Реальном времени измерения проницаемости эпителиальных барьер в человека кишечные Organoids

Нормальный, обезличенных кишечных тканей человека взрослых был получен от умерших доноров через Дар жизни, штат Мичиган. Человека ES клеток линии H9 (низ реестра #0062) была получена из WiCell научно-исследовательский институт. Все человеческие ткани, используемые в этой работе была получена из неживых доноров, де была определена и проводилось с согласия IRB Мичиганского университета (протокол # HUM00093465 и HUM00105750). 1. microinjector установки Получите материалы, перечисленные в Таблице материалов. Место микроманипулятор, рассечения объем и источник света в биобезопасности кабинета. Очистите микроинъекции установки с 70% этанол или других дезинфицирующих до экспериментального использования. Избегайте длительного воздействия дезинфицирующих средств, содержащие отбеливатель, который может разъедать оборудование микроинъекции.Примечание: На рисунке 1приведен пример полного microinjector Ассамблеи. Положение области рассечения так что глаз кусок может использоваться через порт доступа в щит для кабинета биобезопасности. Попеременно используйте чистый скамейке с позитивные воздуха потока системы вместо биобезопасности, кабинет с точками доступа Микроскоп. Соберите микроманипулятор на правой стороне микроскопа согласно инструкциям производителя и таким образом, чтобы элементы управления можно легко добраться и скорректированы. Микроманипулятор следует быть смонтированы на железной плите или иначе стабилизировалась.Примечание: Левша пользователям может потребоваться место микроманипулятор слева от области рассечения. Смонтировать держатель микропипеткой микроманипулятор руку и подключить аналоговый труб, вставив его в держатель микропипеткой. Заполните шприц 10 мл стекла с приблизительно 5-7 мл стерильного минерального масла. Подключение 10 мл шприц стекла, заполнены с минеральным маслом для открытого конца аналоговый труб с помощью механизма блокировки Luer. Место стеклянный шприц слева от области рассечения, напротив от микроманипулятор. Осторожно отожмите шприц, толкая нефтепродуктов через трубку. Флеш примерно 10 капель минерального масла от кончика микропипеткой держателя и собирать в чашке Петри или аналогичных судна и отбросить.Примечание: Этот шаг удаляет все воздуха из шланга и должны быть выполнены перед каждой сессии микроинъекции. 2. Подготовка микроинъекции за 24 часа до микроинъекции: Готовят раствор декстрана FITC приостановив повторно FITC декстрана в концентрации 2 мг/мл в стерильного физиологического раствора или PBS. Подготовить общий объем > 250 мкл.Примечание: Выше или ниже концентрации FITC-декстран может использоваться, начиная от приблизительно 0,1 – 10 мг/мл. Отрегулируйте концентрацию FITC-декстрана в соответствии по течению визуализации приложений. Установка органоид культур на 4 – или 8-Ну стекло камеры слайды или другие культуры судно подходит для жить микроскопии, до 4-6 HIOs за Ну, встроенных в 50 мкл ячейки матрицы решения и культивировали в EGF, льют и R-Spondin (ENR) фактор роста СМИ 19 ,24. Позаботьтесь, чтобы пространство organoids равномерно (примерно 5 мм друг от друга) во избежание захвата нескольких HIOs в одном микроскопическом поле во время анализ изображений в реальном времени. Полное руководство по HIO культуры и поддержания см МакКрекен et al. 24.Примечание: Этот протокол был разработан с использованием стволовых клеток, полученных HIOs и представитель результаты (см. ниже) демонстрируют использование этой модели культуры ткани. Однако тот же протокол легко адаптируется к ткани производные кишечного эпителия organoids15,29. Ткани производные HIOs, обычно меньше, чем PSC-производные HIOs и отсутствие поддержки мезенхимальных базолатеральной клеток структура15,29,30. Микроинъекции ткани производные HIOs может потребовать большей степени технические возможности и опыт. Степени, к которому эпителиальных барьер проницаемости данных, полученных с помощью ткани производные HIOs может коррелировать с hPSC производные HIOs неизвестно. Инкубируйте HIOs в инкубатор культуры стандартной ячейки на 42 ° C и 5% CO2 до микроинъекции. 