Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Henrick Horita; Andy Law; Kim Middleton

doi:10.3791/56912

JoVE Journal > Biochemistry

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Biyokimya

대상 단백질에 대 한 내 생 포스트 번역 상 수정 프로필을 식별 하는 포괄적인 Immunoprecipitation 농축 시스템을 활용 하 여

Published: January 08, 2018

doi:

10.3791/56912

Henrick Horita¹, Andy Law¹, Kim Middleton¹

¹R&D Department,Cytoskeleton Inc.

Özet

여러 조사, 생 포스트 번역 상 수정 대상 단백질에 대 한 매우 도전 수 있습니다. 여기에 설명 된 기술 개발 특정 PTM 타겟팅, 선호도 행렬 acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, 및 티로신 인 산화 수정 대상에 대 한 검색에 최적화 된 세포의 용 해 버퍼 및 필터 시스템 활용 간소화 된 단일 시스템을 사용 하 여 단백질입니다.

Abstract

그것은 지금 잘 감사 포스트 번역 상 수정 (PTMs) 단백질의 구조와 기능, 생리학 및 병리학 주어진된 단백질의 역할에 대 한 필수적인 수 있습니다 조절에 중요 한 역할 놀이. 농축 PTMs는 대상 단백질의 PTM 상태를 조사 하 고 PTMs 과도 들은 상대적으로 낮은 풍부에서 때문에, 경우가 많습니다. PTM의 대상 단백질에 대 한 풍요롭게 할 때 많은 함정 발생 버퍼 호환성, 대상 단백질 항 체입니다 하지 IP 호환, PTM 신호의 손실 및 다른 사람. 어려움의 정도 여러 PTMs acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, 및 티로신 인 산화는 주어진된 대상 단백질에 대 한 같은 조사 때 확대 됩니다. 이러한 PTMs의 조합을 공부 필요한 PTMs 사이 누화는 만연 하 고 중요 한 단백질 규정에 대 한 있을 수 있습니다. 종종, 이러한 PTMs는 다른 세포의 용 해 버퍼와 독특한 억제제 작곡 공부 했다. 프로세스를 단순화 하기 위해 독특한 변성 세포 시스템 개발을 효과적으로 격리 하 고 이러한 4 개의 PTMs; 유지 따라서, 단일 세포 시스템에 잠재적인 누화의 조사를 활성화합니다. 고유 필터 시스템은 버퍼를 변성 시키기의 문제가 있는 부산물, lysate에서 게놈 DNA 오염 제거 하려면 설계 되었습니다. 강력한 선호도 행렬 4 PTMs의 각각을 대상으로 농축 및 내 생이 4 PTMs의 검출을 극대화 하기 위해 버퍼 시스템 함께에서 개발 되었다. 이 포괄적인 PTM 탐지 도구 집합 단백질은 하나 이상의 이러한 PTMs 수정 여부에 대 한 중요 한 정보를 얻기의 프로세스를 합리화.

Introduction

포스트 번역 상 수정 (PTMs)는 단백질, 수정 추가 또는 제거 특정 방식으로 그것에 의하여 높은 규제 변경. PTMs는 종종 동적, 일시적 변화 단백질의 구조를 크게 변경 하는 파트너 단백질, 그리고 공간 지역화, 그리고 궁극적으로 뚜렷한 기능¹^,² 를 수행 하는 단백질을 활성화와 함께 상호 작용 ^, ³ ^, ⁴. PTMs는 그래서 풍부한 것 그들은 독특한 단백질 형태 (또는 proteoforms)의 수에서에서 증가 약 30000 유전자 제품 이상 백만 proteoforms⁵^,⁶. PTMs 식별 하 고 정의 대상 단백질에 미치는 영향은 단백질의 생리 적 및 병 적인 기능⁷^,^,⁸⁹^,¹⁰^{, 이해를 향한 중요 한} ¹¹^,¹²^,^,¹³¹⁴. 작업 선택 단백질 처럼 tubulin, p53, 그리고 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR) PTMs¹⁵^,^,¹⁶¹⁷의 규제 역할을 해명 했습니다. 이러한 연구는 사실을 여러 PTMs에 의해 발생 하는이 단백질의 많은 경우에 특정 기능을 홍보 하는 콘서트에서 이러한 수정 작업을 발견 했다. 새로운 연구는 협동과 부정적인 PTM 누화 여러 다른 단백질¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,^,²¹²²^, 에서 발생할 수 있습니다²³^,^,²⁴²⁵. 그러나, 단백질의 대부분의 PTM 프로필 다른 모델과 독특한 조건 사용 여러 연구에서 만들어집니다. 최적화 된 시스템을 하나의 시스템에 여러 PTMs 조사 대상 단백질에 대 한 잠재적인 PTM 크로스 토크에 대 한 통찰력을 얻기 위해 매우 유익한 것입니다.

단일 시스템에서 PTMs 조사와 함께 한 도전은 특정 PTMs 뚜렷한 세포의 용 해 버퍼를 사용 하 여 조사는 이다.입니다. 예를 들어 같은 RIPA 또는 NP-40 인 산화 또는 ubiquitination 수사를 위해 일반적으로 사용 되는 버퍼의 활용 작은 유비퀴틴-같은 한정자 (스모) ylation²⁶같은 정한 PTM 공부에 적합 하지 수 있습니다. 또한, 비 변성 시키기 버퍼는 단백질 상호 작용을 해리에 대 한 충분 한 이며 거짓 긍정적인 PTM 식별²⁷으로 이어질 수 있습니다. PTMs 변성 세포의 용 해 버퍼에서 조사 하 고 있을 수 있습니다, 모든 세포질 구획²⁸에서 단백질 분리에 훨씬 더 나은, 대부분 단백질 상호 작용을 해리 것 이며 같은 PTM 상태를 변경 하는 프로 테아 제 억제 deSUMOylases ²⁶; 그러나, 버퍼를 변성 시키기 유비퀴틴 바인딩 도메인 기반 도구²⁷등 특정 선호도 시 약의 무결성을 손상 수 있습니다. 단백질의 여러 PTMs 선호도 시 호환 시스템에서 공부를 변성 시키기 같은 세포 시스템 개발 PTM 누화 수사를 위해 매우 유익한 것입니다.

변성 버퍼는 비 변성 시키기 버퍼 PTMs 조사를 위한 주요 이점이 있다, 하지만 그들은 자주 그들의 중요 한 결점, 기존의 단백질 분석 실험, 중요 한와 호환 되지 않는 등으로 인해 사용 게놈 deoxyribonucleic 산 (DNA) 오염, 그리고 immunoprecipitation (IP) 시 약²⁹중단. 이러한 단점 확장된 준비 시간과 잠재적인 손상에 대상 단백질에 게놈 DNA를 절단 하는 경우 발생할 수 있습니다. DNA를 기울이려면 2 일반적으로 사용 되는 방법 주사기 세포 및 쥡니다²⁹포함 됩니다. 두 방법 모두 광범위 한 최적화를 요구 하 고 정확한 재현성 부족. DNAses;의 추가 포함 하는 게놈 DNA를 제거 하는 다른 방법 그러나,이 추가적인 최적화 및 버퍼 구성에서 변경 해야 합니다. 궁극적으로, genomic DNA 오염 제거 하는 간단 하 고 재현할 수 방법을 PTM 조사에 대 한 세포의 용 해 버퍼를 변성 시키기 작업할 때 도움이 될 것 이다.

이 기법의 목표는 격리 하 고 더 나은 PTM 누화 대상 단백질에 대 한 조사를 단일 시스템에서 ubiquitination (Ub), 티로신 인 산화 (pY), SUMOylation 2/3 (스모 2/3), 및 acetylation (Ac) PTMs 조사 시스템을 개발 하는 것입니다. 이 PTM 탐지 시스템 빠르게 단일 시스템에서 여러 대상 단백질의 생 PTM 프로필 조사에 이용 되었다. 새로운 통찰력 잠재적인 누화 확인 된³⁰^,³¹이었다. 여기에 설명 된 기술을 PTMs 및 PTM 조사 하는 기존의 방법에 향상 하는 전반적으로, 세 가지 방법으로 크로스 토크: 1) 독특한 변성 버퍼와 호환 되는 동안 모든 세포질 구획에서 단백질을 분리 하는 개발 되었다 PTM 선호도 시 약, 2) 고유 필터 시스템 개발 신속 하 게 높은 재현성 변성된 lysates에서 게놈 DNA 오염 제거 하 고 특수 장비, 및 3) 강력한 선호도 구슬, 세포 시스템을 억제 하 고 시 약은 호환; 따라서, PTM 농축을 극대화 하 고 효율적으로 잠재적인 누화를 검사 하는 대상 단백질에 대 한 이러한 4 PTMs의 단순화.

Protocol

1. 시료 준비: 세포 배양 A431 세포 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충의 4 개의 150 mm 접시를 성장. 50% confluency A431 세포 성장. 혈 청 4 판 24 h에 대 한 혈 청 무료 DMEM A431 세포에 제한 합니다. 1 헤 치료 다른 두 접시를 떠나 33.3 mg/mL의 표 피 성장 인자와 A431 세포의 2 개의 격판덮개를 취급 합니다.참고: 여기에 표시 된 셀 성장과 치료 조건 제공 예를 들어; 그러나,이 방법론은 많은 다른 세포 유형 및 치료 조건에 적용 됩니다. 준비: blastR 억제제 (표 1)와 세포의 용 해 및 희석 버퍼. : BlastR 세포의 용 해 버퍼의 2.895 mL 15 µ L 티로신 인산 가수분해 효소 억제 물, deubiquitinase 및 deSUMOylase 억제제, 30 µ L의 히스톤 deacetylase (HDAC) 억제제, 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 30 µ L의 30 µ L의 결합. 9.65 mL: blastR 희석 버퍼의 50 µ L 티로신 인산 가수분해 효소 억제 물, deubiquitinase 및 deSUMOylase 억제제, 100 µ L의 히스톤 deacetylase (HDAC) 억제제, 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 100 µ L의 100 µ L의 결합.주: 버퍼 구성 및 억제 물 정보에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오. 문화 미디어에서 부 어 얼음에 셀을 배치. 그런 다음 두 번 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1의 10 mL로 세포 세척. 세포 세포의 용 해를 극대화 하기 위해: blastR 세포의 용 해 버퍼를 추가 하기 전에 가능한 많은 PBS를 제거 합니다.주: 버퍼 구성에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오. 각 150 mm 접시: blastR 세포의 용 해 버퍼의 600 µ L를 추가 합니다. 버퍼의 양은 예상된 단백질 수율 (표 2)을 기반으로 합니다. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀 lyse lysate 점성 때문에 핵 세포의 용 해 될 것 이다. 잘라 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 15 mL 컬렉션 튜브 (그림 1)에 배치 되었습니다: blastR 필터에 원유 lysate를 전송할. 여기, 15 mL 송 골 매 관에 사용 됩니다. 제공 된 필터 플런저를 사용 하 여 완전히: blastR 필터를 압축 하 고는 lysate 흐름-통해, 15 mL 튜브 (그림 1)에서 모든 거품을 포함 하 여 수집. 선택 사항: 전송 명확히 lysate 1.5 mL microcentrifuge 튜브 및 4 ° c.에 1 분에 약 10000 x g lysate 원심 분리기 새로운 15 mL 송 골 매 관에는 상쾌한을 전송 합니다. 명확히 희석: blastR 희석 버퍼 각 150 mm 접시 3 mL의 최종 볼륨을 lysate. 마지막 볼륨 예상된 단백질 수율 (표 2)을 기반으로 합니다.참고:이 단계는 마지막 버퍼 구성 IP 반응 엄중에 영향을 미칠 것입니다 중요 합니다. 단백질 농도 (제 2) quantitate 2. 단백질 정량 분석 결과 참고: 단백질 정량 확인 하려면 표준 색도계 단백질 정량 분석 결과 사용 합니다. 여기, 단백질 정량 정밀도 빨간색 고급 단백질 분석 결과 사용 하 여 결정 됩니다. 각각 두 개의 1 mL 큐 벳의 정밀 빨간색 고급 단백질 분석 실험 시 약의 1 mL를 추가 합니다. : BlastR 세포의 용 해 버퍼 및 얼음에 깨끗 한 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서: blastR 희석 버퍼의 40 µ L의 믹스 10 µ L.참고:이 빈 단백질 견본을 읽기 위해 사용 됩니다. 2-3 번을 반전 하 여 첫 번째 베트를 혼합 (2.2 단계)에서 세포/희석 버퍼 믹스의 20 µ L를 추가 합니다. (실험)에서 20 µ L 희석된 세포 lysate의 추가 두 번째 베트를 위의 혼합. 실 온에서 1 분에 대 한 샘플을 품 어. 빈 분에 광 한 광도 (2.3 단계)에서 세포/희석 버퍼 혼합 샘플 600 (2.4 단계)에서 lysate 샘플의 흡 광도 측정 nm. 다음과 같이; lysate 단백질 농도 결정OD600 x 5를 읽고 샘플 = mg/ml에서 단백질 농도참고: OD 수치가 0.5 이상 0.05 아래는 단백질 분석 실험의 선형 범위 용량입니다. 읽기에 대 한 > 0.5, 샘플을 희석 수 있습니다. 판독을 위한 < 0.05, 더 lysate 정밀 빨간색 고급 단백질 분석 실험 시 약 (최대 50 µ L)에 추가할 수 있습니다. Mg/mL lysate 단백질 농도를 분 광 광도 계 판독을 변환할 배율에 대 한 표 3 을 참조 하십시오. 한 접시에 부족 한 단백질 경우 IP 당 2 이상의 번호판을 사용 하는 것이 좋습니다. 이 경우에, 접시 시리즈, 격판덮개 사이 세포의 용 해 버퍼의 원래 300 µ L를 전송에 수확 될 것입니다. 단백질 농도에 따라 희석 샘플을 사용 하 여 버퍼 (1 부: blastR 세포: 4 개 부품: blastR 희석) 원하는 최종 농도 (일반적으로 1 mg/mL)에. 스냅 고정 aliquots의 샘플을 즉시 사용 되지 것입니다. -70 ° c.에 샘플 저장 섹션 3을 진행 합니다. 3. Immunoprecipitation (IP) 분석 결과 참고: 선호도 비드 농도, lysate 농도 및 부 화 시간은 권장 되는 지침, 그리고 각 대상 단백질 및 특정 PTM 조사에 대 한 고유 수 있습니다. Ub 선호도, pY 선호도 구슬, 스모 2/3 선호도 구슬, 구슬과 Ac 선호도 구슬을 구슬 튜브에 resuspended 완전히는 되도록 여러 번 포함 하는 재고 시 튜브 반전. 각 IP 분석 결과 대 한 별도 1.5 mL microcentrifuge에 aliquot 구슬 서 스 펜 션 튜브 얼음 (IP 튜브)에 합니다. 여기, 얼음에 개별 1.5 mL microcentrifuge 관에 유비퀴틴 선호도 구슬의 20 µ L, phosphotyrosine 선호도 구슬의 30 µ L, 40 µ L의 SUMOylation 2/3 선호도 구슬, 또는 acetylation 선호도 구슬의 50 µ L을 추가 합니다.주: 각 선호도 구슬에 사용할 구슬 정지의 권장된 볼륨에 대 한 표 4 를 참조 하십시오. Ubiquitination IP 제어 구슬과 IgG 제어 구슬을 구슬 튜브에 resuspended 완전히는 되도록 여러 번 포함 하는 재고 시 튜브 반전. 일반적인 바인딩 (제어 IP 튜브)를 결정 하기 위해 제어 반응 당 aliquot 제어 구슬. 여기, 얼음에 개별 1.5 mL microcentrifuge 관에 Ub 제어 구슬의 20 µ L, pY 제어 구슬의 30 µ L, 스모 2/3 제어 구슬의 40 µ L 또는 Ac 제어 구슬의 50 µ L을 추가 합니다.주: 구슬 중단 선호도 구슬의 각 유형에 대 한 사용의 권장된 볼륨에 대 한 표 4 를 참조 하십시오. Lysate (20 µ L) 서쪽 오 점 lysate 제어 입력으로 실행의 작은 금액을 저장 합니다. 5 x 샘플 버퍼의 5 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 95 ° C에 종 기.주: 버퍼 구성에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오. 각 IP 튜브 및 제어 IP 튜브 lysate를 추가 합니다. 여기, lysate의 1 밀리 그램 당 총 8 IP 반응의 결과, IP 및 제어 반응 사용 되었다.참고: 분석 결과 당 lysate의 1.0 mg 출발점으로 권장 됩니다. 필요한 lysate의 금액 수정된 대상 단백질의 풍부에 따라 다릅니다. 2 h 4 ° C에서 이상 끝 회전 플랫폼에 튜브를 품 어. 여기, ATR 튜브 회전 속도 22에 사용 되었다. 4 ° c.에 1 분에 3000-5000 x g에서 원심 분리 하 여 비즈를 수집 비즈를 방해 하지 않고 최대한 많은 상쾌한에서 발음. 1 mL: blastR 워시 버퍼 (저 해제는 필요 하지 않습니다이 단계에서) 회전 하는 플랫폼은 4 ° C에 5 분 동안에 비즈를 씻어. 4 ° c.에 1 분에 3000-5000 x g에서 원심 분리 하 여 비즈를 수집 비즈를 방해 하지 않고 최대한 많은 상쾌한에서 발음. 세척 단계 (3.10 ~ 3.12 단계)를 반복 하 여 두 번 더. 최종 세척 후 완전히 버퍼 상쾌한 제거. 비드 펠 렛의 중단을 최소화 (5% 손실)까지 허용 됩니다. 벌금을 사용 하 여 제거 잔여 상쾌한 단백질 팁을 로드를 낳았다. 비드 차입 버퍼의 30 µ L을 추가 하 고 터치 하 여 부드럽게 도청/튜브의 측면 구슬 resuspend. 이 단계에는 피 펫을 사용 하지 마십시오.주: 버퍼 구성에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오. 5 분 동안 실 온에서 품 어. 부드럽게 각 비드 현 탁 액 1.5 mL microcentrifuge 스핀 열을 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 배치 되었습니다 전송.참고:이 좋습니다 gentler 전송 위한 전송 피 펫 팁의 끝을 싹 둑. IP 샘플 수집을 실 온에서 1 분 동안 9000-10000 x g에서 원심. 각 샘플 2-mercaptoethanol의 2 µ L을 추가 하 고 잘 혼합.참고: 스핀 열에서 뚜껑 스냅을 사용 하 여이 추가 처리를 위해 컬렉션 튜브 캡에 편리 하다. 실시간에서 1 분 동안 10000 x g에서 원심 분리 하 여 샘플 5 분 수집 샘플 95 ℃ 물 욕조에 배치 필요한 경우 샘플-70 ° C에서 저장 여기, 중지 또는 SDS 페이지, 전송, 그리고 서쪽 오 점 분석 (제 4)를 실행 하는 진행. 4. 관심사의 단백질의 서쪽 오 점 분석: 식별 나트륨 라우릴에 의해 별도 샘플 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 황산 및 표준 실험실 프로토콜32에 따라 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막에 전송. 1 차적인 항 체를 사용 하 여 관심사의 단백질의 post-translationally 버전을 감지 하. 여기, PD L1 항 체 검출 post-translationally 수정된 PD L1 사용 되었다. 磁 화학 검출 시 약을 사용 하 여 검색.참고: chemiluminescent 시는 HRP 표시 된 이차 항 체 1 차적인 항 체를 검출 할 수와 함께에서 사용 해야 합니다. 미니 gel 크기 전송 막 (약 8 x 7 cm) 당 chemiluminescent 시 약의 2 mL의 볼륨을 사용 합니다. 적절 한 이차 항 체를 가진 외피 후 (RT에서 60 분 권장) 트윈-20 (TBST) 염 분 tris 버퍼의 30 mL에 오 점 6 x 10 분을 씻어.주: 버퍼 구성에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오. 즉시 사용 하기 전에, chemiluminescent 시 B (한 8 cm x 7cm 멤브레인에 대 한 충분 한)의 1 mL chemiluminescent 시 A의 1 mL 혼합. 막에 chemiluminescent 시 약을 추가 하 고 1-5 분의 단백질 신호 x 선 필름 또는 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라 이미징 사용 하 여 시각화 이전 RT에서 부드러운 락으로 품 어.참고: chemiluminescent 시 약에 부 화 시간 단축 매우 풍부한 단백질에 대 한 필요할 수 있습니다.

Representative Results

이러한 4 PTMs를 효과적으로 감지 하 여 PTM 누화를 조사 이러한 도구 수는 부분적으로 독특한 세포의 용 해 버퍼 시스템에 의존 합니다. : BlastR 변성 버퍼 효과적으로 격리 다른 변성 버퍼와 유사 하 게 모든 셀룰러 구획에서 단백질을 완전 한 단백질 프로 파일 (그림 2A)을 보장 합니다. 또한, 그것은 스모 2/3, radioimmunoprecipitation 분석 결과 (RIPA) (그림 2B) 같은 비 변성 시키기 버퍼에서 빠르게 감소 같은 매우 불안정 PTM 신호를 유지 합니다. 중요 한 것은, 적절 하 게 희석 할 때 다른 변성 버퍼 (예: Laemmli 버퍼) 같은 선호도 시 약의 무결성을 적용 되지 않습니다. 변성 버퍼를 작업할 때 중요 한 장애물 genomic DNA 오염을 효과적으로 제거 하는 기능입니다. 점도 줄이기 위해 기존의 방법론 주사기 바늘을 사용 하 여 샘플 sonicating DNA를 기울일 것입니다. 그림 3A 보여줍니다 genomic DNA 오염 A431 세포 lysate 치료 후: BlastR 필터, 주사기 바늘, 또는 쥡니다. 사실이 아닙니다: BlastR 필터를 사용 하 여 게놈 DNA의 거의 완전 한 제거는 사용 하 여 기존의 주사기 바늘 또는 쥡니다. 게놈 DNA 오염은 SDS 아크릴 아 미드 젤; 통해 단백질 마이그레이션에 크게 영향을 그러나, 치료: BlastR 필터 genomic DNA, 적절 한 단백질 마이그레이션 (그림 3B) 결과 제거 합니다. 게놈 DNA 오염으로 인 한 변경 된 마이그레이션 크게 서양 오 점;의 해석에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어는 필터링에서 본 듯한 EGFR 패턴 lysate 수 있을 정확 하 게 해석 필터링된 샘플 (그림 3C)을 기준으로 증가 식으로. 이 최적화 된 PTM 농축 및 탐지 시스템을 이용 하 여 한 수 빠르게 확인 대상 단백질 하나에 의해 수정 또는 PD L1 PTM 프로필의 더 PTMs. 조사 최근이 기술을 사용 하 여 수행한 결과 나타났다는 PD L1 acetylated, ubiquitinated 그리고 티로신 phosphorylated EGF (그림 4)에 대 한 응답. 중요 한 것은, 이러한 데이터 보고 생 PD L1 PTM 변경, 총 PD L1 식별의 작은 백분율을 대표 했다. 그림 1:: BlastR 필터와 세포 lysate에서 게놈 DNA 필터링. (A) : BlastR 이미지 필터. (B) Lysate 15 mL 컬렉션 튜브에 배치 했다 필터에 로드 됩니다. (C) 플런저는 주사기에 놓이고 lysate이 압축에 의해에 필터를 통해 전달 됩니다. (D) lysate, 완전 한 압축을 통해 모든 거품을 포함 하 여 수집 합니다. (E) 필터링 된 lysate 그림 2: 대체 세포의 용 해 버퍼에: BlastR 세포의 용 해 버퍼의 비교. 그림 2A 호리 타 외. 에서 적응 2017 Biosci입니다. 담당자입니다. 31 (A) A431 세포: BlastR, RIPA, mPER, IP 세포 lysed 했다 (1 %SDS), 변성 시키기 및 Laemmli 세포의 용 해 버퍼. 모든 변성 lysates genomic DNA: BlastR 필터를 사용 하 여 제거 했다. 고 막, 세포질, 미토 콘 드 리아, 핵 표식에서 단백질의 격리는 각각 구획 마커 단백질에 대하여 항 체를 사용 하 여 결정 했다. (B) A431 세포: BlastR, RIPA, 및 1 %SDS 변성 버퍼 lysed 했다. Lysates 스모 2/3 또는 제어 IgG 선호도 구슬 immunoprecipitated 했다. 샘플은 SDS 페이지 구분 되었고 스모 2/3-양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 항 체를 사용 하 여 서쪽 오 점 분석. 대표는 독립적인 실험 표시 됩니다 N≥3에서 몰아내고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3:: BlastR 세포 필터 게놈 DNA를 제거에 효과적 이다. (A) A431 세포 변성 세포의 용 해 버퍼 lysed 했다. 게놈 DNA 제거 되었거나 전단: BlastR 필터, 주사기 바늘, 또는 5, 10, 20, 또는 30 초 동안 쥡니다. 2%는 lysate의 ethidium 평범한 사람, agarose 젤 전기 이동 법에 의해 분석 되었다. (B) A431 세포에서 Lysate lysed 변성 버퍼 중 하나 필터링 하거나: BlastR 필터와 필터링. 샘플은 SDS 페이지와 분리 되 고 Coomassie 얼룩을 사용 하 여 시각. (C) B에서 복제 샘플 구분 했다 SDS 페이지, PVDF, 전송 그리고 EGFR 단백질 EGFR 항 체를 사용 하 여 시험 되었다. N ≥3 독립적인 실험에서 대표 오 점 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4: PD L1에 대 한 포스트 번역 상 수정 EGF 유도. 호리 타 외. 에서 적응 하는 그림 2017. 신 생물30(A). A431 세포 혈 청 제한 중 unstimulated (UT) 또는 세포 세포의 용 해 버퍼: BlastR 전에 한 시간 동안 EGF와 자극. WCL PD L1 수준 (1, 2 차선)에 대 한 분석 했다. 유비퀴틴 바인딩 구슬 (UBA01) IP ubiquitinated 단백질 (3, 4 차선)에 사용 되었다. Phosphotyrosine 바인딩 구슬 (APY03) IP 티로신 phosphorylated 단백질 (5, 6 차선)에 사용 되었다. 스모 2/3 바인딩 구슬 (ASM24) IP SUMOylated 2/3 단백질 (7, 8 차선)에 사용 되었다. 틸 리 바인딩 구슬 (AAC01) IP acetylated 단백질 (레인 9, 10)을 사용 했다. 바인딩 컨트롤 구슬 igG IP 일반적인 바인딩 단백질 (레인 11,12) 하는 데 사용 했다. 샘플은 SDS 페이지 구분 되었고 PD L1 항 체를 사용 하 여 서쪽 오 점 분석. N ≥3 독립적인 실험에서 대표 오 점 표시 됩니다. 화이트 별표 PD L1 평 및 Ac 단백질 밴드를 강조 하기 위해 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. : BlastR 세포의 용 해 버퍼에 대 한 계산 1.0 mL 2.0 mL 5.0 mL 10.0 mL : BlastR 세포의 용 해 버퍼 965 Μ L 1930 Μ L 4.825 mL 9.650 mL 티로신 인산 가수분해 효소 억제 물 5 Μ L 10 Μ L 25 Μ L 50 Μ L 드-ubiquitinase/드-sumoylase 억제제 10 Μ L 20 Μ L 50 Μ L 100 Μ L HDAC 억제제 10 Μ L 20 Μ L 50 Μ L 100 Μ L 프로 테아 제 억제 물 칵테일 10 Μ L 20 Μ L 50 Μ L 100 Μ L : BlastR 희석 버퍼에 대 한 계산 4.0 mL 8.0 mL 20.0 mL 40.0 mL : BlastR 세포의 용 해 버퍼 3.86 mL 7.72 mL 19.3 mL 38.6 mL 티로신 인산 가수분해 효소 억제 물 20 Μ L 40 Μ L 100 Μ L 200 Μ L 드-ubiquitinase/드-sumoylase 억제제 40 Μ L 80 Μ L 200 Μ L 400 Μ L HDAC 억제제 40 Μ L 80 Μ L 200 Μ L 400 Μ L 프로 테아 제 억제 물 칵테일 40 Μ L 80 Μ L 200 Μ L 400 Μ L 표 1: 세포의 용 해 및 희석 버퍼 준비 차트. 대 세포 세포의 용 해에 대 한 주어진된 세포의 용 해 및 희석 버퍼 볼륨 준비할 때 버퍼를 추가 억제제의 농도 제공 하는 차트. 플레이트 단백질 콘텐츠 권장된: BlastR 세포의 용 해 버퍼 볼륨 권장된: BlastR 희석 버퍼 볼륨 < 1 mg 여러 접시에서 단백질 결합 1.5 mL 최종 볼륨을 1-2 mg 300 Μ L 1.5 mL 최종 볼륨을 2-4 밀리 그램 600 Μ L 3 mL 최종 볼륨을 4-6 mg 900 Μ L 4.5 mL 최종 볼륨을 표 2: : BlastR 세포/희석 버퍼 차트. Lysate를 얻을 때 세포의 용 해 및 희석 버퍼 볼륨을 권장 차트 제공. 볼륨 세포 lysate의 정밀 레드 단백질 분석 실험 시 약 (µ L)의 1 ml에 추가 OD600 를 읽고 샘플 사용 하 승수 10 10 20 5 30 3.3 40 2.5 50 2 표 3: 분 광 광도 계 수치 mg/mL를 변환할 배율 Lysate. 단백질 농도 계산으로 보좌관을 변환 숫자를 제공 하는 차트. 선호도 구슬 비드 슬러리/IP (mL)의 볼륨 Ubiquitination 20 Phosphotyrosine 30 SUMOylation 2/3 40 Acetylation 50 제어 구슬 비드 슬러리/IP (mL)의 볼륨 Ubiquitination 제어 구슬 20 Phosphotyrsoine 제어 구슬 30 SUMOylation 2/3 제어 구슬 40 Acetylation 제어 구슬 50 표 4: 구슬/IP 차트의 볼륨 권장. 차트 제공 IP 반응 당 사용 하 여 선호도 구슬의 금액을 권장 합니다.

Discussion

대상 단백질은 PTM에 의해 수정 된 경우 확인 하는 데 사용 되는 초기 접근 IP, PTM 항 체와 서쪽 오 점 순이 대 한 대상 단백질 특정 항 체를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 (예., 반대로 아 세 틸 리), 또는 ip, PTM 항 체를 사용 하 여 다음 대상 단백질 특정 항 체³⁰^,^,³¹³³와 서쪽 오 점. 두 가지 방법을 이론적으로 일 하는 동안 특정 대상 단백질 항 체를 이용 하는 더 많은 잠재적인 함정, 항 체 IP 호환 되지 않을 수 있습니다. 또는 큰 PTM 수정^{34 대상 단백질에 항 체 인식 사이트를 차단할 수 있습니다.} ^,³⁵. PTM 선호도 구슬의 장점은 항 체 또는 바인딩 도메인 특별히 관심;의 PTM 인식 따라서, 대상 단백질에 대 한 수정 선호도 구슬에 의해 인식을 변경 하지 해야 합니다. 예를 들어, PD L1 Ub 여기서 설명 하는 기술을 발견 했다 고 두 내 생 모노-및 폴 리-Ub (그림 4) 관찰 되었다. 임 외최근 간행물. Ub 기술 PD L1 Ub, 조사를 생체 외에서 활용 하 고 결과 그림 4³⁶에 표시 된 결과 매우 비슷합니다. 흥미롭게도, 그들은 또한 수행 IP PD-l 1 세포 lysate에서 Ub overexpressed 했다 및 밀리 그램-132는 신호를 향상 시키기 위해 추가 되었습니다 풍요롭게 하 PD L1 항 체. Ub 패턴 강력 하 고 생체 외에서 Ub 패턴에서 매우 독특한 아니었다. 셀 문화 모델에서 내 생 PD L1 Ub의 조사는 임 외에 수행 되지 않습니다. 그들의 세포 생체 외에서 문화 및 데이터 간의 차이 명확 하 게 보고 합니다.

단백질은 PTM 수정 여부를 조사 하 고 낮은 풍부 및 과도 자연³⁷^,³⁸, 도전적 일 수 있다 하며 종종 IP 통해 농축. 효과적인 IP PTMs 최적화를 여러 주요 단계 및 시 약, 세포의 용 해 버퍼 및 선호도 시 약 등이 필요합니다. 조사 대상 단백질의 여러 PTMs, 필요한 최적화 가능성이 증가 합니다. 그것은 단일 시스템에서 평, 스모 2/3, Ub, Ac PTMs의 PTM 검출 하면서 강력한 IP 기능 유지: blastR 세포 시스템을 활용 하 여이 프로토콜에 중요 한 단계입니다. 이 기술은 특정 대상 단백질이 4 PTMs에 의해 수정 되 고 잠재적으로 여러 세포 시스템을 사용 하 여 수행 하는 PTM 결과 비교 기준으로 PTM 누화의 더 나은 그림을 제공 합니다 있는지 확인 하는 데 필요한 자원과 시간을 최적화 합니다. 조사: blastR 세포 시스템의 호환 glycosylation, 같은 대체 PTMs의 수행 되었다; 그러나, 그것은 하지 되었습니다 조사 철저 PTMs의 모든 종류에 대 한.

풍부한 게놈 DNA 단백질 측정을 사용 하 여 방해할 수 있습니다 색도계 또는 nanodrop 메서드는 SDS 아크릴 아 미드 젤에 단백질의 마이그레이션에 영향을 미칠 및 IP 분석 하는 동안 단백질 및 선호도 매트릭스 상호 작용을 방지. 여기 설명 하는 방법을 효과적으로 게놈 DNA 오염,이 프로토콜의 또 다른 중요 한 단계는 제거 하는 특수 필터를 사용 합니다. 이 시점을 강조 표시, 점성 테스트를 수행한: blastR 필터 처리, 전후 그리고 결과 물 (데이터 표시 되지 않음)의 점도 고 점도 감소를 보여주었다. 점도이 변화는 그림 3, 거의 모든 게놈 DNA를 제거 했다 보여주는 결과 의해 지원 되었다. 중요 한 것은,이 방법으로 DNA 전단 하지 어떤 전단된 DNA 필터 (데이터 표시 되지 않음)에 의해 생포 되지 것입니다. 이 도구는 쥡니다 또는 주사기-DNA-전단, 같은 기존의 방법 보다 있기 때문에 특수 장비를 요구 한다, 높은 재현성은 그것을 깎는 대신 DNA를 제거 합니다. 또한, 그것은 하지 기존의 방법²⁹를 사용 하 여 발생할 수 있는, lysate에서 단백질을 저하 됩니다. 필터를 활용 하 여 DNA의 효과적인 분석 (즉, 전단 주사기) 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다 및 DNA 오염 물질은 lysate 남아 샘플이 발생할 수 있습니다 다른 방법에 비해 샘플 당 5-30 초 걸립니다. Lysate 사전 및 사후: blastR 필터링의 광범위 한 분석을 수행한, 그리고 단백질 프로필에 현저한 차이가 Coomassie, 특정 대상 서 부, 또는 총 및 대상별 PTM 분석;에 의해 관찰 되었다 따라서, 단백질 프로 파일의 무결성 수 없습니다 되었습니다 영향을 genomic DNA 필터링 하 여. 궁극적으로,이 필터 시스템은 도움이 서쪽 또는 IP 응용 프로그램 genomic DNA에 존재 하 고 단백질 분석의 해석에 영향을 미칠 수 있습니다.

틀린 부정적인 탐지 선호도 비드 채도, 바인딩 사이트 간섭 또는 PTM 마스킹에 부분적으로 만기가 될 수 있습니다이 기법을 활용 하 여에 대 한 잠재적인는 중요 하다. 예를 들어, 특정 대상 단백질 Ac; 매우 낮은 수준에서 수정할 수 있습니다. 따라서, 그것은 더 풍부한 Ac 수정 대상 단백질에 의해 포화 팬 틸 리 선호도 구슬에 의해 격리 되지 않을 수 있습니다. 지속적인 연구 활용이 프로토콜에 선호도 시 약의 검출 한계를 평가 하기 위해 수행 되 고 하지만 최근 게시 매우 강력한 검출 한계를 나왔다. 데이터 보여주었다이 기술을 식별할 수 있는 몇 가지 셀³¹당 17 acetylated 대상 단백질 분자. 아직도, 특이성, 특정 자극에 대 한 응답에서 과도 PTMs를 입력 하는 셀 등 특정 상황 또는 단백질 상호 작용으로 인해 PTMs의 마스킹 틀린 부정적인 결과에서 모든 결과 수 있습니다. 이들은 대부분 PTM IP 방법 뿐만 아니라이 기술을의 잠재적인 함정입니다. 따라서, 여러 방법을 사용 하 여 결과 확인 하는 것이 좋습니다.

수정 glycosylation 및 인 산화와 같은 유사한 아미노산³⁹^,⁴⁰, ubiquitination 및 인 산화 단백질의 조절을 순차적으로 작동 하도록 표시 되었습니다. 처럼 다른 PTMs 경쟁 표시 되었습니다. ¹⁷^,⁴¹기능. Neuropathological 단백질 타우에 최근 작품 PTM 누화, 인 산화 타우 하이퍼-그리고 타우 SUMOylation⁴²를 서로 강화의 중요성을 강조 했다. 또한,이 그룹을 방지 하는 타우의 SUMOylation 폴 리-Ub와 후속 타우 저하, 집계에 보여주었다. 이 규제 PTM 누화의 많은 예 중 하나 이며이 기술은의 유틸리티 PTMs 및 건강과 질병에서 주요 단백질 조절에 그들의 크로스 토크의 중요성을 밝히는 데 도움이 될 것입니다.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리가 그들의 중요 한 검토, 편집 및 원고에 대 한 유익한 토론에 대 한 골격 Inc. 연구 과학자와 박사 브라이언 후버와 애슐리 데이비스 감사 합니다. 또한, 우리 박사 로버트 홈 비디오 원고의 생산 동안에 그의 기여에 대 한 감사합니다. 이 작품에서 골격 주식 회사 자금에 의해 지원 되었다

Materials

Cell lysis/genomic DNA removal and analysis
1x phosphate buffered saline (PBS)	common buffer		Recipe: NaCl, KCl, Na₂HPO₄, KH₂PO₄
BlastR lysis buffer	Cytoskeleton Inc.	BLST01	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA)	common buffer		Recipe: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal
Mammalian protein extraction reagent (mPER)	Thermofisher	78503	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Immunoprecipitation (IP) Lysis	Pierce	87787	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
1% sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing buffer	common buffer		Recipe: PBS, SDS, EDTA, EGTA
Laemmli	common buffer		Recipe: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromophenol blue
BlastR dilution buffer	Cytoskeleton Inc.	BDB01	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Protease Inhibitor Cocktail	Cytoskeleton Inc.	PIC02
N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN)	Cytoskeleton Inc.	NEM09BB
Trichostatin A (TSA) & Nicotinamide	Cytoskeleton Inc.	TSA01
Activated Sodium Orthovanadate (Na₃VO₄₎	Cytoskeleton Inc.	PYI01
cell scrapers	Costar	3008
BlastR Filter	Cytoskeleton Inc.	BLR02
BD Insulin syringe needle	BD	08290-3284-11
sonicator (Branson Sonifier)	Branson	Sonifier 450
Precision Red Advanced Protein Reagent	Cytoskeleton Inc.	ADV02
1 mL cuvettes	Fisher	14955127
Spectrophotometer (Genesys20)	Thermofisher	4001	Other spectrophotomers can be used to measure protein concentration
Agarose	Fisher	BP1356-500
1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder	NEB	N3232L
DNA gel box	Thermofisher	7312 B1A
Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer	common buffer		Recipe: Tris-HCl, Boric Acid, EDTA
PTM Immunoprecipitation
Phosphotyrosine beads	Cytoskeleton Inc.	APY03-beads
Ubiquitination beads	Cytoskeleton Inc.	UBA01-beads
SUMOylation 2/3 beads	Cytoskeleton Inc.	ASM24-beads
Acetylation beads	Cytoskeleton Inc.	AAC04-beads
Phosphotyrosine control beads	Cytoskeleton Inc.	CIG01-beads
Ubiquitination control beads	Cytoskeleton Inc.	CUB02-beads
SUMOylation 2/3 control beads	Cytoskeleton Inc.	CIG01-beads
Acetylation control beads	Cytoskeleton Inc.	CIG02-beads
BlastR wash buffer	Cytoskeleton Inc.	BWB02	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Bead elution buffer	Cytoskeleton Inc.	BEB01	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
microcentrifuge	Eppendorf	5417	Other microcentrifuges can be used
tube rotator	ATR	RKVSD	Other end-over-end tube rotators can be used
protein loading tips	VWR	37001-150
spin columns	Cytoskeleton Inc.	SPN22
heat block 95 °C	Benchmark	BSH1002
SDS-PAGE/Transfer/Western analysis
5x sample buffer	common buffer		recipe: Bromophenol blue, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl
novex wedge well 4-20% Tris-gly gels	Invitrogen	XP04200BOX	The large wedgewells are excellent for loading large volumes
1x Running buffer	common buffer		recipe: Tris-HCl , Glycine, SDS
seeblue protein ladder	Life Technologies	LC5625
electrophoresis cell	Invitrogen	Xcell surelock electrophoresis cell	Other electrophoresis cells can be used, however these are compatible the novex wedgewell gels
power supply	Biorad	PowerPac HC	Other power supplies can be used
1x Transfer buffer	common buffer		recipe: Tris-HCl, glycine, methanol
Transfer cell	Biorad	mini trans-blot cell	Other transfer cells can be used
Immobilon- P membranes (PVDF)	millipore	IPVH 304F0
non-fat milk	thrive	813503015095
Tris buffered saline with tween (TBST)	common buffer		recipe: Tris-HCl, NaCl, Tween 20
Chemiluminescent Detection Reagent	Cytoskeleton Inc.	CLRA/CLRB
Cell growth and treatment
Dulbecco's Modified Eagle's medium	ATCC	30-2002
Fetal bovine serum	ATLAS	F-0500-A
Epidermal growth factor	Cytoskeleton Inc.	CN02-A
150 mm cell culture plates	Corning	430599

Referanslar

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Immunoprecipitation PTM Post-translational Modification Cell Signaling Lysate Blaster Filter Protein Quantitation A431 Cells Lysis Buffer DNA Removal

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Horita, H., Law, A., Middleton, K. Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins. J. Vis. Exp. (131), e56912, doi:10.3791/56912 (2018).