Сочетание Оптогенетика с искусственных микроРНК охарактеризовать последствия нокдаун гена на пресинаптическом функции внутри нетронутыми нейронных цепей

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Совета европейских сообществ (Директива 2010/63/ЕС 4 марта 2014 года) и были одобрены министерством здравоохранения Италии. 1. дизайн микроРНК РНК-интерференции и оценки их эффективности в гетерологичных выражение систем Примечание: Этот протокол требует знаний о следующих устоявшихся методов: молекулярное клонирование, секвенирования ДНК, поддержания клеточных линий, кальция фосфат трансфекции, количественные реального времени PCR (qRT-PCR), подготовка lysates клетки от клеточных линий и Западный blotting. Определите, подлежит ли Альтернативный сплайсинг гена интереса. Выберите для общего нокдаун гена, исключительно учредительный экзонов; нокдаун конкретных альтернативно сращивания изоформы выберите соответствующие альтернативно сращивания экзона. Для разработки искусственных Мирс для РНК-интерференции против последовательность интереса используйте специализированное программное обеспечение (например , https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/).Примечание: Важно использовать основной инструмент поиска местных выравнивание (взрыв) для проверки возможных вне целей в рамках того же вида. Выберите Топ три Ранжированные Мирс для целевого гена. Заказывайте верхней и нижней нити выбранного Мирс подходящего компании. Для отрицательного контроля, используйте платные версии одного выбранного Мирс или мир предсказал не направлять любые известные гена видов, используемых в эксперименте (например. для позвоночных генов, мир в pcDNA6.2-GW/EmGFP мир ОТР). Отжиг соответствующих верхней и нижней нити выбранного Мирс и клонировать их в плазмиду для выражения Мирс (например pcDNA6.2-GW/EmGFP мир) с помощью стандартных клонирования стратегий.Примечание: Цель является создание кассеты выражение мир, состоящий из 5′ мир фланкируя региона, выбранного мир последовательности и 3′ мир фланкируя региона, который может быть выражен от 3′ УТР гена репортера под контролем промотора II тип РНК-полимеразы. Для проверки правильного ввода выбранного Мирс используйте секвенирования ДНК. Расти HEK293 клетки в инкубатор культуры увлажненные клеток (37 ° C, 5% CO2) с помощью DMEM среднего дополнены с 10% плода бычьим сывороточным, 1 мм NaPyruvate, 10 мм HEPES (рН 7.39) и 1 x пенициллина/стрептомицина (Pen/Strep). Когда HEK293 клетки ~ 70% притока, совместно transfect их с каждым из векторов выражения мир и выражая целевых генов в соотношении 1:1 ДНК, с использованием метода фосфата кальция6вектора. Включают в себя следующие элементы: (i) untransfected клеток, (ii) клетки transfected с вектором выражения целевого гена вместе с любой перевозчик ДНК (например pBluescript II SK(+)) или (iii) мир управления.Примечание: (i выразил целевых генов должны быть из того же вида, к которому были разработаны Мирс, если последовательностей, мишенью Мирс абсолютно сохраняются на уровне нуклеотида между двумя видами. (ii) клеточных линий, кроме HEK293 может быть использован. (iii) альтернативных методов трансфекции, например электропорации или методы, на основе липосом, может использоваться. 48 ч после трансфекции, Лизируйте клетки, Побегите гель белка, выполняют иммуноблоттинга и анализировать содержание с антителом, признавая целевого белка белка. Прицелиться бросовым эффективность ≥50%.Примечание: Нокдаун эффективность может альтернативно, или Кроме того, быть оценены (i) анализ ИФА, (ii) путем измерения деятельности целевого белка, если применимо (например плотностях тока для ионных каналов) или (iii) qRT ПЦР на уровне мРНК, если подходит антитела не доступны (протокол шаг 3). Место культуры блюда на льду и вымыть клетки один раз с ледяной фосфат амортизированное saline (PBS). Аспирационная PBS, затем добавьте ледяной Буфер RIPA (50 мм трис-HCl рН 7,4, 150 мм NaCl, 2 мм ЭДТА, 1% NP40, лаурилсульфат натрия 0,1% (SDS), содержащие ингибиторы протеазы и фосфатазы; 1 мл раствора для блюдо Ø 100 мм, 0,5 мл для блюдо Ø 60 мм). Соскрести блюдо с помощью скребка клетки адэрентных клеток и мягко передавать суспензию клеток в предварительно охлажденным microcentrifuge трубку. Центрифуга трубки на 15000 x g 15 мин при температуре 4 ° C, передача супернатант в новой трубки предварительно охлажденным microcentrifuge и отбросить гранулы. Определите концентрацию протеина используя Assay протеина BCA комплект или другой подходящий метод (например assay Брадфорд).