אנו מציגים גישה חדשה כדי לאפיין תאים סרטניים. אנו משלבים immunofluorescence עם ה-DNA פלורסנט –מקומיים-הכלאה כדי להעריך את התאים שנתפסו על ידי חוט רפואי functionalized מסוגל ויוו מעשיר CTCs ישירות מדם החולה.
מחזורי תאים סרטניים (CTCs) הקשורים המסכן ההישרדות מסרטן גרורתי. שלהם זיהוי, phenotyping, genotyping יכול להוביל להבנה טובה יותר של הגידול הטרוגניות, ובכך להקל על הבחירה של חולים לטיפול אישי. עם זאת, זה היא הקשו בגלל בנגישות של CTCs. אנו מציגים גישה חדשנית דגימה נפח גבוה של הדם המטופל וקבלת מידע אודות נוכחות, פנוטיפ, ג’ין טרנסלוקציה של CTCs. השיטה משלבת immunofluorescence מכתים ו- DNA פלורסנט –מקומיים-הכלאה (דנ א דגים) והוא מבוסס על חוט רפואי functionalized. החוט הזה הוא מכשיר חדשני המאפשר ויוו בידודו של CTCs של כמויות גדולות של דם היקפיים. נפח הדם הוקרן על ידי הממשל 30-מין של הכבל הוא כ 1.5-3 ל’ כדי להדגים את הכדאיות של גישה זו, תאים אפיתל אדהזיה מולקולה (EpCAM) וביטוי של טרנסלוקציה כרומוזומלית של הגן ALK היו נחושים בקווים ריאות שאינם קטנים התא סרטן (NSCLC) תא שנתפסו על ידי החוט functionalized ו מוכתם בגישה דגים חיסונית-DNA. האתגר העיקרי שלנו היה לבצע את הבדיקה על מבנה תלת-ממדי, הכבל functionalized, וכדי לקבוע חיסונית-פנוטיפ ותמיכה דגים אותות על זה באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות קונבנציונלי. התוצאות המתקבלות מצביעים על כך מדבק CTCs וניתוח פנוטיפ שחלוף כרומוזומלית שלהם יכול באופן פוטנציאלי מייצגים גישה חדשה של אבחון לוויה לספק חדשנית אסטרטגיה לשיפור אישית טיפולים בסרטן.
CTCs מייצגות צעד. מפתח של סרטן תאים הפצתו1. הנוכחות שלהם בדם ההיקפי של חולים היא משויכים (גרורתי) relapse ומחלות התקדמות2,3. CTC בידוד ואפיון ממחזור הדם של חולי סרטן היא סוג של ביופסיה נוזלי לא פולשנית. בשנים האחרונות זה הפך יותר ויותר ניכר כי ניטור של התקדמות, בתגובה של גידולים טיפולים שונים באמצעות ניתוח מסוג זה מספק מידע קליני חשוב4,5. ביופסיה נוזלי שימושית יותר כאשר הניתוח הוא לא ריאלי או כאשר רקמת הגידול העיקרי אינו זמין, קרי, לחבלות ללא biopsiable. ומכאן, גישה זו הוא מבטיח בהגדרות סרטן ספציפיים כגון NSCLC גרורתי, איפה הנוכחות של CTCs הוכח יש תפקיד שלילי prognostic6. NSCLC הוא גידול זה נהנה במיוחד ממוקד גישות טיפוליות7,8,9 תוכנן לפעול על מולקולות ספציפיות (מטרות מולקולריות) ידוע להיות מעורב הגידול, התקדמות, ו התפשטות המחלה. לפיכך, נדרש זיהוי מטרות מוגדרות במהלך התקדמות המחלה. CTC חקירה היא גישה אבחון מאוד מעניינת כדי לזהות ולנטר סמים מטרות ללא צורך רקמות ראשי או גרורתי. לדוגמה, זיהוי ALK translocations גנים בתאים NSCLC קשורה רגישות crizotinib, טיפול ממוקד ספציפי10. עם זאת, כיום, הגילוי של ALK translocations תבוצע רק על aspirates פיין-מחט או ביופסיות קטן; כתוצאה מכך, ללא גידול רקמות ALK ניתוח אינה אפשרית. CTCs אלטרנטיבה פוטנציאל הגידול חקירות מבוסס-רקמות, מייצגים גישה מאוד מבטיח של אבחון לוויה.