30 минут до микроинъекции, включите биобезопасности кабинета и поднять щит стекла на оптимальную рабочую высоту. Удалите все ненужные элементы из кабинета биобезопасности. Беспорядок увеличивает риск разливов или других несчастных случаев при работе в замкнутых пространств. Спрей и тщательно очистите рабочую поверхность с 70% этанол или других дезинфицирующих средств. Протрите чистой, с использованием бумажным полотенцем. Проверьте уровень минерального масла в шприц стекла придает microinjector. Если есть меньше чем 3 мл оставшихся минерального масла, отвинтить шприц и пополнить внутри шкафа, стараясь избегать введения пузыри биобезопасности. Заполнять не более чем 7 мл. Включите лампу для освещения рассечения сферы. Отрегулируйте окуляр для личного комфорта. Позиция микроманипулятор справа от области рассечения. Закрепите микроманипулятор для железной пластине с помощью магнитного стенд. Магнитного стенд переключатель в положение OFF, чтобы отрегулировать положение микроманипулятор и закрепите подставку для утюга, установив магнитного стенд в положение ON. Микрокапиллярной установка Получить один 1 мм стекловолокном из контейнера хранения, предоставляемых производителем. Вставьте стекловолокном через центр медной Отопление катушки микропипеткой съемник.Примечание: Для руководства по подготовке микропипеткой съемник рис. Положение нити накала, таким образом, чтобы медь Отопление катушки примерно в середине стекловолокном. Это будет гарантировать, что провокатор генерирует два полезная микроинъекции иглы от каждого стекловолокном. Безопасные стекла накаливания с помощью струбцины, затянув верхней зажим во-первых, убедившись, что стекловолокном обеспечивается в рамках зубчатый рощу, чтобы предотвратить поломки. Расширение съемник руку в ее максимально вертикальном положении перед затягиванием зажим снизу.Примечание: Этот шаг имеет важное значение. Неспособность полностью расширить руку съемник приведет к нерегулярные разделения этих двух секций стекловолокном. Проверьте настройки на отопление и потянув механизм.Выберите тепла #1 с переключателем (990) и задайте ТЯНУТЬ на 059 (рис. 2). Включите инструмент, с помощью переключателя вкл/выкл. Закройте щита защитные Плексиглас и нажмите кнопку ТЯНУТЬ на нижней правой лицо провокатор. Катушка медная начнет нагреваться и будет светиться ярко-оранжевый. Как температура поднимается, стекловолокном начнет растягиваться и в конечном итоге разделить. После разделения двух концах стекловолокном будет выключить прибор.Примечание: Медные катушки останется очень горячий в течение нескольких минут. Вытащил стекловолокном будет называться «микрокапиллярной» с этого момента в протоколе. Будьте осторожны, не прикасайтесь к медной катушки, удалить один из microcapillaries стекла. Микрокапиллярной должны иметь точки очень хорошо. Ручка микрокапиллярной тщательно с латексом или нитриловые перчатки и немедленно приступить к биобезопасности кабинета, содержащие microinjector установки.Примечание: Микрокапиллярной стекло очень острые и очень хрупкие. Обращаться с осторожностью. Отвинтите колпачок микроманипулятор руку. Вставить в открытый конец держателя микропипеткой тупой конец вытащил микрокапиллярной и нажимаем ее внутрь до его остановки. Закрепите тупой конец микрокапиллярной на руке микроманипулятор, снова затянув крышки.Примечание: При установке микрокапиллярной на системе микроинъекции заботиться, чтобы не прикасайтесь заостренный конец. Это уменьшит вероятность загрязнения и сохранить точку штрафа для микроинъекции. Неспособность правильно защитить микрокапиллярной может привести к нестабильности или обрыва нити стекла во время микроинъекции. Откройте кончик стекла микрокапиллярной. Во время подготовки вытащил стекла микрокапиллярной кончик точки скорее всего будет таять в таким образом, чтобы запечатать острый конец микрокапиллярной. Чтобы удалить эту блокировку: Расположите микроманипулятор, таким образом, что микрокапиллярной указывает вниз на стадии стекла рассечения сферы не касаясь этой поверхности. Найти стерильную пластиковую поверхность (в нижней части крышки плиты культуры работает отлично) и поместите его на микроскопа непосредственно под микрокапиллярной иглы на сцене рассечения сферы. Центр кончик микрокапиллярной под области просмотра и убедитесь, что она видна при взгляде через окуляр микроскопа до 1.5 X увеличение. С помощью элементов управления микроманипулятор, медленно заранее микроманипулятор руку и микрокапиллярной к крышке стерильных пластиковых культуры, до тех пор, пока кончик едва контакты пластиковой поверхности и кончик микрокапиллярной вырывается.