Примечание: Образцы могут быть заморожены при-20 ° C или ° C-80 для последующего использования или обрабатываются немедленно. Соответствующий объем лизатов можно передавать microcentrifuge трубы так, что все образцы имеют такой же концентрации белка и добавить надлежащего ледяной литического буфера составляют все лизатов на том же.Примечание: 30 – 50 мкг общего белка должно быть достаточно для большинства белков, но количество загружаемых должна определяться согласно обилием протеина интереса. Добавьте соответствующее количество 2 x Laemmli буфера (4% SDS, 2-меркаптоэтанол 10%, 20% глицерина, 0,004% бромфеноловый синий, 0,125 М трис-HCl, pH 6.8) и варить образцы на 95 ° C за 5 мин. Загрузите образцы на гель акриламида наряду с молекулярной массой маркер. Побегите гель на 100 V для 1-2 ч.Примечание: Гель процент зависит от размера протеина интереса. Соберите сандвич передачи и передачи белки от геля на мембрану в 100 V 2 h. Мембрана может быть нитроцеллюлозную или PVDF. Активировать PVDF метанолом за 1 мин и промойте его передачи буфера перед подготовкой в стек. Блокировать мембрана для 1 ч при комнатной температуре с помощью блокировки буфера (5% молока в PBST (PBS + 0.1% Tween-20)), затем Проинкубируйте мембрану на ночь при 4 ° C с основного антитела, разбавленных в блокирующем буфере. Промойте мембрану за 10 мин в PBST три раза и проинкубируйте его с ПХ конъюгированных вторичное антитело в блокирующем буфере 1 ч при комнатной температуре. Промойте мембрану 10 мин в PBS четыре раза, а затем применить Хемилюминесцентный субстрат мембраны и захватить хемилюминесцентный сигналов с помощью ПЗС-датчик на основе камеры. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для количественного определения эффективности нокдаун. Выберите два наиболее эффективных Мирс, ориентация non перекроя последовательности для дальнейшего функциональных анализов.Примечание: Эффекты-целей может никогда не быть исключена полностью для любой мир. Однако если два независимых Мирс имеют аналогичный эффект, это крайне маловероятно, что это объясняется же пробить нокдаун. Если нокдаун эффективности выбранного Мирс не является удовлетворительным (< 50%), экран для других Мирс. Кроме того Ускоренная наиболее эффективным miR(s) в тандеме, т.е. выразить их в нескольких копий из кассеты же выражение, которое может привести к повышению эффективности нокдаун7. 2. Строительство рекомбинантного адено-связанных векторов для комбинированных выражение Optogenetic, датчики и микроРНК Примечание: Этот протокол требует знаний о следующих устоявшихся методов: молекулярное клонирование и секвенирование ДНК rAAV производства. Клон наиболее эффективным мир выражение кассет в 3′ УТР конструкций, предназначенных для производства рекомбинантного rAAVs и выражение возбуждающим optogenetic зонды, такие как pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X (рис. 1а), где Нейрон конкретной промоутера Синапсин диски выражение сверхскоростной channelrhodopsin ChETA, флуоресцентные Красный репортер TdTomato и miR(s), между NheI и EcoRI сайты5вставить.Примечание: (i) не превосходят предел упаковки rAAVs, который составляет приблизительно 4,7 КБ в длину от ИТР (Перевернутый терминала повтор) для ИТР (Рисунок 1A, оранжевый). (ii кассета выражение мир необходимо вставить между стоп-кодон и WPRE (сурок гепатитом вирус посттранскрипционного регулирования элемент; Рисунок 1A). (iii) включение флуоресцентного белка, такие как TdTomato, является чрезвычайно полезным, поскольку оно позволяет легко мониторинга локализации и интенсивности инфекции (протокол шаг 4). Для проверки правильной вставки мир кассеты используйте секвенирования ДНК. Продукты и титр rAAV1/2 согласно ранее опубликованного протокола8, один rAAV1/2 для каждого выбранного мир. Один из типичных эксперимент для нокдаун одного гена будет включать два независимых Мирс против же гена и один мир управления. Цель для титр вируса ≥109 вирусных геномов (vg) / мкл.Предупреждение: rAAVs должны быть обработаны в объекте биобезопасности уровня 1 (BSL-1). Для получения подробной информации свяжитесь с организационного комитета по биобезопасности.Примечание: Если лаборатория не имеет вирусный объекта или вирусный титры не являются удовлетворительными, rAAV производства, могут быть переданы. Например посетите https://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore/ или https://vcf.charite.de/en/metas/. 3. Добыча РНК из первичного нейрональных культур для оценки мир эффективность эндогенного генов нокдаун qRT-ПЦР Примечание: (i) этот протокол требует знания следующие устоявшиеся методы: подготовка и ведение первичных нейрональных культур и qRT-PCR. (ii) повторить количественная оценка эффективности нокдаун (шаги 3.1 – 3.14) по крайней мере 3 раза (биологические репликация). (iii) Оценка нокдаун эффективности на уровне мРНК qRT-ПЦР подходит, когда анализ содержания белка исключается, например когда стучать вниз альтернативно сращивания изоформ, для которого специфические антитела являются не доступны5. Подготовка первичного нейрональных культур от мозга регионе интереса. Следуйте протокол для корковой культур в предыдущей публикации9, со следующими изменениями: Пластина нейронов в 6 хорошо пластины на плотности 500 000 нейронов в колодец. Используйте 2,5 мл/также вложение среднего и 3,3 мл/хорошо обслуживания среды. Если наблюдается разрастание экзоцитоз, добавьте 0,5 мл/хорошо обслуживания среды с 7,5 мкм цитозина β-D-arabinofuranoside (для конечной концентрации 1 мкм) в 3-4 дня в пробирке (DIV). Заразить три скважины за мир (технические реплицирует) на 5-6 DIV. Использование низких инфекционных доза, которая будет заразить ≥99% нейронов. Удалите 2 мл среды из каждой скважины и собирают его в 50 мл трубки сокола. Добавить вирус непосредственно в нейронах, осторожно перемешать и поместите пластины обратно в инкубаторе при 37 ° C. Храните средства собранные в инкубаторе. Освободите крышку трубки сокола разрешить газ уравновешивания. После 24 часов добавьте удалены средних обратно в каждой скважине (1.9 мл/хорошо). В 17–18 DIV, лизируют нейронов для извлечение RNA.Предупреждение: Lysis реагента и хлороформе высоко токсичен. Работа под капотом химической и носить защитное снаряжение; Утилизация отходов согласно ваших национальных и институциональных руководящих принципов.Примечание: Для шагов 3.3 – 3.13, работают в условиях РНКазы бесплатно. Надевайте перчатки и использовать бесплатно РНКазы посуда и одноразовые пластик. Для общие меры предосторожности как ручка РНК обратитесь например добавление A RNeasy микро руководства доступны онлайн. Инкубировать стекла, которую Пастер пипетки на ночь в духовке при 180 ° C. Наклона пластин и аспирационная среднего полностью от каждой хорошо с использованием стекла, пипетка Пастера подключен к вакуумного насоса. Сразу же добавьте 700 мкл Реагента Lysis каждой скважины. Равномерно решение качания и покачивая пластины тщательно и кратко вручную. Пипетка решение вверх и вниз 4 – 5 раз или до получения однородной подвеска. Передача решения от каждой скважины в отдельный 1,5 мл трубки Эппендорф.Примечание: Lysates клетки могут храниться при температуре-80 ° C или обрабатываются немедленно. При необходимости разморозить клеток лизатов на RT и сразу перейти к шагу 3.5. Мкл 140 метилхлороформа для каждой выборки lysates клетки.Примечание: Хлороформ нестабильных и трудных Пипетка, как можно скорее закрыть Eppendorf трубы. Встряхнуть Eppendorf трубы энергично для 15 s или до тех пор, пока образцы полностью эмульсии. Держите образец на RT для 1 – 2 мин, или до жидкой фазы начинают отделить. Центрифугуйте образцы на 12000 g x 15 мин при 4 ° C. Передача верхний водной фазе (~ 320 мкл), содержащие РНК к новой пробке Эппендорф и отменить оставшуюся жидкость.Примечание: Не прикасайтесь к нижней розовый органические фазы или белое кольцо между двумя этапами кончиком пипетки. Добавить 1,5 томов 100% этанола (480 мкл) в водной фазе, и Пипетка раствор медленно вверх и вниз 3 раз перемешать. Очищайте РНК, использование коммерчески доступных комплект, предназначенный для очищения RNA от малых выборок. Количественную оценку концентрации и образец чистоты РНК с спектрофотометром.