למרות חשיבותם פוטנציאליים, CTCs הן עדיין נושא הוויכוח הגדול בין מחקר, בעיקר בגלל נדירותם (1-10 תאים/מ”ל של דם היקפיים11). ביופסיה נוזלי שיטות להשתמש כמות מוגבלת של דם (קרי, 1-30 מ”ל)12,13, אבל זה יוצר מצב של רגישות שיוצרת איתור CTCs. לפיכך, המחקר היא מוצדקת כדי למצוא גישות והתקנים המתפתח לביצוע ביופסיות נוזלי CTC, ממוקדות על נפח גדול יותר של דם היקפיים.
מכשיר חלופי, חוט רפואי functionalized (ראה טבלה של חומרים), פותחה כדי להתגבר על מגבלות דגימה דם ולקבל ניתוח יותר נציג של CTCs. החוט הזה functionalized הוא מכשיר רפואי שאושרו על-ידי CE הלוכד את CTCs ישירות מן הדם של חולי סרטן1. הוא מורכב של חוט פלדה אל חלד 16-ס מארוך (איור 1 א’) עם טיפ 2-ס מארוך functionalized מצופה בשכבה 0.2-מיקרומטר-עבה של זהב. השכבה בתורו מכוסה על ידי שכבה הידרוג 1 ל 5 מיקרומטר-עבה polycarboxylate covalently בשילוב עם נוגדנים נגד EpCAM, אחד של אנטיגנים ביטוי נרחב ביותר על פני השטח של CTCs14. Functionalized קצה החוט הוא הציג לתוך הווריד של הזרוע של החולה ונשאר בעמדה במשך לפחות 30 דקות. גישה זו מאפשרת בידוד של CTCs ויוו, ישירות בדם ההיקפי, וכדי מסך כ 1.5 – 3.0 L של דם (כ 300-fold יותר מאשר אמצעי האחסון המשמש גישות אלטרנטיביות)1.
Pantel et al. הראו את היעילות של גישה זו לבודד CTCs ישירות לתוך הורידים הזרוע של חולי סרטן ריאות15. הם ביצעו immunofluorescence תיל מכתים לזהות CTCs באמצעות נוגדנים קונבנציונאלי מכוונת נגד EpCAM פאן-cytokeratin, ואת CD45 לגילוי leucocyte. החוט נבחנה תחת מטוס מיקרוסקופ אופטי פלורסצנטיות15. המחברים הראו כי המכשיר הצליח לבודד את CTCs, אך הם לא לחקור כל מטרות הטיפול בנושא, כגון ALK translocations.
השיטה הציג שמטרתו לזהות בשם CTCs ב NSCLC שורות תאים על בסיס פרמטרים פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר, למשל, הגישה החיובית EpCAM, הנוכחות של סמנים מולקולריים, למשל מצב ALK (איור 1b). הליך זה 3-יום-ארוך משלב חוט functionalized immunofluorescence מכתים עם ה-DNA זריחה –מקומיים-הכלאה (דנ א דגים), בשם חיסונית-DNA-דגים. בהתחשב בכך CTCs הם ישויות נדיר, היתרון של פרוטוקול זה היא כי ניתן לאפיין CTCs על החבל זהה מבחינת תכונות immunophenotypic והן rearrangements דנ א.
בנייר זה, בפעם הראשונה, שיטה המשלבת immunofluorescence מכתים ודגים דנ א, לשימוש עם החוט functionalized הוצע. השיטה נקראה חיסונית-DNA דגים. שיטה זו פותחה כדי לאפשר זיהוי בשם CTCs בו זמנית על חוט 3D על בסיס פרמטרים פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר, כגון חיוביות כדי EpCAM (אירוע 1), וכדי להקל על זיהוי שינויים מולקולריים, כגון ALK ג’ין מצב ( אירוע 2). זיהוי שני האירועים בו זמנית מאפשרת הגילוי של לוקליזציה משותפת שלהם. לפיכך, גישה זו ניתן להתאימו לזהות ולאפיין CTCs שאוחזר מהדם של חולי סרטן. ההשפעות פוטנציאלי של haemo-רכיבים של לויקוציטים על ההליך מכתימים אינם מפריעים כלל עם ההליך. בפרט, הנתונים המדווחים בספרות ציינו כי haemo-רכיבים של לויקוציטים לא להשפיע על ההכתמה immunofluorescence של התאים מחובר הכבל, השלב הקריטי כדי לזהות CTCs בפועל1,15.
