Misura in tempo reale di permeabilità della barriera epiteliale in Organoids intestinale umana

Normale, tessuto intestinale adulto umano de-identificata è stata ottenuta da donatori di organo defunto attraverso il dono della vita, Michigan. Delle cellule di ES umano linea H9 (registro NIH #0062) è stata ottenuta dall’Istituto di ricerca WiCell. Tutto il tessuto umano utilizzato in questo lavoro è stato ottenuto da donatori non-viventi, de-è stato identificato ed è stata condotta con l’approvazione dell’IRB di Università del Michigan (protocollo n # HUM00093465 e HUM00105750). 1. microinjector Setup Ottenere i materiali elencati nella Tabella materiali. Collocare il micromanipolatore, dissezione scope e sorgente luminosa nella biosicurezza armadio. Pulire l’installazione di microiniezione con etanolo al 70% o altro disinfettante prima dell’uso sperimentale. Evitare l’esposizione prolungata ai disinfettanti a base di candeggina, che può corrodere la strumentazione di microinjection.Nota: Un esempio di un assemblaggio completo microinjector è illustrato nella Figura 1. Posizionare l’ambito dissezione in modo che la parte dell’occhio può essere utilizzata attraverso la porta di accesso nello scudo per la biosicurezza. In alternativa, è possibile utilizzare un banco pulito con sistema di flusso di aria positiva al posto di una cappa di biosicurezza con punti di accesso del microscopio. Assemblare il micromanipolatore sul lato destro del microscopio secondo le istruzioni del produttore e regolare in modo che i controlli possono essere facilmente raggiunto e regolati. Il micromanipolatore dovrebbe essere montato su una piastra di ferro oppure stabilizzati.Nota: Gli utenti mancini desideri posizionare il micromanipolatore a sinistra dell’ambito per dissezione. Montare il supporto di una micropipetta al braccio micromanipolatore e collegare il tubo analogico inserendo il titolare di una micropipetta. Riempire la siringa di vetro da 10 mL con circa 5-7 mL di olio minerale sterile. Collegare la siringa di vetro 10 mL riempita con olio minerale all’estremità aperta del tubo analogico utilizzando il meccanismo di blocco Luer. Posizionare la siringa di vetro a sinistra dell’ambito per dissezione, fronte dal micromanipolatore. Premere delicatamente la siringa, spingendo l’olio minerale attraverso il tubo. Circa 10 gocce di olio minerale a filo dalla punta del titolare micropipetta e raccogliere in una capsula di Petri o recipiente simile e scartare.Nota: Questo passaggio rimuove tutta l’aria dal tubo e deve essere eseguito prima di ogni sessione di microiniezione. 2. preparazione per il microinjection 24 h prima microiniezione: Preparare soluzione del dextrano FITC sospendendo ri-destrano FITC ad una concentrazione di 2 mg/mL in PBS sterile o soluzione fisiologica. Preparare un volume totale di > 250 µ l.Nota: Concentrazioni superiori o inferiori di FITC-Destrano possono essere utilizzate, che vanno da circa 0,1 – 10 mg/mL. Regolare la concentrazione di FITC-Destrano per soddisfare a valle l’applicazione di imaging. Installazione organoid culture su 4 o 8 pozzetti vetrini da camera o altro vaso di coltura adatto per vivono microscopia, con fino a 4-6 HIOs per pozzetto, incorporato nella soluzione di 50 µ l cella matrix e coltivate in EGF, Noggin e R-Spondin (ENR) fattore di crescita media 19 ,24. Prendersi cura per lo spazio il organoids uniformemente (distanza di circa 5 mm) per evitare la cattura di HIOs multipli in un singolo campo microscopico durante l’analisi di formazione immagine in tempo reale. Per una guida completa alla cultura HIO e manutenzione vedere McCraken et al. 24.Nota: Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando cellule staminali derivate HIOs e i risultati rappresentativi (Vedi sotto) dimostrano l’uso di questo modello di coltura del tessuto. Tuttavia, lo stesso protocollo si adatta facilmente a organoids epiteliali intestinali tessuto-derivato15,29. Tessuto-derivato HIOs sono in genere più piccoli di HIOs PSC-derivato e mancanza il supporto mesenchymal basolaterale delle cellule struttura15,29,30. Microiniezione di HIOs tessuto-derivato può richiedono un maggior grado di capacità tecnica ed esperienza. Il grado a cui dati di permeabilità di barriera epiteliale ottenuti utilizzando tessuto-derivato HIOs possono correlare con HIOs hPSC-derivato è sconosciuto. Incubare HIOs in un’incubatrice di coltura cellulare standard a 42 ° C e 5% di CO2 prima microiniezione. 