Мы представляем новый подход к характеризуют опухолевых клеток. Мы объединили иммунофлюоресценции с ДНК люминесцентные –монолитного-гибридизации оценить клетки, захвачен функционализированных медицинская проволока, способны в vivo обогащения CTCs непосредственно из крови пациента.
Циркулирующих клеток опухоли (CTCs) связаны с бедными выживания в лечении метастатического рака. Их идентификации, фенотипа и генотипирования может привести к более глубокому пониманию опухоли неоднородность и таким образом облегчить отбор пациентов для лечения персонализированные. Однако это затрудняется из-за редкости ЦОК. Мы представляем новаторский подход для выборки большого количества крови пациента и получения информации о присутствия, фенотип и Джин транслокации ЦОК. Этот метод сочетает в себе иммунофлюоресценции окрашивание и ДНК люминесцентные –монолитного-гибридизации (ДНК рыбы) и на основе функционализированных медицинская проволока. Этот провод является инновационным устройством, которое позволяет в естественных условиях изоляции CTCs от большого объема периферической крови. Объем крови, проверяются администрацией 30-мин провода — примерно 1,5-3 л Чтобы продемонстрировать целесообразность такого подхода, эпителиальных клеток сцепления молекул (EpCAM) выражение и транслокация гена ALK были определены в не небольшие клеток легких рака легкого (НМРЛ) клеточных линий захвачен функционализированных проволоки и Витражи с иммуно ДНК рыбы подход. Нашей главной задачей было выполнить пробу на 3D структуры, функционализированных провода и определить иммуно фенотипа и рыбы сигналов на этой поддержки, с помощью обычных флуоресцентным микроскопом. Полученные результаты показывают, что ловить CTCs и анализа их фенотипа и хромосомная перестановка может потенциально представляют собой новый компаньон диагностический подход и предоставляют инновационные стратегии для улучшения персонализированных лечения рака.
ЦОК представляют собой ключевой шаг раковых клеток распространение1. Их присутствие в периферической крови больных ассоциируется с (метастазов) рецидива и болезнь прогрессии2,3. КТК изоляции и характеристика от крови больных раком — это тип неинвазивные жидкого биопсии. В последние годы становится все более очевидным, что мониторинг прогрессии и реакции опухоли на различные процедуры с использованием такого рода анализ обеспечивает важной клинической информации4,5. Жидкий биопсии еще более полезным, когда операция не является возможным или когда первичной опухоли не доступен, то есть, для не biopsiable поражений. Следовательно этот подход является перспективным в конкретных рака параметры, такие как метастатического НМРЛ, где было показано присутствие CTCs иметь отрицательные прогностические роль6. НМРЛ это опухоль, особенно от целевых терапевтических подходов7,8,9 , призванных действовать на определенных молекул (молекулярных целей) известный участвовать в росте, прогрессии, и распространение болезни. Следовательно необходима обнаружения конкретных целей во время болезни. КТК расследование является чрезвычайно интересным диагностический подход для выявления и мониторинга наркотиков целей без необходимости для первичного или метастатической тканей. Например обнаружение транслокации гена ALK в клетках НМРЛ связан с чувствительностью к crizotinib, конкретной целенаправленной терапии10. Однако в настоящее время обнаружения ALK транслокации выполняется только на тонкоигольной пунктаты или небольших биопсий; в результате без опухоль ткани ALK анализ не является возможным. ЦОК являются потенциальной альтернативой опухоли на основе ткани расследований и представляют собой весьма перспективным компаньон диагностический подход.
Несмотря на их потенциальное значение ЦОК по-прежнему являются предметом большой дискуссии среди исследований, главным образом из-за их редкости (1-10 клеток/мл периферической крови11). Текущие жидкость биопсии методы используют ограниченное количество крови (т.е., 1-30 мл)12,13, но это создает ситуацию субоптимальные чувствительности для обнаружения CTCs. Следовательно, заслуживает проведения исследований для нахождения подходов и разработке устройств для выполнения КТК целевой жидких биопсий на больший объем периферической крови.
Альтернативные устройства, функционализированных медицинская проволока (см. Таблицу материалы), был разработан преодолеть ограничения отбора проб крови и получить более представительным анализ ЦОК. Этот функционализированных проволока является одобренный CE медицинской устройство, которое захватывает CTCs непосредственно из крови больных раком1. Он состоит из 16-см длиной нержавеющей стальной проволоки (рис. 1a) с длиной 2 см функционализированных наконечником с 0,2 мкм толстый слой золота покрытием. В свою очередь слой покрывается 1-5 мкм толщиной поликарбоксилата гидрогеля страте ковалентно в сочетании с антитела, направленные против EpCAM, один из наиболее широко выраженная антигенов на поверхности CTCs14. Функционализированных кончик проволоки вводится в вену руки пациента и остается в положении по крайней мере 30 минут. Этот подход позволяет изоляции ЦОК в естественных условиях, непосредственно в периферической крови и экран около 1,5-3,0 Л крови (примерно 300-fold больше, чем объем, используемый для альтернативных подходов)1.
Pantel и др. продемонстрировали эффективность этого подхода в изоляции CTCs прямо в руки Вены больных раком легкого15. Они исполнили проволока иммунофлюоресценции окрашивания для выявления ЦОК, с использованием обычных антитела, направленные против EpCAM и Пан Цитокератины и CD45 лейкоцитарной обнаружения. Провод был рассмотрен под микроскоп оптический флуоресценции15. Авторы показали, что устройство было возможность изолировать ЦОК, но они не расследовать любые связанные с терапии целей, таких как ALK транслокации.