קרינה פלואורסצנטית הבהירות של דגים חיסונית-DNA הוא מסומן מעט פחות מאשר זו של immunophototyping המסורתי assay היא התוצאה של טמפרטורה גבוהה לצורך וזמינותו דגים. אולם, immunofluorescence מכתים הוא עדיין ניכר. לדוגמה, אות חלש הוא עדיין לזיהוי בשורה נמוכה לבטא EpCAM תא, NCIH1975. הטמפרטורה הגבוהה הדרושה וזמינותו דגים היא הגורם המגביל המרכזי בבחירת את fluorochrome נכון מקושר הנוגדן. ב פרוטוקול זה, נוגדנים חייב להיות מקושר אל fluorochrome thermostable כדי לסבול את הטמפרטורה דנטורציה של ה-DNA. לדוגמה, phycoerythrin, fluorochrome thermosensitive, לא מומלץ בהגדרה זו בגלל fluorochrome פגם שנגרם ע י בטמפרטורה גבוהה. Fluorescein isothiocyanate היא בחירה טובה fluorochrome נפוצים לעתים קרובות המועסקים על דגים הגששים. האות autofluorescence חיסונית-DNA דגים הוא עני מאוד על סטנדרטי תומך 2D. על התמיכה תיל, השכבה פולימר עלול לגרום אות autofluorescence קלה, בעיקר על ערוץ הצבע האדום. בניגוד הרקע דו-ממדי, אות רקע aspecific ניכר על החבל אך אינה משפיעה באופן משמעותי אפיון זיהוי או תא גרעינים.
הערכה מיקרוסקופים של הגדר היא מעייפת הרבה יותר מאשר על תמיכה דו-ממדית כתוצאה ממגבלות במיקרוסקופ אופטי קריאה השטח של מבנה תלת-ממדי בצורת גליל. עם זאת, הקושי הזה ניתן להתגבר על ידי סיבוב למחזיק חוט ורכישת תמונות מותאמים בעיקר לאורך הקו האמצעי של החוט. בעל חוט מאפשר סיבוב 360 מעלות של החוט. ברגע ממוקדת הגרעינים, שינוי ערוצי פלורסצנטיות לא בהכרח נתמקד על אזור היעד. מסיבה זו, זה חיוני כדי לשמור על המוקד על האזור הפנימי-תא היעד.
טכניקה זו ניתן להתאים לזהות ולאפיין לתאים מסוגים שונים תומך 3D. ייתכן גם שתהיה אפשרות להשתמש נוגדנים שונים, דגים רגשים. כאשר בוחרים להשתמש נוגדנים שונים, fluorochrome thermostability ואת רמת ביטוי של אנטיגן מטרה על קרום התא הם גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון. גם יכול להיות מוכתם אנטיגנים אינטרה-cytoplasmatic. כאשר באמצעות דגים שונים probes, חשוב לבדוק מפרטי גליון נתונים עבור ההליך דנטורציה וכדי להכין תאים שהדגים assay בהתאם.
The authors have nothing to disclose.
Ethanol | Carlo Erba | # 414605 | |
Tween 20 | BIO RAD | # 1706531 | |
PBS (Phosphate Buffered Saline) | Medicago | # 09-9400-100 | |
Acetone | Sigma Aldrich | # 534064-500ML | |
BSA | Sigma Aldrich | # A7906 | |
Triton X-100 Detergent | BIO RAD | # 1610407 | |
RUBBERCEMENT | Royal Talens | # 95306500 | |
Vysis 20X SSC (66g) | Abbott Molecular Inc. | # 30-804850 | powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended |
RPMI 1640 | Gibco | # 31870-025 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | # 10270-098 | |
L-Glutamine (200mM) | Gibco | # 25030-024 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | # 15140-122 | |
H20 | MilliPore | ||
XT ALK BA | MetaSystems Probes | # D-6001-100-OG | |
DAPI, FluoroPure grade | Invitrogen | # D21490 | |
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI | Life Technologies | # S36973 | |
EpCAM-FITC (clone: HEA-125) | Mitenyi | # 130-080-301 | |
Micro tubes M-Tube18 | Gilupi Nanomedizin | ||
Detektor CANCER01 EpCAM | Gilupi Nanomedizin | Functionalized wire | |
STAR FROST Microscope Slides | Knittel GLÄSER | VS1117# 076FKB | |
SecureSlip Silicone Supported Coverglass | GRACE BIO-LABS | # 104112 | |
ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop | ZEISS | ||
Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software | Nikon | BR 4.11.00 | |
Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera | Nikon | DS-QiMc |