우리는 종양 세포의 특성에 대 한 새로운 접근을 제시. 우리 DNA 형광-제자리에서면역 형광 결합-셀 기능성된 의료 와이어에 vivo에 직접 환자의 혈액에서에서 CTCs를 풍부 하 게의 수에 의해 점령을 평가 하는 교 잡.
순환 종양 세포 (CTCs) 전이성 암에 가난한 생존에 연관 됩니다. 그들의 식별, 형질, 및 유전형 종양이 더 나은 이해로 이어질 수 있고 따라서 맞춤된 치료에 대 한 환자의 선택을 촉진. 그러나, 이것은 CTCs의 희귀 한 때문에 방해 된다. 우리는 환자 혈액의 높은 볼륨 샘플링 및 CTCs의 전 존재, 표현 형, 그리고 유전자 좌에 대 한 정보를 얻기 위한 혁신적인 접근 방식을 제시. 방법은 결합 면역 형광 염색 및 DNA 형광-제자리-교 잡 (물고기 DNA) 기능성된 의료 와이어 기반. 이 와이어 주변 혈액의 큰 볼륨에서 CTCs vivo에서 절연을 허용 하는 혁신적인 장치입니다. 혈액 볼륨 와이어의 30 분 관리에 의해 상영은 대략 1.5-3 나 이 방법의 타당성을 입증, 상피 세포 접착 분자 (EpCAM) 표현과 ALK 유전자의 염색체 전 좌 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC) 셀 라인 기능성된 와이어에 의해 점령에 결정 했다 고 면역-DNA 물고기 방식으로 얼룩진. 우리의 주요 과제 3 차원 구조, 기능성된 와이어에 분석 결과 수행 하 고 면역 표현 형을 결정 하 고이 물고기 신호를 기존의 형광 현미경을 사용 하 여 지원. 결과 표시는 CTCs을 잡는 그들의 표현 형 및 염색체 재배열 분석 수 잠재적으로 새로운 동행자 진단 접근 및 제공 하는 혁신적인 향상을 위한 전략 맞춤 암 치료.
CTCs 암 셀 보급1의 중요 한 단계를 나타냅니다. 환자의 말 초 혈액에 그들의 존재 (전이성) 재발 및 질병 진행2,3와 연결 됩니다. CTC 격리 및 암 환자의 혈액에서 특성화 비-침략 적 액체 생의 유형입니다. 최근 몇 년 동안, 그것은 점점 더 분명 그 중요 한 임상 정보4,5제공 모니터링 진행 및 종양의 분석의이 종류를 사용 하 여 다른 치료에 응답 되었다. 액체 생 인지 더욱 유용한 수술 가능 하지 않습니다 기본 종양 조직 되지 않은 경우 사용할 수 있는, 즉, 비-biopsiable 병 변. 따라서,이 방법은 어디 CTCs의 존재는 부정적인 전조 역할6에 보였다 전이성 NSCLC 같은 특정 암 설정에 유망 하다. NSCLC 타겟된 치료 접근7,8,9 진행, 성장에 관련 된 것으로 알려진 특정 분자 (분자 표적)에 설계에서 특히 이익이 되는 종양 이다 하 고 질병의 확산입니다. 따라서, 질병의 진행 하는 동안 특정 대상의 검출이 필요 합니다. CTC 조사는 감지 하 고 기본 또는 전이성 조직에 대 한 필요 없이 약물 대상 모니터링 매우 재미 있는 진단 방법입니다. 예를 들어 NSCLC 셀에서 ALK 유전자 translocations의 검출 감도 crizotinib, 특정 타겟된 치료10에 연결 됩니다. 그러나, 현재가 translocations의 검색 미세 바늘 aspirates 또는 작은 biopsies;에 실행 됩니다. 그 결과, 종양 없이 조직이 분석 불가능합니다. CTCs는 종양에 대 한 잠재적인 대안 조직 기반 조사 하 고 매우 유망한 동행자 진단 접근을 대표 한다.
그들의 잠재적인 중요성에도 불구 하 고 CTCs 지금도 연구 중 좋은 토론의 주제 (1-10 셀/mL 주변 혈액11) 그들의 진귀 때문에 주로. 현재 액체 생 검 방법 혈액 (즉, 1-30 mL)12,13의 제한 금액을 사용 하지만이 CTCs 그러므로의 검출을 위한 차선 감도의 상황을 만들고, 연구 발견을 보증 접근 하며 말 초 혈액의 더 큰 볼륨에 CTC 대상 액체 biopsies을 수행 하기 위해 개발 장치
대체 장치, 기능성된 의료 와이어 ( 재료의 표참조), 혈액 샘플링 한계를 극복 하 고를 가져오는 CTCs의 더 대표적인 분석 개발 되었습니다. 이 기능성된 와이어를 암 환자1의 혈 류에서 직접 CTCs CE 승인 의료 기기입니다. 그것은 황금의 0.2 µ m 두께 레이어와 코팅 2 cm 긴 기능성 팁 16 cm 긴 스테인리스 와이어 (그림 1a) 구성 됩니다. 레이어 covalently EpCAM CTCs14의 표면에 가장 널리 표현된 항 중 하나에 대하여 지시 하는 항 체와 결합 하 여 1 ~ 5 µ m 두께 polycarboxylate 히드로 지층에 차례로 적용 됩니다. 철사의 기능성된 팁 환자의 팔의 정 맥에 고 적어도 30 분 동안 위치에 남아 있습니다. 이 방법은 주변 혈액, 그리고 화면 혈액 (약 300-fold 이상 대체 방법을 사용 하는 볼륨)1. 의 약 1.5-3.0 L 직접 CTCs vivo에서 의 격리를 허용
Pantel 외. 폐 암 환자15팔 혈관에 직접 CTCs을 분리에이 접근의 효능을 설명 했다. 그들은 얼룩 CTCs 백혈구 검색 EpCAM와 팬-cytokeratin, CD45에 대하여 지시 하는 기존의 항 체를 사용 하 여 식별 하는 와이어 면역 형광 검사 수행. 와이어 광 형광 현미경15시험 되었다. 저자 시연 장치 CTCs, 격리 수 있었습니다 하지만 그들은 translocations 등 치료 관련 어떤 표적을 조사 하지 않았다.
제시 방법은 putative CTCs phenotypical 매개 변수, 예를 들어, EpCAM 양성 및 분자 마커의 존재가 상태 (그림 1b) 예를 들어 기초 NSCLC 셀 라인에서 식별 하는 것을 목표로. 이 3-하루-긴 절차 결합 기능성된 와이어 및 면역 형광 DNA 형광-제자리에얼룩-교 잡 (DNA 물고기) 라는 면역-DNA-물고기. CTCs는 희소 한, 그에 주어진이 프로토콜의 장점은 CTCs immunophenotypic 기능 및 DNA 재배열 동일한 철사에 특성화 될 수 있습니다.
이 논문에서는, 처음으로, 면역 형광 염색 및 DNA 물고기, 결합 하는 방법에 대 한 기능성된 와이어와 함께 사용 하기 위해 제시 되었다. 메서드를 사용 하면 면역 DNA 물고기를 불렀다. 이 기술은 EpCAM (이벤트 1), 수 양성 같은 phenotypical 매개 변수를 기준으로 하 여 3D 와이어에 상 상속 CTCs의 동시 식별을 허용 하 고 ALK 유전자 상태 (와 같은 분자 변경의 탐지를 촉진 하기 위하여 개발 되었다 이벤트 2)입니다. 두 이벤트의 동시 식별 그들의 공동 지역화의 검색 수 있습니다. 따라서,이 방법은 식별 하 고 암 환자의 혈액에서 검색 하는 CTCs 특성화를 맞출 수 있습니다. 착 색 하는 절차에 haemo-구성 요소 및 백혈구의 잠재적인 효과 절차와 일반적으로 방해 하지 않습니다. 특히, 문학에서 보고 된 데이터는 haemo 구성 요소와 백혈구 좌우 하지 않는다 와이어, 실제 CTCs1,15를 식별 하는 중요 한 단계에 연결 된 셀의 면역 형광 염색 법을 가리킨다.
면역-DNA 물고기의 형광 광도 전통적인 immunophototyping의 시험 그리고 물고기 분석에 필요한 고온의 결과 보다 약간 덜 표시. 그러나, 면역 형광 염색 법은 여전히 감지할입니다. 예를 들어 희미 한 신호는 여전히 낮은 EpCAM 표현 셀 라인, NCIH1975에서 감지. 물고기 분석에 필요한 높은 온도 항 체에 연결 된 오른쪽 형광 색소를 선택에 주요 제한 요소입니다. 이 프로토콜에서 항 체 DNA 변성 온도 용납 하기 위해 내 형광 색소에 연결 합니다. 예를 들어 phycoerythrin, 열에 민감한 형광 색소는 권장 하지 않습니다이 설정에서 높은 온도 의해 발생 하는 형광 색소 저하. Fluorescein isothiocyanate 좋은 선택 및 물고기 프로브에 종종 일반적인 형광 색소 이다. 면역-DNA 물고기 autofluorescence 신호는 표준 2D 지원에 매우 가난. 와이어 지원에 폴리머 레이어는 빨강 채널에 특히 약간의 autofluorescence 신호를 유도 수 있습니다. 2D 배경 달리 특정 배경 신호에 인지할 수 이지만 핵 식별 또는 셀 특성을 크게 영향을 주지 않습니다.
와이어의 현미경 평가 독서의 원통형 모양의 3 차원 구조 표면에 광학 현미경의 한계 때문에 2D 지원에 보다 훨씬 더 피곤한. 그러나,이 어려움은 와이어 홀더 회전 및 와이어의 중간 선 따라 지역화 주로 이미지를 획득 하 여 극복할 수 있습니다. 와이어 홀더는 와이어의 360 ° 회전을 허용합니다. 일단 핵에 초점을 맞춘, 형광 채널을 변경 유지 하지 않습니다 반드시 대상 지역에 초점. 이러한 이유로, 내부 셀 대상 영역에 초점을 유지 하기 위해 필수적 이다.
이 기술은 감지 하 여 3D 지원의 종류에는 셀 특성에 맞출 수 있습니다. 그것은 또한 다른 항 체를 사용할 수 있을 수 있습니다 그리고 물고기 프로브. 다른 항 체를 사용 하 여 선택할 때 형광 색소 내열성 및 세포 막에 대상 항 식 수준 고려해 야 할 중요 한 요소는. 내 cytoplasmatic 항 또한 스테인드 수 있습니다. 프로브 다른 물고기를 사용 하 여 때 그것은 물고기에 대 한 셀을 준비 하 고 변성 절차에 대 한 데이터 시트 사양 따라 분석 결과 확인 하는 것이 중요.
The authors have nothing to disclose.
Ethanol | Carlo Erba | # 414605 | |
Tween 20 | BIO RAD | # 1706531 | |
PBS (Phosphate Buffered Saline) | Medicago | # 09-9400-100 | |
Acetone | Sigma Aldrich | # 534064-500ML | |
BSA | Sigma Aldrich | # A7906 | |
Triton X-100 Detergent | BIO RAD | # 1610407 | |
RUBBERCEMENT | Royal Talens | # 95306500 | |
Vysis 20X SSC (66g) | Abbott Molecular Inc. | # 30-804850 | powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended |
RPMI 1640 | Gibco | # 31870-025 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | # 10270-098 | |
L-Glutamine (200mM) | Gibco | # 25030-024 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | # 15140-122 | |
H20 | MilliPore | ||
XT ALK BA | MetaSystems Probes | # D-6001-100-OG | |
DAPI, FluoroPure grade | Invitrogen | # D21490 | |
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI | Life Technologies | # S36973 | |
EpCAM-FITC (clone: HEA-125) | Mitenyi | # 130-080-301 | |
Micro tubes M-Tube18 | Gilupi Nanomedizin | ||
Detektor CANCER01 EpCAM | Gilupi Nanomedizin | Functionalized wire | |
STAR FROST Microscope Slides | Knittel GLÄSER | VS1117# 076FKB | |
SecureSlip Silicone Supported Coverglass | GRACE BIO-LABS | # 104112 | |
ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop | ZEISS | ||
Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software | Nikon | BR 4.11.00 | |
Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera | Nikon | DS-QiMc |