Analyse clonale des précurseurs embryonnaires de cellules souches hématopoïétiques à l’aide de cellule unique Index tri combinée avec Niche de cellules endothéliales co-culture

Clonales études ont révélé une hétérogénéité dans les propriétés à long terme de greffe de CSH adultes, donnant un aperçu nouveau en sous-types HSC et changements dans le comportement HSC au cours du vieillissement¹. Toutefois, des études similaires de CSH embryonnaires et de leurs précurseurs ont été plus difficile. Au début du développement embryonnaire, CSH proviennent d’une population de précurseurs connus hemogenic l’endothélium dans un processus transitoire visé à comme l’endothélium hématopoïétiques transition². Le premier HSC, défini par leur capacité à fournir la greffe multilignée robuste, à long terme, suite à une transplantation en conditionné bénéficiaires adultes, ne sont pas détectées jusqu’après jour embryonnaire 10,5 (E10.5) chez l’embryon de souris, à très basse fréquence³ . Au cours de leur développement, précurseurs des HSC (pre-HSC) découlant de l’endothélium hemogenic doivent être soumis à maturation avant d’acquérir les propriétés de HSC adulte qui permettent une prise de greffe efficace en transplantation essais^{4,5 , 6}. obscurcissant l’étude d’origine rare de HSC, une multitude de progéniteurs hématopoïétiques avec érythroïdes, potentiel myéloïde et lymphoïde sont déjà détectés avant l’émergence du HSC de pre-HSC^7,8. Distinguer pré-HSC des autres progéniteurs hématopoïétiques requiert donc des méthodes pour isoler par clonage des cellules et de leur fournir les signaux suffisants pour leur maturation à HSC, de détecter leurs propriétés de greffe lors d’essais de transplantation.

Plusieurs approches ont été décrits qui permettait de détecter des pré-HSC de maturation en vivo ou ex vivo de HSC. Ex vivo méthodes ont compté sur la culture des tissus embryonnaires, telles que la région de l’AGM, où le premier HSC sont décelées dans développement⁹. S’appuyant sur ces méthodes, protocoles qui incorporent la dissociation, tri et re-agrégation des tissus AGM ont permis la caractérisation des populations triées contenant des précurseurs de l’HSC au cours du développement de E9.5 à E11.5 dans le para-aortique splanchnopleura (P-Sp) / AGM régions^4,5,10; Cependant, ces approches ne sont pas disposés à haut débit analyse des précurseurs au niveau de la cellule unique requis pour l’analyse clonale. De même, in vivo la maturation par greffe sur des souris nouveau-nées, où le microenvironnement est censé mieux convenir à l’appui des premiers stades des précurseurs de l’HSC, a également permis des études de populations triées du sac vitellin et AGM / P-Sp (P-Sp est la région de précurseur à l’AGA) présentant des caractéristiques de pre-HSC, mais ces méthodes aussi ne parviennent pas à fournir une plate-forme robuste simple cellule analyse^11,12.

Études de Mustafa et coll. ont démontré que cette stroma Akt-lancée de cellules endothéliales (EC) peut fournir un substrat de niche pour le soutien des adultes HSC autorenouvellement in vitro^13,14,,¹⁵. Nous avons récemment déterminé que ce Akt-activé, dérivé de la région de l’Assemblée générale annuelle (AGM-EC) prévoit une niche adapté en vitro la maturation des précurseurs hemogenic, isolé dès E9 dans le développement, à faire une exception adulte HSC, ainsi que la suite l’auto-renouvellement de généré HSC¹⁶. Étant donné que ce système utilise une simple culture CO 2 dimensions, il est facilement adaptable pour analyse clonale du potentiel HSC des précurseurs hemogenic isolés individuellement.

Nous avons récemment rapporté une approche pour analyser le potentiel HSC des précurseurs hemogenic clonale en combinant indice tri des précurseurs chimiques individuels hemogenic embryons murins avec co-culture AGM-EC et les analyses fonctionnelles en transplantation des analyses de¹⁷. Index de tri est un mode de fluorescence-lancée de cellules triant (FACS) qui enregistre (index) tous les paramètres phénotypiques (c’est-à-direavant dispersion (FSC-A), côté scatter (SSC-A), fluorescence paramètres) de chaque cellule individuellement trié tel que ces caractéristiques peuvent être rétrospectivement corrélés ultérieures analyse fonctionnelle après tri. FACS logiciel enregistre les deux informations phénotypiques pour chaque cellule et la position/puits de la plaque à 96 puits dans lequel il a été placé. Cette technique a déjà été élégamment utilisée pour identifier l’hétérogénéité adulte HSC, déterminer les paramètres phénotypiques encore enrichissent pour le sous-ensemble après à long terme de HSC et corrèlent phénotypiques paramètres de HSC avec transcription Propriétés sur le single cell niveau^18,19. Ici, nous fournissons une méthodologie détaillée de cette approche qui permet l’identification des paramètres phénotypiques uniques et les contributions de la lignée de pre-HSC durant les premiers stades du développement embryonnaire.