Примечание: Цель для маленьких возможного перерыва, который позволяет для потока жидкости из стекла накаливания для того, чтобы свести к минимуму ущерб, причиняемый HIO во время микроинъекции. Назад микрокапиллярной от поверхности стерильных свести к минимуму вероятность случайного обрыва перед продолжением. Проверьте микрокапиллярной для потока путем отжимать стеклянный шприц, толкая нефтепродуктов через трубку. Если был открыт в конце микрокапиллярной вы увидите небольшой капли нефтепродуктов возникают от кончика микрокапиллярной через несколько секунд. Если этого не произойдет, повторите предыдущий шаг и повторного тестирования. 3. стерильный микроинъекции Примечание: После того, как микрокапиллярной подготовлен, установлены и испытаны, начните microinjecting HIOs. Рисунок 3 показывает ткани производные HIO который были успешно введены с FITC-декстрана. Заполните микрокапиллярной с инъекционного материала. Погрузите кончик стекла микрокапиллярной в FITC декстрана инъекции подвеска, стараясь избежать нарушения кончик микрокапиллярной против стороны или нижней части трубки. После того, как кончик микрокапиллярной погружен в раствор, тяните обратно на минеральное масло шприцем привлечь около 10 мкл суспензии декстрана FITC в микрокапиллярной.Примечание: Рекомендуется использовать 1,5 мл или 0,5 мл трубки для инъекций решения/культур, так как они будут наиболее легко доступны для установленных микрокапиллярной. Кроме того инъекции, что решения могут быть извлечены из стерильных Петри или стерильной парафина, который может уменьшить вероятность травмы колюще-режущие предметы, ограничивая необходимость держать трубку в непосредственной близости к микрокапиллярной. Если приостановление высоковязких или открытие микрокапиллярной исключительно мала, это может занять несколько второй для заполнения микрокапиллярной. Не рисовать микроинъекции суспензий в микроинъекции пластиковых труб, как это может загрязнить весь микроинъекции системы. Остановите заполнение микрокапиллярной когда подвеска микроинъекции заполняет 90% от длины микрокапиллярной стекла. Слегка отожмите шприца до снятия микрокапиллярной от микроинъекции решение, чтобы убедиться, что кончик микрокапиллярной не содержит карманы воздуха.Примечание: Если изучение микрокапиллярной показывает карманы воздуха, пустые и повторного заполнения. Удалите знаке культуры HIO из инкубатора культуры клеток и передачи биобезопасности кабинет с microinjector. Снимите крышку с плиты HIO культуры в рамках кабинета биобезопасности и центр первой скважины на сцене Микроскоп, так что это ясно видны через окуляр сферы на самом низком настройки масштаба. Поверните руку микроманипулятор, таким образом, что микрокапиллярной указывает вниз в культуру HIO хорошо под углом > 45° по отношению к микроскопа. Легче всего это достигается поворотом вручную микроманипулятор кронштейна на горизонтальной оси в точке, где поддержка arm горизонтальных микроманипулятор соответствует вертикальной стойке, так как штраф контроль (Черные циферблаты) имеют ограниченный спектр движение. Расположите наконечник микрокапиллярной выше первой культуры в примерно в 1 см над поверхностью СМИ (рис. 3A). Представитель изображение, демонстрируя микроинъекции ткани производные кишечного эпителия organoids показан на рисунке 3B. Проверьте, что кончик стекла накаливания и HIO(s) видны через окуляр. Повторно наложите при необходимости. Заранее микрокапиллярной медленно поворачивая ручку управления z-оси по часовой стрелке.Примечание: Судя положение кончика микрокапиллярной, особенно глубины, требует практики. Как отзыв нарушает поверхности средств массовой информации, обратите внимание на небольшие визуальные искажения кончик микрокапиллярной.Перейти с осторожностью, с этого момента, чтобы избежать нарушения микрокапиллярной против нижней части плиты культуры или повреждения HIOs. Проколоть HIO с микрокапиллярной кончиком. Внешняя поверхность HIO будет угнетать слегка микрокапиллярной начинает применять давление и будет поп обратно в форму, как кончик проникает люмен. Это может быть трудно определить кончик микрокапиллярной в пределах HIO люмен. Настройки освещения или увеличение охвата рассечения если есть сложности, видя микрокапиллярной. Удалите руки от контроля микроманипулятор когда микрокапиллярной правильно с кончика микрокапиллярной вблизи центра HIO. Отожмите минеральное масло шприцем слегка добиваться решения микроинъекции из микрокапиллярной и в просвете HIO. HIO может слегка расширяться, чтобы вместить объем инъекции.Примечание: позаботьтесь, чтобы избежать чрезмерного заполнения HIO как это вызовет органоид лопнуть. Как правило любой видимый расширение объема HIO означает, что пришло время прекратить. Средний объем Зрелые HIO просвета находится примерно в 1 мкл, но могут значительно отличаться. Автоматизированная шприц, насосы могут быть использованы вместо ручной шприц для точного управления вводится тома. Снять микрокапиллярной от HIO, используя элемент оси z и позиции над поверхностью средств массовой информации. Перемещение к следующей цели HIO с микрокапиллярной, расположенную над СМИ, чтобы избежать случайного повреждения HIOs во время маневрирования и придать подобным образом (см. шаги 3.6-3.11). Пополнение микрокапиллярной, используя описанный выше подход.Примечание: Если кончик влезает в любой момент во время микроинъекции, не пытайтесь продолжать инъекции. Измените кончик согласно приведенным ниже инструкциям. Измените микрокапиллярной между процедурами или в случае поломки. Ослабьте зажим на конце микроманипулятор руку и удалить микрокапиллярной из держателя микропипеткой.Предостережение: Не прикасайтесь микрокапиллярной вблизи острым концом. Тонкой точке микрокапиллярной чрезвычайно острые и будет легко прокола перчатки и кожи. Осторожность и быть в курсе всех движений, обработка микрокапиллярной, с помощью манипулятора, только и никогда не поставив руки между точкой микрокапиллярной и HIO культур. Обратиться за медицинской помощью сразу в случае иглой от микрокапиллярной, содержащие инфекционных агентов или токсинов.Примечание: В некоторых случаях, это может быть трудно визуально подтвердить успешное HIO микроинъекции. Видимость ясно микроинъекции суспензий повышается путем использования помимо повышенных концентраций FITC-декстрана. 4. медикаментозное лечение HIOs Для проверки соединений, доставлены в апикальной эпителия, Ресуспензируйте в стерильных PBS, содержащий 2 мг/мл FITC-декстран и microinject в HIO люмен, как указывалось выше (раздел 3). Для представителя эксперимента Ресуспензируйте Clostridium difficile токсин TcdA в 12,8 нг/мкл в PBS, содержащих FITC-декстрана. Для проверки соединений, доставлены в отделение базолатеральной, заменить внешний носитель культуры нового носителя, содержащего 2 мм этиленгликоля bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-tetraacetic кислота (EGTA)(positive control), только транспортного средства PBS (отрицательный контроль ), или другие экспериментальные соединение после микроинъекции FITC-декстрана.Примечание: Дозировки и сроки применения фармакологических соединений, токсинов или другие агенты могут варьироваться в зависимости от экспериментальных вопрос. 5. Визуализация Microinjected Organoids жить Начните жить изображения сразу после микроинъекции. Передать флуоресцентный микроскоп оснащен увлажненные камере поддерживается при 37 ° C и 21% O2 и 5% CO2 с автоматизированной живой клетки системы культуры пластин. Закройте экологические камеры и начать процесс визуализации. Запуск программного обеспечения для анализа изображений (например, softWoRx) с рабочего стола. Нажмите «Файл» и выберите пункт «Получить (решимость 3D)» для инициализации изображений и программного обеспечения управления микроскопом. Установить FITC возбуждения/выбросов (475 Нм возбуждения/523 Нм выбросов), установите мощность передачи до 5% и объектив 4 X. Установите время экспозиции до 0,025 мс (рис. 4A).Примечание: Время экспозиции следует разнообразить под силу флуоресцентного сигнала. В общем FITC флуоресценции сигнал только будет уменьшаться. Таким образом для обеспечения максимальной чувствительности, раз первоначального воздействия должна быть скорректирована таким образом, что записанные флуоресцентного сигнала находится чуть ниже точки насыщения камеры и изображений программное обеспечение. Найти HIOs на 4 кратном увеличении с помощью цифровой контроллер, прилагается к Микроскоп. Центр HIO в течение просмотра поля (рис. 4A). Нажмите «Вид» на панели инструментов и выбрать «Точку списка» раскрыть новое окно. Нажмите кнопку «Пометить точку» для хранения текущей позиции этапа в списке точек (рис. 4A). Повторите шаги, 5.4 и 5.5 позиции всех HIOs были записаны. Используя Блокнот или цифровой записи, запишите уникальный идентификационный номер, присваиваемый каждой позиции запрограммированных микроскопии и изображения, снятые в этом положении. Файлы изображений будут помечены этот номер и будет важно, чтобы связать изображение идентификационные номера с конкретными HIOs и лечения после завершения сбора данных. Для настройки автоматизированных изображения коллекции, нажмите «Файл» и затем «Эксперимент» в панели инструментов. Имя эксперимент с даты или другое уникальное имя. Установите параметры для коллекции изображений, перейдя через каждую из вкладок параметр, как показано на рисунке 4В. Снимите флажок «Z секционирование» на вкладке «Вырезание». На вкладке «Каналы» введите параметры из окна Верхний левый «решить 3D». Чтобы сэкономить время, первая строка будет автоматически заполнять, когда флажок слева в. На вкладке ‘ покадровой», установите флажок «Время перерыва» и введите временной интервал между изображениями в строке с надписью «Покадровой» и общая продолжительность эксперимента в строке с надписью «Длительность». Программное обеспечение автоматически рассчитает количество точек времени. На вкладке «Точек» установите флажок «Список точек визит».