30 minuti prima di microiniezione, accendere la biosicurezza armadietto e alzare lo scudo di vetro per l’altezza di lavoro ottimale. Rimuovere tutti gli elementi inutili dalla cappa di biosicurezza. Disordine aumenta il rischio di cadute o altri incidenti quando si lavora in spazi ristretti. Spray e pulire accuratamente la superficie di lavoro con etanolo al 70% o altro disinfettante. Pulire utilizzando un tovagliolo di carta. Controllare il livello dell’olio minerale nella siringa di vetro attaccata al microinjector. Se c’è meno di 3 mL di olio minerale restanti, svitare la siringa e riempite nuovamente dentro la cappa di biosicurezza, facendo attenzione ad evitare l’introduzione di bolle. Non riempire più di 7 mL. Accendere la lampada per illuminare il campo di applicazione per dissezione. Regolare l’oculare per il comfort personale. Posizione il micromanipolatore a destra del campo di applicazione per dissezione. Fissare il micromanipolatore ad una piastra di ferro utilizzando un supporto magnetico. Interruttore magnetico stand sulla posizione OFF per regolare la posizione del micromanipolatore e fissare il supporto alla piastra di ferro impostando il supporto magnetico in posizione on. Microcapillary installazione Recuperare un filamento di vetro singolo 1 mm dal contenitore di deposito fornito dal produttore. Inserire il filamento di vetro attraverso il centro della bobina di rame riscaldamento dell’estrattore della micropipetta.Nota: Vedere la Figura 2 per una guida alla preparazione la levetta della micropipetta. Posizionare il filamento in modo che la bobina di rame del riscaldamento è circa a metà il filamento di vetro. Questo farà sì che l’estrattore genera due aghi di microinjection utilizzabile da ogni filamento di vetro. Fissare il filamento di vetro con i morsetti avvitando la parte superiore morsetto prima, assicurandosi che il filamento di vetro è protetto all’interno del boschetto dentellato per prevenire rotture. Estendere il braccio estrattore in posizione verticale massima prima di serrare il morsetto inferiore.Nota: Questo passaggio è essenziale. Caso di estendere completamente il braccio estrattore comporterà irregolare separazione delle due sezioni del filamento di vetro. Controllare le impostazioni per il riscaldamento e tirando il meccanismo.Selezionare calore #1 con il cavicchio (990) e impostare PULL a 059 (Figura 2). Accendere l’apparecchio utilizzando l’interruttore On/Off. Chiudere la visiera di protezione in plexiglass e premere il pulsante di tirare sulla faccia di destra inferiore dell’estrattore. La bobina di rame comincia a riscaldarsi e si illumina di arancione brillante. Quando la temperatura sale, il filamento di vetro inizierà ad allungare e finalmente separare. Sulla separazione delle due estremità del filamento di vetro, lo strumento si spegnerà.Nota: La bobina di rame rimarrà estremamente calda per alcuni minuti. Il filamento di vetro tirato verrà essere denominato un ‘microcapillary’ da questo punto in avanti nel protocollo. Facendo attenzione a non toccare la bobina di rame, rimuovere uno dei microcapillari vetro. Il microcapillary dovrebbe avere un punto molto bene. Gestire la microcapillary attentamente con guanti in lattice o nitrile e dirigersi immediatamente verso l’armadietto di biosicurezza che contiene il programma di installazione di microinjector.Nota: Il vetro microcapillary è estremamente nitide e molto fragile. Maneggiare con cura. Allentare il tappo di estremità del braccio micromanipolatore. Inserire l’estremità smussata della microcapillary tirato nell’estremità aperta del titolare micropipetta e spingerlo verso l’interno finché si ferma. L’estremità smussata di microcapillary al braccio micromanipolatore serrando nuovamente il