Представленный метод направлен на выявление предполагаемых ЦОК в НМРЛ клеточных линий на основе фенотипические параметров, например, EpCAM позитивность и наличие молекулярных биомаркеров, например состояние ALK (рис. 1b). Эта процедура 3-дн длинней сочетает в себе функционализированных проволоки и иммунофлюоресценции, окрашивание с ДНК флуоресценции –in situ-гибридизации (ДНК рыбы), названный иммуно-ДНК-рыба. Учитывая, что CTCs редких сущности, преимуществом этого протокола является что CTCs можно охарактеризовать на же проволоки терминах иммунофенотипических функций и перераспределения ДНК.
В этом документе в первый раз, метод, объединяющий иммунофлюоресценции окрашивание и ДНК рыбы, для использования с функционализированных проволоки было предложено. Метод был вызван иммуно-ДНК рыбы. Этот метод был разработан для одновременной идентификации предполагаемого ЦОК на 3D провод на основе фенотипические параметры, такие как позитивность для EpCAM (событие 1) и для облегчения обнаружения молекулярных изменений, таких как ALK гена статус ( Мероприятие 2). Одновременной идентификации двух событий позволяет обнаружить их совместного локализации. Следовательно этот подход может быть адаптирована для выявления и описания ЦОК, полученных из крови больных раком. Потенциальные последствия брюшинного компонентов и лейкоцитов на процедуре окрашивание не вмешиваться в обычно процедура. В частности данные, приведенные в литературе указывается, что брюшинного компоненты и лейкоцитов не влияют иммунофлюоресценции окрашивания клеток, придает провода, важным шагом для определения фактической CTCs1,15.
Яркости флуоресценции иммуно-ДНК рыбы немного менее заметно, чем традиционные immunophototyping пробирного и является результатом высокой температуры, необходимой для assay рыбы. Однако все еще заметна иммунофлюоресценции пятнать. Например слабый сигнал до сих пор обнаружить в низкой EpCAM выражая клеток линии, NCIH1975. Высокой температуры, необходимой для assay рыба является основным сдерживающим фактором в выборе правой флюрохром, связаны с антитела. В этом протоколе антитела должны увязываться на термостабильным флюрохром для того, чтобы терпеть температура денатурации ДНК. Например из-за флюрохром деградации, вызванной высокой температуры в этой обстановке фикоэритрин, термочувствительных флюрохром, не рекомендуется. Флуоресцеин Изотиоцианаты является хорошим выбором и часто общей флюрохром, работающих на зонды рыбы. Это очень плохой на стандартные 2D поддерживает сигнал аутофлюоресценция иммуно-ДНК рыбы. На поддержку проволока полимерный слой может вызвать незначительные аутофлюоресценция сигнал, особенно на красный канал. В отличие от 2D фон aspecific фонового сигнала заметные на проводе, но существенно не влияет на ядрах идентификации или клетки характеристика.
Микроскоп оценку провода является гораздо более fatiguing, чем на 2D поддержки из-за пределов оптический микроскоп в чтении на поверхности 3D структуры с цилиндрической формы. Однако эти трудности могут быть преодолены Вращающийся держатель проводов и получения изображений, которые преимущественно локализуются вдоль средней линии провода. Держатель проводов позволяет вращение 360 ° провода. После уделялось ядер, изменения флюоресценции каналы не обязательно полностью сосредоточиться на целевой области. По этой причине важно сосредоточить внимание на внутренний клеточной целевой области.
Эта техника может быть адаптирована для обнаруживать и определять характеристики клеток на различных видов 3D поддерживает. Она также может быть возможно использование различных антител и зонды рыбы. При выборе использования различных антител, флюрохром термостойкость и уровень экспрессии антигена целевой на клеточной мембраны являются важными факторами для рассмотрения. Также могут быть окрашены внутри цитоплазматического антигены. При зонды с использованием различных видов рыб, важно проверить, что данные характеристики для процедуры денатурации и подготовить клеток для рыб пробирного соответственно.
The authors have nothing to disclose.
Ethanol | Carlo Erba | # 414605 | |
Tween 20 | BIO RAD | # 1706531 | |
PBS (Phosphate Buffered Saline) | Medicago | # 09-9400-100 | |
Acetone | Sigma Aldrich | # 534064-500ML | |
BSA | Sigma Aldrich | # A7906 | |
Triton X-100 Detergent | BIO RAD | # 1610407 | |
RUBBERCEMENT | Royal Talens | # 95306500 | |
Vysis 20X SSC (66g) | Abbott Molecular Inc. | # 30-804850 | powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended |
RPMI 1640 | Gibco | # 31870-025 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | # 10270-098 | |
L-Glutamine (200mM) | Gibco | # 25030-024 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | # 15140-122 | |
H20 | MilliPore | ||
XT ALK BA | MetaSystems Probes | # D-6001-100-OG | |
DAPI, FluoroPure grade | Invitrogen | # D21490 | |
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI | Life Technologies | # S36973 | |
EpCAM-FITC (clone: HEA-125) | Mitenyi | # 130-080-301 | |
Micro tubes M-Tube18 | Gilupi Nanomedizin | ||
Detektor CANCER01 EpCAM | Gilupi Nanomedizin | Functionalized wire | |
STAR FROST Microscope Slides | Knittel GLÄSER | VS1117# 076FKB | |
SecureSlip Silicone Supported Coverglass | GRACE BIO-LABS | # 104112 | |
ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop | ZEISS | ||
Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software | Nikon | BR 4.11.00 | |
Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera | Nikon | DS-QiMc |