甲醛辅助分离测定哺乳动物细胞染色质可及性的调控元素

1. 天 1: 细胞文化 将要分析的单元格培养为所需的量。细胞培养条件和培养基取决于所调查的细胞类型。注意: 原则上, 任何真核细胞都可以通过自由放任的方法对染色质的可达性进行分析。在这个实验中, 4 x 106 HEK-293T 细胞在 DMEM 培养基中的一个10厘米的盘子中播种, 补充了 10% (v/v) 的血清和 1% (w/v) 青霉素/链霉素, 并孵化在 5% CO2和37°c 24 小时, 直到细胞达到 70-80% 汇合 (~ 8 x 10每道菜的6单元格)。 2. 2 天: 甲醛交联和细胞收获 注意: 甲醛是剧毒的, 必须总是在油烟机下使用。穿防护服 (手套和实验室大衣)。适当丢弃废物。 将甲醛直接添加到通风罩中的细胞培养基中, 以达到最终浓度为 1% (v/v) (270 µL 37% (v/v) 甲醛到10毫升的细胞培养培养基)。在室温下孵化10分钟 (20-25 °c), 并手动将板材每2分钟进行一次。注: 交联时间可根据细胞类型进行调整。对于大多数细胞系, 10 分钟的交联是足够的。对于组织, 可能需要更长的孵化, 以允许所有细胞的固定。 加入甘氨酸到最后浓度为0.125 米, 以淬火甲醛 (添加500µL 2.5 米甘氨酸的股票到10毫升培养基)。室温孵育5分钟, 每2分钟一次。 用冰冷 PBS 清洗细胞 3x (8 克/升氯化钠, 0.2 克/升氯化钾, 1.44 克/升 Na2HPO4 · 2H2O, 0.24 g/升, 2 PO4, 用 HCl 或氢氧化钠调整 pH 值为7.4。通过加入10毫升的 PBS, 将培养基吸入并直接在细胞培养皿或烧瓶中冲洗。重复此步骤两次是非常小心的情况下, 松散黏附的细胞, 如 HEK-293T。在盘子的一侧小心地添加 PBS, 以避免细胞脱离。 第三次冲洗后, 并用重悬在1毫升的冰冷 PBS 中的细胞, 并转移到1.5 毫升的反应管在冰上。必要时使用细胞刮刀分离细胞。注: 当从有限的材料开始, 使用低 DNA 结合管, 以避免样本损失在过程中。 离心机5分钟在 300 x g 在4°c 在一个冷却的桌上离心机。小心地吸掉上清。 3. 细胞裂解和染色质破碎 并用重悬细胞颗粒在1毫升自由裂解缓冲 (1% (w/v), 10 毫米 EDTA, 50 毫米三盐酸 pH 值 8.1, 10 µg/毫升 leupeptin, 10 µg/毫升抑肽酶, 2 毫米 PMSF), 并并用重悬细胞通过仔细吹打几次。在冰上孵化20分钟。如果需要, 请在本步骤-80 °c 存储样品。 油脂实验交联 DNA 剪切它的平均大小为 200-300 bp。必须为每个样本源和使用的超声波设备确定 sonicator 的特定设置。在任何情况下, 确保 DNA 的有效剪切。在步骤5.14 中描述了 DNA 剪切的优化步骤。在超声波期间冷却样品, 避免加热样品。 离心样品15分钟和 1.3万 x g 在4°c。 将上清液转移到新的反应管上。将样品分成100µL 整除数。如果需要, 将样品存放在摄氏-80 摄氏度。注意: 此时可以中断协议。 4. 控制 DNA 的脱交联 从步骤3.4 中提取100µL 整除, 以逆转交联, 并用作总 DNA 的参考。添加10µL 的 RNase (10 毫克/毫升) 和孵化1小时在37摄氏度。 添加10µL 蛋白酶 K (20 毫克/毫升)。使用可编程热块孵化4小时在37摄氏度, 然后6小时65°c, 以切割蛋白质和逆转 crosslinks。最后, 将样品保持在4摄氏度, 直到协议恢复, 然后再进行步骤5。注意: 其他自由放任协议使用未交联作为参考的细胞的染色质样本, 从而取消了对脱交联11的需要。这些样品没有交联的事实可能导致超声波效率或 dna 稳定性的差异, 因此使用与测试样本相同的程序的总 DNA 参考样本更准确。 5. 3 天: 苯酚: 氯仿纯化 DNA 从步骤3.4 中取不交联的整除。添加10µL 的 RNase (10 毫克/毫升) 和孵化1小时在37摄氏度。 从步骤4.2 中取非交联整除表单步骤5.1 和脱交联样品, 并进行并行处理。添加 H2O 以达到最后的卷300µL。 在通风罩和漩涡中加入300µL 的 phenol:chloroform:isoamyl 醇 (25:24:1)。注意: 苯酚具有腐蚀性和毒性, 必须始终使用在通风罩下。穿戴防护服 (手套和实验室大衣), 确保反应管紧密封闭, 适当处理废弃物。 离心机为10分钟在 1.3万 x g 在4°c。 小心地将上水相的280µL 转移到一个新的反应管上。确保不要从也含有蛋白质的界面中取任何碎片。将剩余的较低阶段丢弃为有机溶剂废料。 重复步骤5.3 至 5.5, 小心地将上水相的270µL 转移到新的反应管上。 在通风罩和涡流中加入270µL 氯仿。注: 此步骤用于清除样品中残留的苯酚。 离心机为10分钟在 1.3万 x g 在4°c。 小心地将上水相的250µL 转移到新的反应管上, 注意不要从界面中携带任何碎片。将剩余的样品作为有机溶剂废料丢弃。 添加25µL 5 米氯化钠和250µL 异丙醇。添加5µL 的糖原 (20 毫克/毫升) 作为 DNA 载体。在室温下, 通过反转管和孵育20分钟来混合。离心机为10分钟在 1.3万 x g 在4°c 沉淀脱氧核糖核酸。 用400µL 70% (v/v) 乙醇清洗 DNA 颗粒。离心机为10分钟在 1.3万 x g 在4°c。 仔细吸上清液, 让颗粒在室温下干燥10分钟。并用重悬在100µL 的缓冲 (10 毫米三 pH 8, 1 毫米 EDTA)。 在65摄氏度的4小时内孵化无交联的游离 dna 样本, 以去除 dna 间的 crosslinks。把样品存放在摄氏-20 摄氏度。 使用分光光度计量化 DNA 的数量, 并运行整除检查 2% (w/v) 琼脂糖凝胶的碎片大小。根据琼脂糖凝胶电泳 DNA 尺寸分析结果, 调整剪切时间和强度, 以获得 200-300 bp 的平均尺寸。 6. 定量实时 pcr (qRT pcr) 测定游离与总 DNA 核 dna (以下简称自由 dna) 与总 dna 的比值由 qRT PCR17、18决定。样品也可以通过基因芯片杂交或深度测序进行定量分析, 以进行全组测定。 为要测试的区域设计 qPCR 底漆, 并进行正负控制。注意: 适当的阳性对照是在主动转录的管家基因 (如 ACTB、GAPDH、TPI1 或 TUBA1A (编码β肌动蛋白、GAPDH、TPI 或α蛋白) 的启动子中的引物。适当的阴性对照发现在染色质地区或基因沙漠。其他合适的负控制可以设计在与动态调节的轨迹相邻的基因组区域, 以控制本地副本数差异 (表 1)。 将 DNA 样品稀释为最终浓度为10的µL 和 TE 缓冲器, 并将稀释系数计入最终计算 (见步骤 6.5)。 在 triplicates 中建立一个96井板的 qPCR 反应, 每个井的反应组合如下: 模板 DNA:20 ng (2 µL), 前底漆 200 nM (0.4 µL 5 µM 股票), 反向底漆 200 nm (0.4 µL 股票µM), 一个商业准备使用含有绿色染料的反应混合物 (5 µL 从2x 股票), 和 H2O 到10µL。 在实时 qPCR 设备中运行, 使用绝对量化模式, 并确定不同引物对样品的 Ct。在考虑到步骤6.3 中的稀释因子的情况下, 计算每种底漆的游离 dna 与总 dna 的比值, 方法如下:在表 2中给出了代表性的结果和一个示例计算。 为了弥补样本之间的差异, 正常化为正控制回收率: