단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

클론 연구 노화¹동안 HSC 하위 및 HSC 행동의 변화에 새로운 통찰력을 제공 하는 성인 HSCs의 장기 engraftment 속성에서이 밝혀졌다. 그러나, 배아 HSCs의 비슷한 연구와 그들의 선구자 되었습니다 더 많은 도전. HSCs 과도 과정에서 내 피 hemogenic 라고 알려진 선구자의 인구에서 발생 하는 초기 배아 개발 중으로 조 혈 전환²내 피. 강력 하 고, 장기 이식 조건된 성인 받는 사람에 따라 multilineage engraftment를 제공 하는 그들의 능력에 의해 정의 된 첫 번째 HSC 배아 이날 10.5 (E10.5) murine 태아에 매우 낮은 주파수^{3 이후까지 검색 되지 않습니다.} . 그들의 발전 동안 3300 HSC (pre-HSC) hemogenic 피에서 발생 하는 이식 분석 실험^4,5 에서 효율적인 engraftment 허용 성인 HSC의 속성을 획득 하기 전에 성숙 겪어야 한다 ^{, 6}. 희귀 HSC 기원, 다양 한 erythroid와 조 혈 창시자의 연구를 왜곡 골수성, 림프 잠재력 사전-HSC^7,8에서 HSC의 출현 전에 이미 감지는. 따라서, 다른 조 혈 창시자에서 사전-HSC 구별 방법 clonally 세포를 분리 하 여 이식 분석 실험에서 engraftment 속성을 검색 하기 위해 HSC에 그들의 성숙에 대 한 충분 한 신호를 제공 필요 합니다.

다양 한 접근 HSC에 비보 전 또는 vivo에서 성숙 하 여 사전-HSC의 검출을 허용 하는 기술 되었다. 방법을 ex vivo는 첫 번째 HSC 개발⁹에서 감지 되는 AGM 지역과 같은 배아 조직의 문화에 달려 있었다. 이 방법, 분리, 통합 하는 프로토콜에 정렬, AGM 조직의 재 집계는 허용 파라 대동맥에 E11.5 E9.5에서 개발 하는 동안 HSC 선구자를 포함 하는 정렬 된 인구의 특성 splanchnopleura (P-Sp) / 관련해 지역^4,,510; 그러나, 이러한 방법 클론 분석에 필요한 단일 세포 수준에서 일어나 높은 처리량 분석에 순종 하지 않습니다. 마찬가지로, 신생아 쥐에 이식 하 여 성숙 vivo에서 어디는 microenvironment HSC 선구자의 초기 단계 지원을 위해 더 적합 한 것으로 추정 되는 또한 활성화 노른자위 sac 및 AGM에서 정렬 된 인구의 연구 / P-Sp (P-Sp는 AGM에 선구자 지역) 사전-HSC, 하지만이 방법의 특성을 가진 또한 단일에 대 한 강력한 플랫폼을 제공 하는 실패 세포 분석^11,12.

Rafii 외 에서 연구 보여주었다 그 내 피 세포 Akt 활성화 (EC) 기질 성인 HSC 자체 갱신 생체 외에서^13,,1415의 지원에 대 한 틈새 기질을 제공할 수 있습니다. 우리는 최근 Akt 활성화 EC 관련해 지역 (AGM-EC)에서 파생 된 hemogenic 선구자, E9 성인 engrafting HSC 개발에서 뿐만 아니라 후속 빠르면 절연의 성숙에 대 한 적합 한 생체 외에서 틈새를 제공 한다 결정 생성 된 HSC¹⁶의 자체 갱신. 감안할 때이 시스템 사용 간단한 2 차원 공동 문화, 그것은 개별적으로 고립 된 hemogenic 선구자의 HSC 잠재력의 클론 분석을 위해 쉽게 적응.

우리는 최근 클론 hemogenic 선구자의 HSC 잠재력 AGM-EC 공동 문화 및 이식에서 이후의 기능 분석 murine 배아에서 개별 hemogenic 선구자의 인덱스 정렬 결합 하 여 분석 결과에 대 한 접근을 보고 ¹⁷분석 실험. 인덱스 정렬 세포 형광 활성화의 모드 phenotypic의 모든 매개 변수 (즉, 앞으로 분산형 (FSC-A), 측면 살포 (SSC-A), 형광 매개 변수) 각 개별적으로 정렬된 셀 같은 정렬 (FACS) (인덱스)를 기록 하는이 기능 소급 정렬 다음 후속 기능적 분석 상관 될 수 있다. FACS 소프트웨어 위치/잘 두었다는 96 잘 접시의 각 셀에 대 한 두 phenotypic 정보를 기록 합니다. 이 기술은 이전 우아하게 사용 되었습니다 성인 HSC에서이 확인, 추가 HSC, 장기 engrafting 하위 집합에 대 한 풍부 하 고 연관 HSC의 phenotypic 매개 변수 transcriptional phenotypic 매개 변수 결정 단일 속성 셀 레벨^18,19. 여기, 우리는 배아 개발의 초기 단계 동안 독특한 phenotypic 매개 변수 식별 및 사전-HSC의 혈통 기여를 가능 하 게이 방법의 상세한 방법론을 제공 합니다.