Microscopía de coherencia óptica de campo completo para el análisis histológico de características estromales en injertos corneales

Todos los métodos descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y siguieron los requisitos éticos internacionales para los tejidos humanos. Este fue un estudio observacional prospectivo de casos y controles. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes. No se introdujeron modificaciones en las normas francesas de tratamiento o seguimiento. La aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB) se obtuvo del Comité de Protección del Paciente, Ile-de-France V (14944). 1. Selección y preparación de tejidos Seleccione córneas de donantes. Transfiera las córneas de donantes almacenadas en medio de cultivo de órganos 26 al medio de cultivo de órganos suplementado con dextrano durante 3 días para permitir la deturgescencia27 antes de la obtención de imágenes FF-OCM28 (consulte la Tabla de materiales). Prepare las muestras. Coloque la córnea, sumergida en un medio de almacenamiento, en el portamuestras con el epitelio hacia arriba. Coloque un cubreobjetos de sílice limpio (provisto con el soporte de muestra) en la parte superior de la córnea y cierre el soporte girando suavemente su base hasta que la muestra esté ligeramente aplanada e inmovilizada debajo del cubreobjetos, proporcionando una superficie de imagen relativamente uniforme. Tome precauciones para evitar cualquier burbuja de aire. Aplique una capa gruesa de gel oftálmico u óptico sobre el cubreobjetos como medio de inmersión. 2. Inicialización, configuración y adquisición de imágenes de FF-OCM Inicialice el dispositivo. Encienda el dispositivo accionando el interruptor de encendido en la parte posterior del dispositivo; La iluminación de un LED verde en la parte frontal del dispositivo indica que la alimentación está encendida. Encienda la computadora dedicada y la fuente de luz halógena accionando el interruptor de encendido en la parte frontal. Inicie el software de adquisición (consulte la Tabla de materiales) haciendo doble clic en el acceso directo del escritorio. Asegúrese de que la etapa de imagen esté despejada, excepto por la bandeja móvil. Luego haga clic en “Aceptar” para inicializar los motores cuando se le solicite. Saque la bandeja e inserte el portamuestras en el recipiente dedicado, luego empuje suavemente hacia atrás la bandeja. Configure el dispositivo. Introduzca un “identificador de muestra” en el campo designado y obligatorio; Opcionalmente, introduzca una “Descripción de la muestra” y/o “Descripción del estudio”. Haga clic en “Adquirir imagen macro” cuando esté listo, para crear una instantánea de la muestra que se puede utilizar para fines de posicionamiento lateral y navegación más adelante; una vez satisfecho, valide la imagen en el indicador haciendo clic en “Sí”, después de lo cual el dispositivo mueve la bandeja de muestra debajo del objetivo y realiza un ajuste automático. Asegúrese de que el objetivo del microscopio esté bien sumergido en el gel óptico antes de continuar. Adquiere las pilas. Seleccione la pestaña “Explorar” para preparar una adquisición. Antes de adquirir una pila de imágenes, navegue hasta el centro de la córnea, mediante la traducción del joystick o la selección manual en la pantalla (es decir, haciendo clic y arrastrando el cuadrado rojo de la imagen macro adquirida a la ubicación deseada). Varíe la profundidad de imagen mediante la rotación del joystick, el ajuste del control deslizante o la entrada manual del teclado en la interfaz gráfica de usuario (GUI) y ajuste el valor promedio (generalmente se recomienda un promedio de 40 para obtener imágenes corneales óptimas).NOTA: Esto se hace para determinar el grosor de la muestra corneal y el promedio necesario para obtener imágenes a través de todo el grosor corneal mientras se observa la primera y la última ubicación de la imagen en profundidad. La superficie inferior del cubreobjetos crea franjas de interferencia paralelas que se ven en la imagen tomográfica (en el lado derecho de la GUI), que facilitan la localización de la superficie corneal. Introduzca el valor de la superficie corneal o la primera ubicación de la imagen en profundidad en el campo “Profundidad”. Seleccione la pestaña “Adquirir”, para adquirir imágenes. Seleccione el “Espaciado de corte” (la configuración predeterminada y recomendada es 1 μm, que coincide con la resolución axial del dispositivo) e introduzca el valor de espesor corneal en consecuencia, en “Número de cortes”. Revise los parámetros y el tiempo de adquisición, y cuando esté satisfecho, presione “OK” para iniciar la adquisición. Durante la adquisición, evite cualquier contacto con la mesa en la que se coloca el FF-OCM. 3. Gestión de las imágenes adquiridas Ver y exportar imágenes. Inicie el software de visualización FF-OCM (consulte la Tabla de materiales) haciendo doble clic en el acceso directo del escritorio; Las imágenes adquiridas (identificadas por el ID de muestra) aparecen en la lista “Estudios locales”. Seleccione el estudio con el ID de muestra correspondiente, que contiene tanto la imagen macro como la pila de imágenes adquiridas, y “exporte” esta última haciendo clic derecho en la serie de imágenes y seleccionando el formato “DICOM” para conservar los datos y metadatos de píxeles sin procesar para su posterior análisis. Muestre las pilas de imágenes 3D en vistas frontales y transversales utilizando el modo de reconstrucción multiplanar (MPR), haciendo doble clic en la serie de imágenes; Navegue por las imágenes (por ejemplo, mediante el desplazamiento de la rueda del mouse o el ajuste del control deslizante) y seleccione vistas representativas en la cara y transversales de cada pila. Exporte las vistas seleccionadas haciendo clic en el icono en la parte inferior derecha de la ventana, utilizando el formato “DICOM”. Importar imágenes. Abra el software de procesamiento de imágenes (consulte la Tabla de materiales) haciendo doble clic en el acceso directo del escritorio y navegue hasta el “Importador de bioformatos” en “Complementos” para importar imágenes DICOM; asegúrese de que “Agrupar archivos con nombres similares” esté seleccionado en la ventana “Opciones de importación de bioformatos”. 4. Análisis de imágenes: evaluación cualitativa y cuantitativa de la morfología y características del estroma Evaluar el grosor del estroma y de la capa de Bowman. Mida distancias manualmente en secciones transversales corneales, por ejemplo, en cinco puntos igualmente espaciados a través de la sección transversal25.Dibuje una línea entre dos puntos de distancia conocida (como, de izquierda a derecha de toda la imagen, es decir, según el campo de visión predeterminado, 1.024 píxeles o 780 μm), vaya a “Analizar” y seleccione “Establecer escala”, e ingrese la “Distancia conocida” y la “Unidad de longitud” en los campos apropiados y haga clic en “Aceptar”. Dibuja una línea entre dos puntos de distancia desconocida; Lea la longitud o distancia medida directamente desde la barra de estado. Registre la media y el coeficiente de variación (COV). El grosor de la capa de Bowman inferior a 6,5 μm y un COV superior al 18,6% se han asociado con estroma corneal anormal25. Determinar la densidad de queratocitos. Siguiendo la convención de la microscopía confocal: suma imágenes estromales en cara en grupos de 7 para producir cortes de espesor comparable. Para esto, vaya a la pestaña “Imagen” y seleccione “Reslice Z” en “Pilas”. Tener en cuenta la diferente densidad celular (decreciente) en la progresión a través del estroma24,25. Para esto, se puede considerar que el estroma está compuesto por 4 regiones según la profundidad: (1) el estroma muy anterior debajo de la capa de Bowman, que es el 2% del grosor total del estroma; El estroma restante (es decir, el 98% del grosor total del estroma), con tres zonas de grosor idéntico: (2) estroma anterior, (3) estroma medio y (4) estroma posterior. Para un análisis adicional, incluya todos los cortes faciales disponibles para el estroma muy anterior, 15 imágenes para el estroma anterior, 5 imágenes para el estroma medio, así como 5 imágenes para el estroma posterior (donde el número de imágenes por región requeridas para un recuento confiable se determinó mediante análisis escalonado29). En cada imagen frontal , seleccione una región de interés de 300 μm x 300 μm. Para mejorar la visualización del núcleo, invierta la imagen, usando “Invertir” en la pestaña “Editar”, y ajuste el contraste y el brillo. Para este último, vaya a “Imagen” y navegue hasta “Brillo / Contraste” en “Analizar”. Contar manualmente los núcleos celulares, utilizando, por ejemplo, la función “contador de celdas”25. Para esto, vaya a “Complementos” y navegue a “Contador de celdas” en “Analizar”. Presione “inicializar” y luego seleccione un tipo de contador. Luego comience a contar los núcleos de la celda haciendo clic en las características ovaladas oscuras en la imagen invertida, considerando las que aterrizan en un borde de imagen solo para dos de los cuatro lados de la imagen25. Registrar la densidad celular en términos de densidad de área, es decir, en células/mm² (dividir el número de células contadas por 0,09, para convertir de células/90.000 μm² a células/mm²), siguiendo la convención de microscopía confocal donde las densidades de queratocitos han demostrado ser menores en pacientes (por ejemplo, con queratocono) que en sujetos sanos y correlacionarse con la gravedad de la enfermedad25.NOTA: Se necesitan más estudios clínicos para determinar si se requiere un umbral mínimo de densidad de queratocitos para obtener un injerto de córnea perfectamente claro después del trasplante. Evaluar la reflectividad del estroma. Genere perfiles de profundidad de intensidad media de pilas de imágenes estromales, utilizando, por ejemplo, la función “perfil del eje Z” y / o software personalizado25,30,31.NOTA: Estos son, de hecho, perfiles de profundidad de amplitud ya que FF-OCM mide la amplitud de la luz retrodispersada por la muestra en lugar de su intensidad.Calcule el nivel de gris medio para cada pila de caras . Reste el valor gris mínimo y normalícelo por el valor gris máximo. Visualización en escala logarítmica en función de la profundidad estromal (% del grosor estromal ). Aproximar el perfil logarítmico resultante mediante una línea de regresión lineal, que minimiza la suma de los residuos al cuadrado (ajuste de mínimos cuadrados). Registre el valor R-cuadrado (R²) como una medida de linealidad. Valores inferiores a 0,94 podrían ser una indicación de patología corneal25.NOTA: Para diferenciar la insuficiencia de un modelo de regresión logarítmica lineal (o un modelo de decaimiento monoexponencial) debido a la presencia de una patología del mero ruido de medición, se puede realizar un análisis de señal por inferencia bayesiana31. Además, en córneas con perfiles de profundidad estromal logarítmicos lineales (o monoexponenciales) (por ejemplo, representados por valores R-cuadrado30 o relaciones de Birge 31 cercanas a 1), el cálculo de la trayectoria libre media del fotón a partir de la tasa de decaimiento de la señal puede usarse para cuantificar aún más el grado de transparencia31. Evaluar la visibilidad de otras características estromales e indicadores de enfermedad. Compruebe la presencia de cicatrices, tejido fibrótico, lagos o estrías de Vogt. Evaluar el grosor medio de los nervios en el estroma, si es suficientemente visible para la medición24.Seleccione una imagen en la cara donde el nervio estromal sea más visible (generalmente en la región del estroma medio). Mida el grosor del nervio, por ejemplo, en cinco puntos24, luego calcule la media y la desviación estándar. Los espesores nerviosos superiores a 9 μm pueden ser un indicador adicional de patología, como el queratocono24.