Примечание: (i) ожидать урожайность ≥3.5 мкг/скважины; 260/280 и 260/230 коэффициенты для чистоты над белков и органических соединений должны оба быть ≥1.9. (ii РНК образцы можно хранить при температуре-80 ° C или обрабатываются немедленно. Retrotranscribe, 250, 500 или 1000 нг РНК с коммерчески доступных комплект. Количественно нокдаун эффективности для эндогенного гена интереса qRT-ПЦР. Подробный протокол ссылка10см. Прицелиться бросовым эффективность ≥60% (рис. 2). Нормализовать данные ≥2 уборки генов (например. GAPDH, ACTB, TUBB3, PPIA) Использование нескольких внутреннего контроля гена метод11.Примечание: Если работа в крыса, используйте следующие праймеры PCR для уборки генов: GAPDH-передний: 5′ GGTGCTGAGTATGTCGTGGA 3′ и GAPDH-rev: 5′ GATGATGACCCTTTTGGC 3′; ACTB-fwd: 5′ CATCACTATCGGCAATGAGC 3′ и ACTB-rev: 5′ TCATGGATGCCACAGGATT 3′; TUBB3-fwd: 5′ GCCTTTGGACACCTATTCAG 3′ и TUBB3-rev: 5′ TCACATTCTTTCCTCACGAC 3′; PPIA-fwd: 5′ CACTGGGGAGAAAGGATTTG 3′ и PPIA-rev 5′ CCATTATGGCGTGTGAAGTC 3′. 4. Оценка роли Пресинаптический белков в нетронутыми нейронных цепей путем целенаправленных стимуляции разобранном нейронов с Оптогенетика Примечание: Следующий протокол требует предыдущего опыта работы с электрофизиологических записи острого мозга ломтиками и доступ к электрофизиологических установки. Вентрикуло придать мозга после подробного протокола в предыдущей публикации12rAAV1/2. Определите стереотаксической координаты для мозга регионе интересов использованием стереотаксической атласы для мыши13 или крыса мозга14. Использовать съемник микропипеткой тянуть micropipettes инъекции с длинный хвостовик Ø 7-9 мкм; клип micropipettes впрыска на черенки с ножницами. Используйте тонкий маркер и Миллиметровка разместить калибровки знаков на micropipettes инъекции каждые 2 мм. Анестезировать животное с изофлюрановая и исправить ее в стереотаксической аппарат. Согревались животное на протяжении операции с грелку на 37 ° C. Защитите глаза с глазные смазки. Брить шерсть на голове с электрической бритвой. Распространения повидон йод на обрил голову, с помощью ватной палочкой. Под микроскопом рассечения делают разрез средней линии. Чистота поверхности черепа с ватным тампоном, чтобы сделать видимыми bregma и лямбда. Место инъекции микропипеткой в держатель. Прикрепите держатель стереотаксической руку. Определить x и y координаты сайта впрыска по сравнению bregma и/или лямбда-выражения. Используйте дрель для тонких черепа над целевой области.Примечание: Используйте нежные круговые движения и избежать бурения через череп, как это может повредить поверхности мозга. Если есть кровотечение, поглощают чрезмерно крови с бумажных полотенец.Примечание: Чрезмерное крови будет сделать его трудно правильно определить координату z. Загрузите ≤2 мкл вируса в инъекции микропипеткой, капиллярных действий. Принесите микропипеткой инъекции для x и y координаты в месте инъекции. Вычислить координаты z из Дура и медленно опустите пипеткой в мозг. Когда достигается координата z, подождите 3 мин для перестройки тканей. Применение низких положительным давлением, с использованием подключен через гибкую трубку к задней части микропипеткой инъекции 1 мл шприц. Визуально контролировать скорость эжекции вируса от инъекций микропипеткой через микроскоп диссекции и с использованием калибровки отмечает в качестве опорных точек.Примечание: Вирус должен вводиться медленными темпами (< 100 nL/мин) чтобы избежать повреждения тканей. После завершения инъекций, подождать 5 мин, вывести микропипеткой инъекции 0,2 мм, ждать еще 5 мин, чтобы избежать обратного вируса. Снять инъекции микропипеткой медленно и полностью от мозга и утилизируйте ее в контейнер заполнен с хлоркой. Намочите черепа с физиологического раствора и шовные кожи с 3-4 строчки. Применять мазь гентамицина в рану. Одноместный дом животное в клетке чистой пищей гранулы и под светильник жары до него полностью восстанавливается. ≥15 дней после инъекции, обезглавить животных под наркозом глубокие изофлюрановая. С Vibratome с помощью газом (95% O2, 5% CO2) подготовить кусочки острый мозга мозга региона интерес ледяной фаго раствор, содержащий (в мм): 123 NaCl, 1,25 KCl, 1,25 х2PO4, 1,5 MgCl2, 1 CaCl2, 25 3NaHCO, 2 NaPyruvate и 18 глюкозы (осмолярность скорректирована до 300 мОсм). Например если цель состоит в том, чтобы проанализировать синаптической передачи от CA3 нейронов пирамидальный СА1, подготовьте сагиттальной кусочки формирования гиппокампа (толщиной 350 мкм).Примечание: От этого шага, начиная работе в условиях низкой освещенности чтобы избежать активации optogenetic зонда окружающей среды светом. Пусть ломтики восстановить в течение 30 минут при 37 ° C в том же фаго в камере, предназначен для проведения срезы мозга. Держите ломтики в той же камере срез мозга при комнатной температуре до записи.Примечание: Использование этих условий, ломтики может поддерживаться здоровым для до 6-8 ч. Передачи, один кусочек погруженной запись камеры и superfuse его с 2 мл/мин же фаго, используется для восстановления дополнена 1,5 мм CaCl2 (всего Ca2 +: 2,5 мм) и без NaPyruvate.Примечание: Фрагментов готовятся и поддерживается в низкой концентрации Ca2 + (1 мм) для сведения к минимуму токсичности. Записи производятся в 2,5 мм Ca2 + в пользу освобождения везикул. Кратко проверить сигнал выраженной флуоресцентные репортер (например. TdTomato; Рисунок 3B) чтобы выяснить, локализации и интенсивности инфекции. Заполнить патч электрод с внутриклеточной раствор, содержащий (в мм): 110 K-глюконат, 22 KCl, 5 NaCl, 0.5 EGTA, 3 MgCl2, 4 мг-АТФ, 0,5 НС3-GTP, 20 K2-креатин фосфат, 10 HEPES-Кох (рН 7.28, 290 mΩ).Примечание: Используйте патч электрод с пипеткой сопротивлением 5-6 mΩ. При ИК-подсветки достигать герметичное уплотнение поклеточного конфигурации от нейрон получает синаптических входов от зараженных нейронов. Например если были инфицированы CA3 нейронов пирамидальный, патч пирамидных нейронов проксимальнее медиального тракта области СА1 (рис. 3 c).Примечание: Серия сопротивление можно оставить некомпенсированных, но она должна быть постоянной и низкой (≤20 MΩ). Используйте фармакологии изолировать синаптических течения под следствием. Например если цель состоит в том, чтобы расследовать возбуждающим синаптической передачи, блокировать ингибирующее синаптической передачи с 10 мкм bicuculline. Вызывают синаптических течений, например, возбуждающих постсинаптических токов (EPSCs), с помощью 473 Нм голубой лазер, в сочетании с оптического волокна (Ø ≤250 мкм), расположенный на somata инфицированных нейронов (например. CA3 нейронов пирамидальный). Отрегулируйте длину стимуляции до минимума, чтобы уменьшить возможность вызывая более чем один потенциал действия в светового импульса. При использовании ChETA, установите его в 2 мс15. Отрегулируйте стимуляции сила лазера приносить небольшой, но явно обнаруживаемая синаптических токов (≤50 Па пик амплитуды для EPSCs записан в холдинг потенциал -70 mV между CA3 и CA1 нейронов пирамидальный; 3D рисунок). При использовании ChETA и волоконно-оптических 250 мкм в диаметре, стимуляции, что выход сильных сторон 1 – 3 МВт на волокна должно быть подходящим.Примечание: Если лазер сила не может регулироваться, используйте нейтральные светофильтры. Блеск 473 Нм лазерного света на somata инфицированных нейронов, а не на их аксоны. Например сиять свет на CA3 somata и от Шаффер коллатералей, чтобы избежать прямого деполяризации аксоны. Применить Тетродотоксин (TTX; 0,5 мкм), блокирующие натриевые каналы, в образец для подтверждения каналы управляются потенциал действия. В разных записях применять селективный блокатор синаптических текущее расследование для подтверждения выборочной стимуляции.Примечание: например, применить NBQX (10 мкм) для AMPA-типа глутамата рецептор опосредованный EPSCs. Сравните оптически и электрически вызвала синаптических течений в же кусочек острого мозга в ответ на стимуляцию повторяющихся (≥2 стимулы ≤20 Гц). Аналогичную синаптического облегчения или депрессия должны соблюдаться между электрические и оптические стимуляции при использовании управления мир, таким образом, о том, что подобные клеточных механизмов активируются двумя типами стимуляцию.Примечание: Вышеуказанные шаги необходимы для обеспечения что оптический стимуляции не побудить прямой деполяризации Пресинаптический boutons, таким образом обходя некоторые механизмы синаптической передачи. Сравните синаптической передачи в ответ на стимуляцию (≥2 стимулы ≤20 Гц) одно- и повторяющихся между мир управления и Мирс, ориентация Пресинаптический белков под следствием.