (2014).
  24. Guirao, B., et al. Unified quantitative characterization of epithelial tissue development. eLife. 4, e08519 (2015).
  25. Etournay, R., et al. Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing. eLife. 4, e07090 (2015).
  26. Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo. Development. 144 (7), 1261-1272 (2017).
  27. Sellin, J., Albrecht, S., Kölsch, V., Paululat, A. Dynamics of heart differentiation, visualized utilizing heart enhancer elements of the Drosophila melanogaster bHLH transcription factor Hand. Gene Expr. Patterns. 6 (4), 360-375 (2006).
  28. Lemke, S. B., Schnorrer, F. Mechanical forces during muscle development. Mech. Develop. 144 (Pt A), 92-101 (2017).
  29. Classen, A. -. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
  30. Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetik. 194 (4), 1029-1035 (2013).
  31. Zhang, X., Koolhaas, W. H., Schnorrer, F. A versatile two-step CRISPR- and RMCE-based strategy for efficient genome engineering in Drosophila. G3. 4 (12), 2409-2418 (2014).
  32. Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (29), E2967-E2976 (2014).

Etiketler

In Vivo ImagingMuscle-tendon MorphogenesisDrosophila PupaeMuscle DevelopmentTendon TargetsMuscle TwitchingFluorescent MarkersLive ImagingMuscle Biology

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Bu Makaleden Alıntı Yapın
Lemke, S. B., Schnorrer, F. In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae. J. Vis. Exp. (132), e57312, doi:10.3791/57312 (2018).
Atıfı İndir
Tekrar Baskılar ve İzinler

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image