Вы можете также вручную ввести конкретные точки номера, чтобы быть включены в эксперимент, введя в текстовом поле. Не изменяйте параметры по умолчанию на вкладках «Панелей» или «Действия». Нажмите на вкладку «Run» ввод даты эксперимента в поле с надписью «имя файла образа» и задайте данные сохранить место в разделе «Параметры». Нажмите на зеленую стрелку, чтобы запустить эксперимент макрос. Счетчик промежуток времени будет отслеживать ход экспериментальной. В конце курса запланированного времени экспортировать и сохранить все файлы изображений в виде 24-бит RGB TIFF изображений (рис. 4 c). На панели инструментов выберите процесс, следуют задачи строитель. В меню построителя задач добавьте файлы, перейдя к папке данных, указанных в 5,9. Выделите все файлы, оканчивающиеся на «.dv» «*.dv», введя в командной строке. Выберите все (Ctl + A) и нажмите кнопку «Добавить». Нажмите на + под раздел под названием «Задача.» Выберите «Экспорт as…» и перейдите на вкладку «Параметры». Набор «Экспортировать формат», чтобы «TIFF изображений» и установите флажок ниже, чтобы добавить «Custom выходную папку». Это место, куда будут экспортированы изображений TIFF. Выберите 24-битный RGB под «Тип вывода TIFF» и нажмите «Готово». Нажмите кнопку «Отправить в очередь» для запуска макроса экспорта. На другом компьютере, скопируйте изображения TIFF, экспортируются в 5.11 на сервер или внешний драйвер, если вы будете выполнять анализ пост изображений (раздел 6).Примечание: HIO ткани и средства массовой информации могут быть сохранены для гистологии34, ПЦР35), Западная пятно36, или других течению анализа. 6. после визуализации анализа Убедитесь, что ImageJ37 установлена и работает на компьютере, который будет использоваться для анализа.Примечание: Фиджи37 это альтернативное распределение ImageJ основной программы, которая будет работать одинаково хорошо для этого анализа. Запуск пакета анализа, выбрав «Процесс», то «Партии» и, наконец, «Макро» из меню ImageJ. Установите вход в каталог, содержащий изображения TIFF, собранных в ходе экспериментальной время. Откройте файл макроса ImageJ «thesholdmeasure.ijm» или непосредственно копировать/вставить код макроса в окне. Нажмите кнопку «Процесс», чтобы начать обработку файлов.Примечание: Минимальное пороговое значение x (setThreshold(x,255);) может быть присвоено любое число 0 – 255 и должны быть скорректированы, с тем чтобы ликвидировать фон флуоресценции. Значения < 100 рекомендуются. Эмпирически определить соответствующий пороговое значение, макрос изображений на одно изображение, представляющее органоид с не флуоресцентного сигнала. Средняя интенсивность этого изображения может служить в качестве руководства для установки порога надлежащим образом. Для представителя анализа, представленные ниже порог был установлен к «42». ImageJ будет производить большой таблицы, содержащей области всех пикселов в пределах порогового значения интенсивности, и среднее, медиана, минимум и максимум (лимит) интенсивность значение для района в пределах порогового значения интенсивности. Сохраните как CSV или XLS. Изменения в интенсивности с течением времени может быть вычислена в таблице39 , манипулируя таблицы данных для выполнения вычисления ниже или может быть автоматизированных с помощью подходящего языка программирования. Пример анализа сценария написан на R 40 предоставляется с этой рукописи.Примечание: Для каждого HIO относительной флуоресценции интенсивности может быть определена количественно как . Ликвидации время 41 (t1/2) FITC-декстрана в просвете HIO была рассчитана следующим образом: Во-первых, вычислить «площадь под кривой» (AUC)) от кривой, назвав относительной флуоресценции интенсивности с течением времени (t): Затем рассчитайте «Распродажа» () ставка с объемом распределения (Vd) определяется как 1 для нормализованных флуоресценции при t = 0: Далее, определить «ликвидация константа скорости» () как: И наконец, рассчитать время «ликвидации» (t1/2) как: Таким образом, является снижение уравнение: