我们提出了一种新的方法来描述肿瘤细胞。我们结合免疫荧光与 DNA 荧光-原位杂交, 以评估细胞捕获的功能性医用电线, 能够在体内的,丰富 ctc 直接从病人的血液。
循环肿瘤细胞 (ctc) 与转移癌的生存率低下有关。它们的鉴定、分和基因分型可以使人们更好地了解肿瘤的异质性, 从而便于选择病人进行个性化治疗。然而, 由于稀有的 ctc, 这是受阻的。我们提出了一种创新的方法来取样高量的患者血液和获得有关的存在, 表型和基因易位的 ctc。该方法结合免疫荧光染色和 dna 荧光-原位杂交 (dna 鱼), 并以功能化的医疗导线为基础。这根导线是一种创新的设备, 允许在体内的 ctc 隔离大量的外周血。由30分钟的导线管理的血液容量是大约 1.5-3 L。为了证明这一方法的可行性, 在非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞系中, 用功能性金属丝捕捉上皮细胞黏附分子 (EpCAM) 的表达和染色体易位。用免疫 DNA 鱼的方法染色我们的主要挑战是在3D 结构, 功能化的金属丝上进行化验, 并使用传统的荧光显微镜来确定免疫表型和鱼类信号。结果表明, 捕捉 ctc 和分析其表型和染色体重排可能代表一种新的伴侣诊断方法, 并提供一个创新的策略, 以改善个性化的癌症治疗。
ctc 代表癌细胞传播的一个关键步骤1。他们的存在在患者的外周血与 (转移) 复发和疾病进展相关2,3。CTC 从血液中分离和鉴定肿瘤患者是一种非侵入性液体活检。近年来, 越来越明显的是, 使用这种分析方法监测肿瘤对不同治疗的进展和反应, 提供了重要的临床信息4,5。液体活检是更有用的, 当手术是不可行的, 或当原发肿瘤组织不可用,即, 为 non-biopsiable 病变。因此, 这种方法是有希望在特定的癌症的设置, 如转移性 NSCLC, 其中存在的 ctc 已经证明有一个负面的预后的作用6。NSCLC 是一种肿瘤, 特别是受益于靶向治疗方法7,8,9 , 旨在对特定分子 (分子靶) 采取行动, 已知参与生长, 进展, 和疾病的传播。因此, 需要在疾病进展过程中检测特定的靶点。反恐委员会的调查是一个非常有趣的诊断方法, 以检测和监测药物的目标, 而无需主要或转移组织。例如, 在 NSCLC 细胞中检测易位基因, 与 crizotinib 的敏感性有关, 这是一种特定的靶向治疗10。然而, 目前, 易位的检测只在细针物或小活检上执行;因此, 没有肿瘤组织的分析是不可能的。ctc 是一个潜在的替代肿瘤组织调查, 并代表了一个非常有希望的同伴诊断方法。
尽管他们的潜在重要性, ctc 仍然是一个大争论的主题在研究之中, 主要由于他们的稀有 (1-10 细胞/毫升的外周血11)。目前的液体活检方法使用有限的血量 (即, 1-30 毫升)12,13, 但这会造成 ctc 检测的次优灵敏度的情况. 因此, 有必要研究寻找方法和开发用于在更大的外周血量上执行 CTC 靶向液体活检的装置。
另一种装置, 一种功能化的医用金属丝 (参见材料表), 已经开发来克服血液取样限制, 并获得更具代表性的 ctc 分析。这种功能化的电线是一个 CE 认证的医疗设备, 捕获 ctc 直接从血液中的癌症患者1。它是由一个16厘米长的不锈钢线 (图 1a) 组成, 2 厘米长的功能性尖端涂有 0.2-µm 厚的金层。该层依次由1至5µm-厚羧酸水凝胶地层共价结合, 抗体针对 EpCAM, 其中最广泛表达的抗原的表面 ctc14。导线的官能化的末端被介绍入患者的胳膊的静脉并且保持在位置至少30分钟。这种方法允许隔离 ctc在体内,直接在外周血, 并筛选约 1.5-3.0 升的血液 (大约300倍以上的其他方法使用的体积)1.
、 et al。证明了这种方法的效果, 将 ctc 直接分离到肺癌患者的臂静脉中15。他们进行了线免疫荧光染色识别 ctc 使用常规抗体针对 EpCAM 和泛角, CD45 白细胞检测。导线在光学荧光显微镜下被审查了15。作者证明, 该装置能够隔离 ctc, 但他们没有调查任何与治疗有关的目标, 如易位。
所提出的方法旨在根据型参数,例如, EpCAM 阳性和分子生物标志物的存在, 例如 ctc 的状态 (图 1b), 来识别 NSCLC 细胞系中的假定的不确定因素。这3天长的过程结合了功能化线和免疫荧光染色与 dna 荧光-原位杂交 (dna 鱼), 命名为免疫 dna 鱼。鉴于 ctc 是稀有的实体, 该协议的优点是, ctc 可以在同一条线上的型特征和 DNA 重的特点。
本文首次提出了一种结合免疫荧光染色和 DNA 鱼的方法, 用于功能化丝的应用。这种方法被称为免疫 DNA 鱼。这项技术是为了允许在3D 导线上同时识别假定 ctc 的基础上的型参数, 如积极性到 EpCAM (事件 1), 并促进检测分子的变化, 如与基因状态 (事件 2)。同时标识两个事件, 可以检测其共存。因此, 这种方法可以定制, 以确定和表征 ctc 从血液中提取的癌症患者。haemo 成分和白细胞对染色过程的潜在影响通常不会干扰手术。特别是, 文献报道的数据表明, haemo 成分和白细胞不影响免疫荧光染色的细胞连接到电线, 关键步骤, 以确定实际 ctc1,15。
免疫 DNA 鱼的荧光亮度略高于传统的 immunophototyping 检测, 是鱼类测定所需高温的结果。然而, 免疫荧光染色仍然是可观的。例如, 微弱的信号仍然是可探测的在低 EpCAM 表达的细胞线, NCIH1975。鱼类检测所需的高温是选择与抗体相关的右荧光的主要限制因素。在本协议中, 抗体必须与耐热荧光相连接, 以耐受 DNA 变性温度。例如, 藻, 一个热敏荧光, 不建议在这个设置, 因为荧光退化造成的高温。荧光素异硫氰酸酯是一种很好的选择, 通常荧光用于鱼探针。在标准2D 支架上, 免疫 DNA 鱼自发荧光信号非常差。在导线支撑上, 聚合物层可能会诱发轻微的自发荧光信号, 特别是在红色通道上。与2D 背景不同的是, 具体的背景信号在导线上是可辨识的, 但不影响细胞核识别或细胞特征。
由于在读取圆柱形3D 结构的表面上的光学显微镜的局限性, 对金属丝的显微评估比2D 的支撑更累人。然而, 这一困难可以克服通过旋转导线持有人和获取的图像, 主要是沿中线线。导线持有者允许导线的360°旋转。一旦聚焦在细胞核上, 改变荧光通道并不一定会把焦点放在目标区域上。因此, 必须保持对内细胞靶区的关注。
这种技术可以用来检测和表征不同种类的3D 支持的细胞。也可能使用不同的抗体和鱼探针。当选择使用不同的抗体时, 荧光热稳定性和靶抗原在细胞膜上的表达水平是重要的考虑因素。cytoplasmatic 抗原也可以染色。当使用不同的鱼探针时, 重要的是要检查数据表规格的变性过程和准备细胞的鱼化验相应。
The authors have nothing to disclose.
Ethanol | Carlo Erba | # 414605 | |
Tween 20 | BIO RAD | # 1706531 | |
PBS (Phosphate Buffered Saline) | Medicago | # 09-9400-100 | |
Acetone | Sigma Aldrich | # 534064-500ML | |
BSA | Sigma Aldrich | # A7906 | |
Triton X-100 Detergent | BIO RAD | # 1610407 | |
RUBBERCEMENT | Royal Talens | # 95306500 | |
Vysis 20X SSC (66g) | Abbott Molecular Inc. | # 30-804850 | powder to be resuspended in distilled H2O, as recommended |
RPMI 1640 | Gibco | # 31870-025 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | # 10270-098 | |
L-Glutamine (200mM) | Gibco | # 25030-024 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | # 15140-122 | |
H20 | MilliPore | ||
XT ALK BA | MetaSystems Probes | # D-6001-100-OG | |
DAPI, FluoroPure grade | Invitrogen | # D21490 | |
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI | Life Technologies | # S36973 | |
EpCAM-FITC (clone: HEA-125) | Mitenyi | # 130-080-301 | |
Micro tubes M-Tube18 | Gilupi Nanomedizin | ||
Detektor CANCER01 EpCAM | Gilupi Nanomedizin | Functionalized wire | |
STAR FROST Microscope Slides | Knittel GLÄSER | VS1117# 076FKB | |
SecureSlip Silicone Supported Coverglass | GRACE BIO-LABS | # 104112 | |
ZEISS Fluorescent Microscope Axioskop | ZEISS | ||
Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 bit software | Nikon | BR 4.11.00 | |
Nikon DS-QiMc 12 bit digital camera | Nikon | DS-QiMc |