cappuccio terminale.Nota: Quando si installa il microcapillary sul sistema di microiniezione fare attenzione a non toccare l’estremità affilata. Questo ridurrà la probabilità di contaminazione e preservare il punto di fine per il microinjection. Fallimento per proteggere in modo efficace il microcapillary può causare instabilità o rottura del filamento di vetro durante la microiniezione. Aprire la punta di microcapillary il vetro. Durante la preparazione del microcapillary vetro tirato, il suggerimento del punto probabilmente si scioglierà in modo da sigillare l’estremità appuntita del microcapillary. Per rimuovere questo blocco: Posizionare il micromanipolatore in modo tale che il microcapillary è puntato verso il basso nella fase di vetro dell’ambito dissezione senza toccare la superficie. Trovare una superficie di plastica sterile (la parte inferiore del coperchio di cottura cultura funziona perfettamente) e posizionarlo sul palco microscopio direttamente sotto l’ago microcapillary sul palco dell’ambito per dissezione. Centro la punta di microcapillary sotto l’area di visualizzazione e assicurarsi che sia visibile quando si guarda attraverso l’oculare del microscopio sotto 1,5 ingrandimenti. Utilizzando i controlli di micromanipolatore, far avanzare lentamente il braccio di micromanipolatore e microcapillary verso il coperchio di plastica sterile cultura fino a che la punta tocchi appena la superficie di plastica e la punta della microcapillary si libera.Nota: Obiettivo per il più piccola possibile rottura che consente di flusso del fluido dal filamento di vetro al fine di minimizzare il danno per il HIO durante la microiniezione. Eseguire microcapillary lontano dalla superficie sterile per minimizzare il rischio di rotture accidentali prima di procedere. Verifica la microcapillary per flusso premendo la siringa di vetro, spingendo l’olio minerale attraverso il tubo. Se è stato aperto alla fine del microcapillary vedrete una piccola goccia di olio minerale emergono dalla punta della microcapillary dopo pochi secondi. Se ciò non accade, ripetere il passaggio precedente e ripetere il test. 3. sterile Microinjection Nota: Una volta che il microcapillary è stato preparato, installato e testato, iniziano microinjecting HIOs. La figura 3 illustra un HIO di tessuto-derivato è stato iniettato con successo con FITC-Destrano. Riempire il microcapillary con il materiale di iniezione. Immergere la punta della microcapillary di vetro la sospensione di iniezione del dextrano FITC, facendo attenzione a evitare di rompere la punta del microcapillary contro i lati o il fondo della provetta. Una volta che la punta della microcapillary è immerso nella soluzione, tirare indietro la siringa di olio minerale per attirare circa 10 µ l della sospensione di destrano FITC verso il microcapillary.Nota: Si consiglia di utilizzare provette da 1,5 mL o 0,5 mL per l’iniezione di soluzioni/culture poiché saranno più facilmente accessibile per il microcapillary installato. In alternativa, iniezione soluzioni si possono trarre da una capsula di Petri sterile o parafilm sterile, che può ridurre la probabilità della ferita di sharps limitando la necessità di contenere un tubo in prossimità della microcapillary. Se la sospensione è altamente viscosa o l’apertura della microcapillary è eccezionalmente piccolo, potrebbe richiedere diversi secondi per riempire il microcapillary. Non disegnare sospensioni microiniezione nel tubo plastica microiniezione come questo potrebbe contaminare il sistema di microiniezione intero. Smettere di riempire il microcapillary quando la sospensione di microiniezione riempie il 90% della lunghezza del microcapillary vetro. Premere leggermente la siringa prima di ritirare il microcapillary dalla soluzione microiniezione per assicurarsi che la punta della microcapillary non contenga sacche di aria.Nota: Se l’esame della microcapillary rivela tasche d’aria, svuotare e riempire nuovamente. Rimuovere le piastre di coltura HIO dall’incubatrice della coltura cellulare e trasferimento per la biosicurezza con il microinjector. Rimuovere il coperchio dalla piastra di coltura di HIO all’interno della cappa di biosicurezza e centrare il primo pozzo sul tavolino del microscopio in modo che è chiaramente visibile attraverso l’oculare dell’ambito con l’impostazione di ingrandimento più basso. Girare il braccio di micromanipolatore tale che il microcapillary è puntato verso il basso nella cultura HIO bene ad angolo > 45° rispetto allo stage di microscopio. Ciò avviene più facilmente ruotando manualmente il gruppo braccio micromanipolatore sull’asse orizzontale nel punto dove il supporto del braccio orizzontale micromanipolatore incontra il supporto verticale, poiché i controlli bene (quadranti neri) hanno una gamma limitata di movimento. Posizionare la punta del microcapillary sopra la prima cultura bene a circa 1 cm sopra la superficie del supporto (Figura 3A). Un’immagine rappresentativa dimostrando microinjection dei organoids epiteliali intestinali tessuto-derivato è mostrata nella Figura 3B. Verifica che sia la punta del filamento di vetro e il HIO(s) sono visibili attraverso l’oculare. Riposizionare se necessario. Far avanzare lentamente il microcapillary ruotando in senso orario la manopola di controllo dell’asse z.Nota: A giudicare la posizione della punta della microcapillary, in particolare la profondità, richiede pratica. Come la punta viola la superficie del supporto, notare una leggera distorsione visiva della punta microcapillary.Procedere con attenzione da questo punto per evitare di rompere il microcapillary contro il fondo della piastra di coltura o danneggiare il HIOs. Perforare il HIO con la punta di microcapillary. La superficie esterna della HIO sarà premere leggermente come il microcapillary comincia a esercitare una pressione e pop tornare in forma come la punta penetra il lume. Può essere difficile identificare la punta di microcapillary all’interno del lumen HIO. Regolare le impostazioni di illuminazione o ingrandimento dell’ambito dissezione se c’è difficoltà a vedere il microcapillary. Rimuovere le mani dai controlli micromanipolatore quando il microcapillary è posizionato correttamente con la punta di microcapillary vicino al centro della HIO. Deprimere la siringa olio minerale leggermente per spingere la soluzione di microiniezione fuori il microcapillary e nel lume HIO. Il HIO può espandere leggermente per accogliere il volume di iniezione.Nota: fare attenzione per evitare di riempire eccessivamente il HIO ciò causerebbe la organoid scoppiare. Come regola generale, qualsiasi espansione visibile del volume HIO significa che è il momento di smettere. Il volume medio del lume HIO maturo è di circa 1 µ l, ma può variare significativamente. Automatizzato siringa pompe possono essere utilizzate in sostituzione di una siringa manuale per consentire un controllo accurato del volume iniettato. Ritirare il microcapillary da HIO utilizzando il controllo dell’asse z e la posizione sopra la superficie del supporto. Spostare la prossima destinazione HIO con microcapillary posizionato sopra il media per evitare danni accidentali per la HIOs durante la manovra e iniettare in modo simile (vedere passaggi 3.6-3.11). Riempire il microcapillary utilizzando l’approccio descritto in precedenza.Nota: Se la punta si rompe in qualsiasi punto durante la microiniezione, non tentare di continuare le iniezioni. Cambiare la punta secondo le istruzioni riportate di seguito. Modificare il microcapillary fra i trattamenti o in caso di rottura. Allentare il morsetto all’estremità del braccio micromanipolatore e rimuovere il microcapillary dal supporto micropipetta.Attenzione: Non maneggiare il microcapillary vicino l’estremità appuntita. Il punto di fine della microcapillary è estremamente forte e sarà facilmente puntura della pelle e guanti. Prestare attenzione ed essere consapevoli di tutti i movimenti, movimentazione microcapillary utilizzando il manipolatore solo e mai mettere le mani tra il punto della microcapillary e le culture HIO. Cercare il trattamento medico immediatamente in caso di un bastone di ferro da un microcapillary contenenti agenti infettivi o tossine.Nota: In alcuni casi, potrebbe essere difficile da confermare visivamente successo microiniezione di HIO. La visibilità delle sospensioni di microiniezione chiaro può essere migliorata mediante uso di aggiunta di più alte concentrazioni di FITC-Destrano. 4. pharmacological Treatment of HIOs Per testare composti consegnati all’epitelio apicale, risospendere in PBS sterile contenente 2 mg/mL FITC-Destrano e microinject nel lumen HIO come indicato sopra (sezione 3). Per l’esperimento rappresentativo, risospendere tossina di Clostridium difficile TcdA a 12,8 ng / µ l in PBS contenente FITC-Destrano. Per testare composti consegnati al comparto basolaterale, sostituire i supporti esterni di cultura con i nuovi media contenente 2 mM glicole etilenico-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-acido etilendiamminotetraacetico (EGTA)(positive control), veicolo di PBS da solo (controllo negativo ), o altro composto sperimentale dopo microiniezione di FITC-Destrano.Nota: Il dosaggio e la tempistica dell’applicazione di composti farmacologici, tossine o altri agenti può variare secondo la questione sperimentale. 5. live Imaging dei Organoids iniettati Iniziare dal vivo imaging microiniezione immediatamente seguente. Trasferire le piastre di coltura di un microscopio a fluorescenza dotato di una camera umidificata mantenuta a 37 ° C e 21% O2 e 5% CO2 con una cellula viva automatizzata sistema di imaging. Chiudere la camera ambientale e avviare il processo di imaging. Avviare il software di analisi di immagine (ad esempio, softWoRx) dal desktop. Fare clic su “File” e selezionare “Acquire (Resolve 3D)” per inizializzare l’imaging e software di controllo del microscopio. Impostata eccitazione/emissione FITC (475 nm eccitazione/523 nm emissione), impostare la potenza di trasmissione al 5% e la lente a 4x. Impostare il tempo di esposizione a 0,025 ms (Figura 4A).Nota: Il tempo di esposizione dovrebbe essere variata per soddisfare la forza del segnale fluorescente. In generale, il segnale di fluorescenza di FITC solo diminuirà. Quindi, per garantire la massima sensibilità, i tempi di esposizione iniziale dovrebbero essere regolati, tale che il segnale fluorescente registrato è appena sotto il punto di saturazione della fotocamera e software di imaging. Trovare il HIOs con un ingrandimento 4x utilizzando il controller digitale collegato al microscopio. Centro HIO entro la visualizzazione campo (Figura 4A). Fare clic su “Visualizza” sulla barra degli strumenti e selezionare “Punto elenco” per rivelare una nuova finestra. Fare clic su “Punto” per memorizzare la posizione corrente della fase nell’apposito elenco (Figura 4A). Ripetere i passaggi 5.4 e 5.5 sono state registrate le posizioni di tutti i HIOs. Utilizzando un blocco note o un record digitale, annotare il numero di ID univoco assegnato a ciascuna posizione programmata microscopia e le immagini catturate in quella posizione. I file di immagine saranno contrassegnati con questo numero di ID e sarà importante associare i numeri di ID di immagine con HIOs e trattamenti specifici al termine della raccolta dei dati. Per impostare la raccolta automatizzata di immagine, fare clic su “File” e poi “Esperimento” nella barra degli strumenti. Nome l’esperimento con la data o un altro nome univoco. Impostare i parametri per la raccolta di immagini passando attraverso ciascuna delle schede opzione come mostrato in Figura 4B. Deseleziona “Z sezionamento” sotto la scheda “Sezionamento”. Sotto la scheda “Canali”, immettere i parametri dalla finestra superiore sinistro “risolvere 3D”. Per risparmiare tempo, la prima riga popolerà automaticamente quando la casella a sinistra nella controllata. Sotto la scheda ‘ time-lapse “, selezionare la casella di controllo”Time lapse”e immettere l’intervallo di tempo tra le immagini della riga contrassegnata come”Time-lapse”e la durata totale dell’esperimento della riga contrassegnata come”Tempo totale”. Il software calcolerà automaticamente il numero di intervalli di tempo. Sotto la scheda “Punti”, la casella denominata “Visita punto elenco”.Si possono anche inserire manualmente i numeri di punto specifico da includere nell’esperimento digitando nella casella di testo. Non modificare le opzioni predefinite sotto le linguette “Pannelli” o “Azioni”. Clicca sulla scheda “Run”, immettere la data dell’esperimento nella casella denominata “nome del file immagine” e impostata i dati di salvataggio posizione sotto “Impostazioni”. Fare clic sulla freccia verde per eseguire la macro di esperimento. Un contatore di lasso di tempo terrà traccia dei progressi sperimentali. Alla fine del corso tempo pianificato, esportare e salvare tutti i file immagine come immagini TIFF RGB a 24 bit (Figura 4). Sulla barra degli strumenti, selezionare processo seguito dal generatore di attività. Nel menu Generatore di attività, è possibile aggiungere file accedendo alla cartella dati specificata in 5.9. Evidenziare tutti i file che terminano in “DV” digitando “*.dv” nel prompt. Seleziona tutto (Ctl + A) e fare clic su “Aggiungi”. Clicca su + sotto la sezione denominata “Attività”. Selezionare “Esporta come…” e fare clic sulla scheda “Opzioni”. Set “Formato di esportazione” a “Immagini TIFF” e la casella qui sotto per aggiungere un “Custom Output Folder”. Questa è la posizione dove verranno esportate le immagini TIFF. Selezionare RGB a 24 bit sotto “Tipo di output TIFF” e fai clic su “Fine”. Fare clic su “Invia a coda” per eseguire la Macro di esportazione. Copiare le immagini TIFF esportate in 5.11 a un server o un driver esterno, se si prevede di eseguire l’analisi post-imaging (sezione 6) su un computer diverso.Nota: Il tessuto HIO e media può essere conservato per l’istologia34, PCR35), Western blot36, o altre analisi a valle. 6. post-analisi di imaging Assicurarsi che ImageJ37 è installato e funziona correttamente sul computer per essere utilizzato per l’analisi.Nota: Fiji37 è una distribuzione alternativa del programma core ImageJ che funzionerà altrettanto bene per questa analisi. Avviare l’analisi batch selezionando “Processo” e poi “Batch” e infine “Macro” dal menu di ImageJ. Impostare l’ingresso alla directory contenente le immagini TIFF raccolte durante il corso di tempo sperimentale. Aprire il file di macro di ImageJ “thesholdmeasure.ijm” o direttamente copia e incolla il codice di macro nella finestra. Fare clic su “Processo” per iniziare l’elaborazione dei file.Nota: Il valore di soglia minima x (setThreshold(x,255);) può essere impostata su qualsiasi numero da 0 – 255 e deve essere regolato in modo da eliminare la fluorescenza di fondo. Valori < 100 sono raccomandati. Per determinare empiricamente il valore di soglia appropriata, è possibile eseguire la macro imaging su una singola immagine che rappresenta un organoid con nessun segnale fluorescente. L’intensità media di questa immagine può servire come una guida per impostare la soglia in modo appropriato. Per l’analisi rappresentativa presentate di seguito, la soglia è stata impostata su “42”. ImageJ produrrà una grande tabella che contiene l’area di tutti i pixel all’interno della gamma di intensità di soglia, e la media, mediana, minimo e intensità massima (limite) di valore per l’area entro i limiti di intensità di soglia. Salvare questo come un CSV o XLS. Cambiamento di intensità nel corso del tempo può essere computata in un foglio di calcolo39 manipolando la tabella dati per eseguire il calcolo qui sotto o possa essere automatizzati utilizzando un adatto linguaggio di programmazione. Uno script di analisi di esempio scritto in R 40 è dotato di questo manoscritto.Nota: Per ogni HIO, l’intensità di fluorescenza relativa può essere quantificata come . Eliminazione tempo 41 (t1/2) quello di FITC-Destrano nel lume HIO è stato calcolato come segue: In primo luogo, calcolare il “area sotto la curva” (AUC) dalla curva che descrive l’intensità di fluorescenza relativa nel tempo (t) come: Quindi, calcolare la “clearance” () tasso con il volume di distribuzione (Vd) definito come 1 per la fluorescenza normalizzata a t = 0: A questo punto, definire la “costante di velocità di eliminazione” () come: E infine, calcolare il “tempo di eliminazione” (t1/2) come: L’equazione ridotta è così: