Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Henrick Horita; Andy Law; Kim Middleton

doi:10.3791/56912

JoVE Journal > Biochemistry

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Biyokimya

Utilisant un système d’enrichissement immunoprécipitation complète afin d’identifier un profil endogène Modification post-traductionnelle des protéines cibles

Published: January 08, 2018

doi:

10.3791/56912

Henrick Horita¹, Andy Law¹, Kim Middleton¹

¹R&D Department,Cytoskeleton Inc.

Özet

Enquêtes multiples, des modifications post-traductionnelles endogènes pour une protéine cible peuvent être extrêmement difficiles. Utilisent les techniques décrites ici un système tampon et de filtre de lyse optimisé développé avec PTM-ciblage spécifique, des matrices d’affinité afin de détecter les modifications de la phosphorylation acétylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 et de la tyrosine pour une cible protéine à l’aide d’un système unique et simplifié.

Abstract

Il est maintenant bien apprécié que les modifications post-traductionnelles (PTMs) jouent un rôle essentiel dans la régulation de la protéine de structure et la fonction, qui peut-être être essentielle pour le rôle d’une protéine donnée fois physiologique et pathologique. Enrichissement des SPTM est souvent nécessaire lors d’enquêtes sur le statut PTM d’une protéine cible, car MEA est souvent transitoires et relativement pauvre en abondance. Beaucoup de pièges est rencontrés lorsque enrichissante pour un PTM d’une protéine cible, tels que l’incompatibilité de la mémoire tampon, l’anticorps de protéine cible n’est pas compatible IP, perte de signal PTM et autres. Le degré de Difficulté est amplifié lors d’enquêtes sur plusieurs SPTM comme acétylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 et la tyrosine phosphorylation d’une protéine cible donnée. Étudier une combinaison de ces MPT peut être nécessaire, comme la diaphonie entre SPTM est répandue et critique pour le règlement de la protéine. Souvent, ces SPTM est étudiés dans des tampons de lyse différents et avec des compositions unique inhibiteur. Pour simplifier le processus, un système unique de lyse dénaturation a été développé qui effectivement isole et conserve ces quatre SPTM ; permettant ainsi, enquête de diaphonie potentielle dans un système unique de lyse. Un système de filtrage unique a été conçu pour enlever contaminer l’ADN génomique de lysat, qui est un sous-produit problématique de dénaturation des tampons. Matrices d’affinité ciblant chacun de la quatre SPTM ont été élaborées de concert avec le système de tampon pour maximiser l’enrichissement et la détection des États endogènes de ces quatre PTMs. Cet ensemble d’outils de détection complète PTM rationalise le processus d’obtention des informations critiques sur la question de savoir si une protéine est modifiée par un ou plusieurs de ces SPTM.

Introduction

Les modifications post-traductionnelles (PTMs) sont des altérations fortement réglementées à une protéine, par laquelle la modification est ajoutée ou supprimée de manière spécifique. SPTM est souvent dynamiques, transitoires des changements qui modifient sensiblement la structure de la protéine, interactions avec les protéines de partenaire et localisation spatiale et permettant en fin de compte la protéine effectuer des fonctions distinctes de¹^,² ^, ³ ^, ⁴. SPTM est si abondants qu’ils augmentent le nombre de formes de protéines uniques (ou proteoforms) d’environ 30 000 produits de gènes à plus 1 million de proteoforms⁵^,⁶. Identifier les SPTM et définir leur effet sur une protéine cible sont essentiel dans la compréhension des fonctions physiologiques et pathologiques⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^{, de la protéine} ¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴. Travaux sur les protéines select comme tubuline, p53 et récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) ont élucidé le rôle réglementaire des SPTM¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. Ces études ont découvert que la régulation de ces protéines se fait par SPTM multiples, et dans de nombreux cas, ces modifications travaillent de concert pour promouvoir une fonction spécifique. De nouvelles études ont montré cette diaphonie PTM coopératif et négative peut se produire plusieurs protéines différentes¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^, ²³^,²⁴^,²⁵. Cependant, les profils PTM de la plupart des protéines sont construits de plusieurs études qui ont utilisé des modèles différents et des conditions particulières. Avoir un système optimisé pour étudier la SPTM multiples dans un seul système serait très bénéfique pour avoir un aperçu de diaphonie PTM potentiel pour une protéine cible.

Un défi d’enquêter sur les SPTM dans un seul système est que SPTM spécifiques est étudiées à l’aide de tampons de lyse distinctes. Par exemple, l’utilisation de tampons comme RIPA ou NP-40 qui sont couramment utilisés pour les enquêtes de phosphorylation ou ubiquitination peut être insuffisante pour étudier un PTM labile comme petite ubiquitin-comme modificateur (SUMO) ylation²⁶. En outre, tampons non-dénaturisation ne conviennent pas à dissocier les interactions entre protéines et peuvent conduire à des faux positifs PTM identification²⁷. Enquête sur MEA dans un tampon de lyse dénaturation peut être préférable, car il est nettement mieux à isoler des protéines de tous les compartiments cellulaires²⁸, dissociera la plupart des interactions de protéine et empêchera des protéases qui modifient les États PTM, tels que deSUMOylases ²⁶; Cependant, dénaturation des tampons peut compromettre l’intégrité des réactifs d’affinité spécifique comme ubiquitine contraignant des outils basés sur un domaine de²⁷. Développement d’un système de type dénaturation lyse afin d’étudier plusieurs SPTM d’une protéine dans un système de réactif compatible affinité serait très avantageux pour les enquêtes de diaphonie PTM.

Bien que dénaturation tampons principaux avantages par rapport aux tampons non dénaturants pour enquêter sur les SPTM, ils sont moins fréquemment utilisés en raison de leurs inconvénients significatifs, tels que l’incompatibilité avec des analyses de protéines classiques, importantes génomique contamination de l’acide désoxyribonucléique (ADN) et la perturbation d’immunoprécipitation (IP) réactifs²⁹. Ces inconvénients peuvent causer dans le temps de préparation longue et dommages potentiels aux protéines cibles lorsque l’ADN génomique de cisaillement. Deux méthodes couramment utilisées pour cisailler ADN comprennent seringue lyse et sonication²⁹. Les deux méthodes nécessitent une optimisation et manquent souvent de reproductibilité précise. Méthodes alternatives pour éliminer l’ADN génomique comprennent l’ajout de DNase ; Toutefois, cela peut nécessiter une optimisation supplémentaire et des changements dans la composition du tampon. En fin de compte, une méthode simple et reproductible pour éliminer la contamination ADN génomique serait bénéfique lorsque vous travaillez avec la dénaturation des mémoires tampons de lysis à des investigations de PTM.

Cette technique vise à élaborer un système permettant d’isoler et d’enquêter sur l’ubiquitination (Ub), la phosphorylation de la tyrosine (pY), SUMOylation 2/3 (SUMO 2/3) et SPTM acétylation (Ac) en un seul système pour mieux étudier diaphonie PTM pour une protéine cible. Ce système de détection des PTM a été utilisé pour enquêter rapidement sur le profil PTM endogène de plusieurs protéines cibles dans un seul système. Nouvel aperçu de la diaphonie potentiel a été identifié³⁰^,³¹. Dans l’ensemble, la technique décrite ici améliore tributaire des méthodes existantes pour enquêter sur la MEA et PTM diaphonie de trois manières distinctes : 1) un tampon unique de dénaturation a été développé que les isolats de protéines de tous les compartiments cellulaires, tout en étant compatible avec Réactifs d’affinité de PTM, 2) un système de filtrage unique a été développé qui supprime la contamination d’ADN génomique de lysats dénaturés avec une reproductibilité élevée et nécessite aucun équipement spécialisé et 3 rapidement) les billes d’affinité robuste, système de lyse et inhibiteurs les réactifs sont compatibles ; ainsi, simplifiant l’isolement de ces quatre SPTM pour une protéine cible pour maximiser l’enrichissement PTM et examiner efficacement les interférences potentielles.

Protocol

1. préparation : Cell Culture Pousser les quatre plaques de 150 mm de cellules A431 au moyen de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM) additionné de sérum de veau fœtal 10 %. Atteindre les cellules A431 confluence de 50 %. Sérum de restreindre les quatre plaques de cellules A431 avec DMEM sans sérum pendant 24 h. Traiter les deux plaques de cellules A431 avec 33,3 mg/mL de facteur de croissance épidermique pour 1 h. laisser les deux autres plaques non traitées.NOTE : Conditions de croissance et traitement de cellules montrées ici donner un exemple ; Cependant, cette méthodologie s’applique à beaucoup de différents types de cellules et de conditions de traitement. Préparer blastR lyse et la dilution des tampons avec des inhibiteurs (tableau 1). Allient 2,895 mL de tampon de lyse blastR 15 µL d’inhibiteur de la tyrosine phosphatase, 30 µL de deubiquitinase et inhibiteur de la deSUMOylase, 30 µL d’inhibiteur d’histone désacétylase (HDAC) et 30 µL d’inhibiteur de la protéase cocktail. Allient 9,65 mL de tampon de dilution blastR 50 µL d’inhibiteur de la tyrosine phosphatase, 100 µL de deubiquitinase et inhibiteur de la deSUMOylase, 100 µL d’inhibiteur d’histone désacétylase (HDAC) et 100 µL de l’inhibiteur de la protéase cocktail.Remarque : Consultez la Table des matières pour les informations de composition et d’inhibiteur de tampon. Décanter les milieux de culture et placer les cellules sur la glace. Ensuite, laver les cellules deux fois avec 10 mL de 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Eliminez autant PBS que possible avant d’ajouter le tampon de lyse blastR afin de maximiser la lyse cellulaire.Remarque : Consultez la Table des matières pour la composition du tampon. Ajouter 600 µL de tampon de lyse blastR pour chaque plaque de 150 mm. La quantité de solution tampon fondée sur le rendement attendu de protéine (tableau 2). Lyse des cellules à l’aide d’un grattoir de cellules. Le lysat deviendra visqueux à cause de la lyse nucléaire. Utiliser une pointe de pipette ciselée 1 mL pour transférer le lysat brut dans un filtre blastR qui a été placé dans un tube de prélèvement de 15 mL (Figure 1). Ici, un tube de 15 mL falcon est utilisé. Un plongeur de filtre fourni permet de compresser le filtre blastR complètement et de recueillir le lysat intermédiaires, y compris les bulles, dans un tube de 15 mL (Figure 1). En option : Transfert a précisé lysat d’un tube de microtubes de 1,5 mL et centrifuger le lysat à environ 10 000 x g pendant 1 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube falcon de 15 mL. Diluer le clarifié lysat avec tampon de dilution blastR pour un volume final de 3 mL pour chaque plaque de 150 mm. Le volume final fondé sur le rendement attendu de protéine (tableau 2).Remarque : Cette étape est importante car la composition du tampon final aura une incidence sur la rigueur de réaction IP. Doser la concentration de protéines (section 2). 2. protéines dosage dosage Remarque : Utiliser un test de dosage protéique colorimétrique standard pour déterminer le dosage de la protéine. Ici, dosage de la protéine est déterminée au moyen d’analyse de protéine pointe rouge de précision. Ajouter 1 mL de réactif d’analyse de précision rouge pointe protéines à chacun des deux cuvettes de 1 mL. Mix 10 µL de tampon de lyse blastR et 40 µL de tampon de dilution blastR dans un tube de microcentrifuge propre 1,5 mL sur la glace.NOTE : Ceci sera utilisé pour la lecture de l’échantillon de protéine vide. Ajouter 20 µL du mélange tampon lyse/dilution (de l’étape 2.2) à la première cuve et mélanger en retournant deux à trois fois. Ajouter 20 µL de la cellule diluée lysate (d’expérience) à la deuxième cuve, mélangeant comme indiqué ci-dessus. Incuber les échantillons pendant 1 min à température ambiante. Spectrophotomètre vide avec l’échantillon de mélange de tampon de lyse/dilution (de l’étape 2.3). Mesurer l’absorbance de l’échantillon de lysat (de l’étape 2.4) à 600 nm. Déterminer la concentration de lysat protéique comme suit ;échantillon de lecture OD600 x 5 = concentration de la protéine en mg/mLNOTE : Lectures OD inférieure à 0,05 ou supérieure à 0,5 sont proches de la capacité de gamme linéaire de l’analyse de protéine. Pour les lectures > 0,5, les échantillons peuvent être dilués. Pour les lectures < 0,05, plus lysat peuvent être ajoutés à la réactif d’analyse de la protéine avancée rouge précision (jusqu'à 50 µL). Voir le tableau 3 pour les multiplicateurs pour convertir les lectures de spectrophotomètre à concentration de lysat protéique mg/mL. S’il y a des protéines insuffisante dans une assiette, il est recommandé d’utiliser 2 ou plusieurs plaques par adresse IP. Dans ce cas, plaques seront récoltées en série, en transférant l’original 300 µL de tampon de lyse entre plaques. Basé sur la concentration de protéines, diluer l’échantillon avec un mélange de tampon (1 partie blastR lyse : 4 parties blastR dilution) à une concentration finale souhaitée (généralement 1 mg/mL). Composant logiciel enfichable geler aliquotes d’échantillons qui ne servira pas immédiatement. Conserver les échantillons à-70 ° C. Passez à la Section 3. 3. analyse d’immunoprécipitation (IP) NOTE : Affinité des concentrations de perle, des concentrations de lysats et temps d’incubation sont conseillées et peuvent être uniques pour chaque protéine cible et PTM spécifique à l’étude. Inverti stock tubes contenant des billes d’affinité Ub, pY affinité perles, billes de 2/3 d’affinité SUMO et billes d’affinité Ac plusieurs fois pour s’assurer que les perles sont complètement remis en suspension dans le tube. Pour chaque test IP, suspension perle aliquotes dans des tubes de microcentrifuge séparée 1,5 mL sur la glace (tube IP). Ici, ajouter 20 µL de billes d’affinité ubiquitine, 30 µL de billes d’affinité phosphotyrosine, 40 µL de billes de 2/3 d’affinité de SUMOylation ou 50µl de billes d’acétylation d’affinité aux tubes de microcentrifuge individuels 1,5 mL sur la glace.NOTE : Voir le tableau 4 pour le volume conseillé de suspension perles à utiliser pour chaque perle d’affinité. Il faut inverser les tubes stock contenant l’ubiquitination IP control perles et perles de contrôle de IgG plusieurs fois pour s’assurer que les perles sont complètement remis en suspension dans le tube. Billes de contrôle aliquote par réaction de contrôle afin de déterminer les liaisons non spécifiques (tube de contrôle IP). Ici, ajouter 20 µL de billes de contrôle Ub, 30 µL de billes de contrôle pY, 40 µL de perles de 2/3 contrôle SUMO ou 50µl de billes de contrôle Ac aux tubes de microcentrifuge individuels 1,5 mL sur la glace.NOTE : Voir le tableau 4 pour le volume conseillé de suspension perles à utiliser pour chaque type de perle d’affinité. Enregistrer une petite quantité de lysat (20 µL) à courir comme une tache occidentale lysat contrôle d’entrée. Ajouter 5 µL de tampon de 5 x et faire bouillir à 95 ° C pendant 5 min.Remarque : Consultez la Table des matières pour la composition du tampon. Ajouter lysat pour chaque IP tubes et IP de contrôle. 1 mg de lysat fut empruntée par réaction d’IP et de contrôle, soit un total de 8 réactions IP.Remarque : 1,0 mg de lysat par dosage est recommandé comme point de départ. Le montant de lysat volonté requise peuvent varier selon l’abondance de la protéine cible modifiée. Incuber les tubes sur une plate-forme tournante sur la fin à 4 ° C pendant 2 h. Ici, une coiffe de tube ATR a été utilisé à vitesse 22. Recueillir des perles par centrifugation à 3 000-5 000 x g pendant 1 min à 4 ° C. Aspirer hors autant surnageant possible sans déranger les perles. Laver les perles dans blastR 1 mL de tampon de lavage (inhibiteurs ne sont pas nécessaires à ce stade) pendant 5 min sur une 4 ° C plate-forme rotative. Recueillir des perles par centrifugation à 3 000-5 000 x g pendant 1 min à 4 ° C. Aspirer hors autant surnageant possible sans déranger les perles. Répétez l’étape de lavage (étapes 3.10-3.12) deux fois plus. Après le lavage final, supprimer complètement le surnageant de la mémoire tampon. Une perturbation minimale de la pastille de perle est acceptable (jusqu’à une perte de 5 %). Enlever le surnageant résiduel à l’aide d’une amende d’alésage protéine pointe de chargement. Ajouter 30 µL de tampon d’élution de perle et remettre en suspension les perles par doucement taraudage/effleurant la paroi du tube. NE pas utiliser une pipette à ce stade.Remarque : Consultez la Table des matières pour la composition du tampon. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Transférer doucement chaque suspension de perle à une colonne de spin de microtubes de 1,5 mL qui a été placée dans un tube de microtubes de 1,5 mL.Remarque : Il est recommandé de couper l’extrémité au large de la pointe de pipette de transfert pour le transfert de plus doux. Centrifuger à 9 000-10 000 x g pendant 1 min à température ambiante pour recueillir l’échantillon de la propriété intellectuelle. Ajouter 2 µL de 2-mercaptoéthanol dans chaque échantillon et bien mélanger.NOTE : Il convient d’enclencher le couvercle de la colonne et utilisez-le pour plafonner le tube de prélèvement pour un traitement ultérieur. Placer les échantillons dans un bain-marie à 95 ° C pendant 5 min. échantillon frais virés par centrifugation à 10 000 x g pendant 1 min à température ambiante. Si nécessaire, conserver les échantillons à-70 ° C et s’arrêter là ou procéder à l’exécution de SDS-PAGE, transfert et analyse par transfert western (Section 4). 4. immunobuvardage : Identification de la protéine d’intérêt Des échantillons distincts de sodium dodécyl sulfate sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et transfert sur une membrane de Polyfluorure de vinylidène (PVDF), selon les protocoles de laboratoire standard32. Un anticorps primaire permet de détecter les versions modifiées post-traductionnellement de la protéine d’intérêt. Ici, PD-L1 anticorps servait à détecter modifiées post-traductionnellement PD-L1. Utiliser réactif de détection ultrasensible de la chimiluminescence pour la détection.Remarque : Le réactif doit être utilisé en conjonction avec un anticorps secondaire marqué HRP capable de détecter l’anticorps primaire. Utiliser un volume de 2 mL de réactif par membrane de transfert de taille mini-gel (environ 8 x 7 cm). Après incubation avec l’anticorps secondaire approprié (60 min à ta est recommandé), lavez la tache 6 x 10 min à 30 mL de tampon tris salin avec tween-20 (TBST).Remarque : Consultez la Table des matières pour la composition du tampon. Immédiatement avant l’emploi, mélanger 1 mL de réactif chimioluminescent A 1 ml de réactif B (suffisant pour la membrane d’un 8 x 7 cm). Ajouter le réactif à membrane et incuber avec balancement doux à ta 1-5 min avant la visualisation du signal de protéine à l’aide de la radiographie ou dispositif à couplage de charge (CCD) caméra imagerie.Remarque : Des temps d’incubation plus courtes dans le réactif peuvent être nécessaires pour les protéines très abondantes.

Representative Results

La capacité de ces outils pour étudier la diaphonie PTM en détectant efficacement ces 4 SPTM dépend en partie le système de tampon de lyse unique. Le tampon de dénaturation blastR isole efficacement les protéines de tous les compartiments cellulaires de même d’autres tampons dénaturation, qui assure un profil de protéine complète (Figure 2 a). En outre, il conserve très labile PTM signaux comme SUMO 2/3, qui est rapidement diminué dans les tampons non-dénaturisation comme dosage immunoprécipitation (RIPA) (Figure 2 b). Ce qui est important, lorsque dilué correctement, elle n’affecte pas l’intégrité des réactifs affinité comme les autres tampons de dénaturation (p. ex., tampon de Laemmli). Un obstacle important lorsque vous travaillez avec des tampons de dénaturation est la capacité d’éliminer efficacement la contamination de l’ADN génomique. La méthodologie classique pour réduire la viscosité est de cisaillement de l’ADN en utilisant une aiguille de seringue ou sonification de l’échantillon. Figure 3 a montre contamination d’ADN génomique en cellules A431 lysat après traitement avec le filtre BlastR, aiguille de seringue ou la sonication. Il y a élimination presque complète de l’ADN génomique à l’aide du filtre BlastR, qui n’est pas le cas à l’aide d’une aiguille de seringue conventionnelle ou la sonication. Contamination d’ADN génomique altèrent la migration des protéines à travers un gel SDS-acrylamide ; Cependant, un traitement avec le filtre BlastR supprime l’ADN génomique, aboutissant à la migration correcte de protéine (Figure 3 b). Migration altération causée par la contamination d’ADN génomique peut affecter significativement l’interprétation du transfert western ; par exemple, le barbouillé EGFR vu dans le non filtrée lysat peut incorrectement interprété comme une expression accrue par rapport à l’échantillon filtré (Figure 3). En utilisant ce système de détection et d’enrichissement PTM optimisé, on peut rapidement déterminer si une protéine cible a été modifiée par l’un ou plus PTMs. enquête sur le profil de PD-L1 PTM a été récemment réalisée à l’aide de cette technique, et les résultats ont montré que le PD-L1 était ubiquitinées, acétylés et la tyrosine phosphorylées en réponse à l’EGF (Figure 4). Ce qui est important, ces données déclarées endogènes changements PD-L1 PTM, qui représentait un faible pourcentage du total PD-L1 identifiés. Figure 1 : filtrage de l’ADN génomique de lysat cellulaire avec filtre BlastR. (A) Image de BlastR filtre. (B) le Lysate est chargé dans le filtre qui a été placé dans un tube de prélèvement de 15 mL. (C) le piston est placé dans la seringue et le lysat est passé par le filtre de compression. (D) collecter lysat, y compris les bulles par compression complète. (E) filtrée lysate. Figure 2 : comparaison du tampon de lyse BlastR aux mémoires tampons de rechange lysis. Figure 2 a adapté de Horita et al. 2017. Biosci. Rep. 31 (A) les cellules A431 sont lysées avec BlastR, RIPA, se lyse IP, dénaturation (SDS de 1 %) et les mémoires tampons de lysis Laemmli. Tous les lysats dénaturation avaient ADN génomique supprimé à l’aide de BlastR filtre. Isolement des protéines de la membrane cytoplasmique, mitochondriale et les marqueurs nucléaires ont été déterminés en utilisant des anticorps contre les protéines de marqueur de compartiment respectif. (B) les cellules A431 sont lysées avec BlastR, RIPA et tampon dénaturant SDS de 1 %. Lysats ont été immunoprécipitée avec SUMO 2/3 ou contrôle IgG des billes d’affinité. Des échantillons ont été séparés par SDS-PAGE et analysées par western blot à l’aide d’un anticorps de 2/3-raifort peroxydase de raifort (HRP) de SUMO. Représentant blots de N≥3 expériences indépendantes sont indiqués. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : filtre de lyse BlastR est efficace pour éliminer l’ADN genomic. (A) les cellules A431 sont lysées avec un tampon de lyse dénaturation. L’ADN génomique a été supprimé ou cisaillée avec filtre BlastR, aiguille de seringue ou la sonication pour 5, 10, 20 ou 30 secondes. 2 % du lysat a été analysé par électrophorèse sur gel d’agarose, le bromure d’éthidium. (B) Lysate de cellules A431 lysées avec un tampon de dénaturation était soit non filtré ou filtre avec le filtre BlastR. Des échantillons ont été séparés par SDS-PAGE et visualisées à l’aide de tache de bleu de Coomassie. (C) des échantillons de deux exemplaires de B ont été séparés par SDS-PAGE, transféré en PVDF, et protéine EGFR a été étudiée à l’aide d’un anticorps EGFR. Des taches représentatifs d’expériences indépendantes de N ≥ 3 sont indiquées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : détection des modifications post-traductionnelles induite par l’EGF pour PD-L1. Adaptation du Horita et al. 2017. néoplasie30(A). Sérum-restreint de cellules A431 étaient soit non stimulée (UT) ou stimulent avec EGF pendant une heure avant la lyse avec tampon de lyse BlastR. CMT a été analysé pour niveaux PD-L1 (pistes 1, 2). Perles de liaison d’ubiquitine (UBA01) ont été utilisées pour les protéines ubiquitinées IP (pistes 3, 4). Phosphotyrosine perles de liaison (APY03) ont été utilisées pour les protéines tyrosine-phosphorylés IP (pistes 5, 6). Perles de liaison 2/3 de SUMO (ASM24) ont été utilisées pour IP SUMOylated 2/3 de protéines (pistes 7, 8). Perles de fixation de lysine acétyle (AAC01) ont été utilisées pour les protéines IP acétylé (voies 9,10). IgG perles de contrôle de liaison ont été utilisées pour les protéines de liaison non-spécifique IP (voies 11,12). Des échantillons ont été séparés par SDS-PAGE et analysées par western blot, en utilisant un anticorps PD-L1. Une représentant de la tache d’expériences indépendantes de N ≥ 3 s’affiche. Astérisques blancs ont été utilisés pour mettre en évidence les PD-L1 pY et bandes protéiques Ac. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Calculs pour le tampon de lyse BlastR 1,0 mL 2,0 mL 5,0 mL 10,0 mL Tampon de lyse BlastR 965 ΜL ΜL DE 1930 4,825 mL 9,650 mL Inhibiteur de la tyrosine-phosphatase 5 ΜL 10 ΜL 25 ΜL 50 ΜL inhibiteur de la de-ubiquitinase/de-sumoylase 10 ΜL 20 ΜL 50 ΜL 100 ΜL Inhibiteur d’HDAC 10 ΜL 20 ΜL 50 ΜL 100 ΜL Inhibiteur de la protéase cocktail 10 ΜL 20 ΜL 50 ΜL 100 ΜL Calculs pour le tampon de dilution BlastR 4,0 mL 8,0 mL 20,0 mL 40,0 mL Tampon de lyse BlastR 3,86 mL 7,72 mL 19,3 mL 38,6 mL Inhibiteur de la tyrosine-phosphatase 20 ΜL 40 ΜL 100 ΜL 200 ΜL inhibiteur de la de-ubiquitinase/de-sumoylase 40 ΜL 80 ΜL 200 ΜL 400 ΜL Inhibiteur d’HDAC 40 ΜL 80 ΜL 200 ΜL 400 ΜL Inhibiteur de la protéase cocktail 40 ΜL 80 ΜL 200 ΜL 400 ΜL Tableau 1 : Tampon de lyse et la Dilution préparation graphique. Tableau fournissant des concentrations d’inhibiteurs à ajouter pour une lyse et dilution tampon volume donné lors de la préparation met en mémoire tampon de lyse cellulaire. Teneur en protéines de la plaque Volume de tampon de lyse BlastR recommandé Volume de tampon de Dilution BlastR recommandé < 1 mg Combiner les protéines à partir de plusieurs plaques Pour rendre le volume final de 1,5 mL 1-2 mg 300 ΜL Pour rendre le volume final de 1,5 mL 2-4 mg 600 ΜL Pour rendre le volume final de 3 mL 4-6 mg 900 ΜL Pour rendre le volume final de 4,5 mL Tableau 2 : BlastR lyse/Dilution Buffer graphique. Tableau fournissant recommandé volumes de tampon de lyse et de la dilution lors de l’obtention de lysat. Volume du lysat cellulaire ajoutée à 1 ml de réactif de précision rouge Protein Assay (µL) Multiplicateur d’utiliser par exemple lecture OD600 10 10 20 5 30 3.3 40 2.5 50 2 Tableau 3 : Multiplicateurs pour convertir le spectrophotomètre lectures en mg/mL lysat. Tableau fournissant des numéros de conversion à l’aide avec le calcul de la concentration de protéines. billes d’affinité volume de lisier perle/IP (mL) Ubiquitination 20 Phosphotyrosine 30 SUMOylation 2/3 40 Acétylation 50 perles de contrôle volume de lisier perle/IP (mL) Perles de contrôle ubiquitination 20 Perles de contrôle Phosphotyrsoine 30 Perles de SUMOylation contrôle 2/3 40 Perles de contrôle acétylation 50 Tableau 4 : Recommandé Volume de perles/IP Chart. Tableau fournissant recommandé des quantités de perles d’affinité d’utiliser par réaction de la propriété intellectuelle.

Discussion

Approches initiales utilisées pour déterminer si une protéine cible est modifiée par un PTM peuvent être effectuées à l’aide de l’anticorps spécifique de protéine cible de la propriété intellectuelle, suivi par western blot avec un anticorps PTM (e.g., anti-acétyl lysine), ou en utilisant un anticorps PTM de la propriété intellectuelle suivi par western blot avec la cible protéine anticorps spécifique³⁰^,³¹^,,³³. Tandis que les deux approches ont théoriquement travaillent, utilisant un anticorps spécifique-protéine-cible a plus de pièges potentiels, tels que les anticorps peuvent ne pas être compatible IP ou modifications importantes de PTM peuvent bloquer le site de reconnaissance des anticorps à la protéine cible³⁴ ^,,³⁵. L’avantage des perles d’affinité PTM est que les domaines anticorps ou liaison reconnaissent spécifiquement la PTM d’intérêt ; ainsi, les modifications à la protéine cible ne devraient pas modifier de reconnaissance par les perles de l’affinité. À titre d’exemple, PD-L1 Ub était identifiée avec la technique décrite ici, et les deux endogène mono – et poly-Ub a été observée (Figure 4). Une publication récente de Lim et al. utilisé en vitro Ub techniques pour enquêter sur Ub PD-L1, et le résultat était très semblable aux résultats illustrés à la Figure 4³⁶. Fait intéressant, ils ont également joué IP avec un anticorps PD-L1 pour enrichir PD-L1 de lysat, cellulaire où Ub est surexprimé et MG-132 a été ajouté pour améliorer le signal. Le patron de l’Ub est pas robuste et très distinct du modèle in vitro Ub. Enquête d’endogène PD-L1 Ub aux modèles de culture de cellules ne se faisait pas dans Lim et al. rapport de préciser la différence entre leurs données de culture et in vitro des cellules.

Examiner si une protéine est modifiée par un PTM peut être difficile, en raison de sa faible abondance et de la nature transitoire³⁷^,³⁸et nécessite souvent l’enrichissement par IP. IP efficace de SPTM nécessite optimisation de plusieurs étapes clés et réactifs, tels que les mémoires tampons de lysis et réactifs d’affinité. Lors d’enquêtes sur plusieurs SPTM d’une protéine cible, l’optimisation nécessaire susceptible augmente. Utilisant le système de lyse blastR est une étape cruciale dans ce protocole, comme il l’affirme fonction IP robuste, tout en permettant la détection de PTM de la pY, SUMO 2/3, Ub et Ac SPTM dans un seul système. Cette technique optimise le temps et les ressources nécessaires pour déterminer si une protéine cible spécifique est modifiée par ces quatre SPTM et potentiellement fournit une meilleure image de la diaphonie PTM par rapport à la comparaison des résultats PTM effectuées à l’aide de plusieurs systèmes de lyse. Étude de la compatibilité du système blastR lyse à la SPTM alternatifs, comme la glycosylation, a été réalisée ; Toutefois, il n’a pas été examinée exhaustivement pour tous les types de MEA.

ADN génomique copieux peut interférer avec les mesures de protéines en utilisant soit colorimétriques ou méthodes nanodrop, affectent la migration des protéines dans un gel d’acrylamide SDS et empêcher toute interaction de matrice protéique et l’affinité au cours d’essais sur IP. La méthode décrite ici utilise un filtre spécialisé pour éliminer efficacement la contamination d’ADN génomique, qui est une autre étape critique du présent protocole. Pour souligner ce point, les essais de viscosité ont été réalisés avant et après traitement de filtre blastR, et les résultats ont montré une réduction de viscosité élevée à la viscosité de l’eau (données non présentées). Ce changement de viscosité a été appuyé par les résultats dans la Figure 3, montrant que la quasi-totalité de l’ADN génomique avait été enlevée. Ce qui est important, l’ADN n’est pas cisaillé avec cette méthode, comme tout ADN cisaillé n’est pas capturée par le filtre (données non présentées). Cet outil est supérieur aux méthodes conventionnelles, comme la sonication ou seringue-ADN-tondeuse, parce qu’il ne nécessite aucun équipement spécialisé est hautement reproductible et supprime l’ADN au lieu de cisaillement il. En outre, il ne sera pas dégrader les protéines dans le lysat, qui peuvent se produire à l’aide de méthodes conventionnelles de²⁹. Utilisant le filtre prend 5 à 30 secondes par exemple par rapport aux méthodes alternatives où une ventilation efficace de l’ADN peut prendre plusieurs minutes (c.-à-d., seringue de cisaillement) et peut se traduire par l’hétérogénéité de l’échantillon comme contaminants ADN restent dans le lysat. Une analyse approfondie du lysat blastR pré- et post-filtrage a été effectuée, et a observé aucune différence observable dans le profil protéique de bleu de Coomassie, analyses PTM de l’Ouest, ou totales et spécifique à la cible spécifique à la cible ; ainsi, l’intégrité du profil protéique ne peut pas ont été touchée par filtrage de l’ADN génomique. En fin de compte, ce système de filtration est bénéfique pour n’importe quel occidental ou l’application IP où l’ADN génomique est présent et peut influer sur l’interprétation de l’analyse de protéines.

Il est important de noter qu’il y a possibilité de faux négatif détection utilisant cette technique, qui pourrait être due en partie à l’affinité perle saturation, interférence de site de liaison ou masquage de PTM. Par exemple, une protéine cible particulière peut-être être modifiée par Ac à des niveaux très faibles ; ainsi, il ne peut être isolé par pan-acétyl lysine affinité perles qui ont été saturés par des protéines modifiés ca cible plus abondantes. Les études en cours sont réalisées pour évaluer les limites de détection des réactifs affinité utilisés dans le présent protocole, mais une publication récente suggère une limite de détection très robuste. Les données ont montré que cette technique pourrait identifier aussi peu que 17 molécules de protéine cible acétylée par cellule³¹. Pourtant, des circonstances particulières, par exemple la cellule type de spécificité, SPTM transitoire en réponse à des stimuli spécifiques, ou masquage de la MEA en raison de l’interaction protéine peut-être tous entraîner des résultats faussement négatifs. Voici les pièges potentiels de cette technique, ainsi que la plupart des méthodes de PTM IP. Ainsi, il est recommandé de confirmer les résultats en utilisant plusieurs approches.

Modifications comme la glycosylation et la phosphorylation ont été démontrées que se disputent les similaires acides aminés³⁹^,⁴⁰et autres SPTM ubiquitination et phosphorylation ont été montré à travailler séquentiellement pour réguler une protéine fonction¹⁷^,⁴¹. Des travaux récents sur la protéine neuropathologique Tau a souligné l’importance de la diaphonie PTM, où Tau hyper-phosphorylation et Tau SUMOylation renforcée entre eux⁴². En outre, ce groupe a montré que SUMOylation de Tau a empêché poly-Ub et dégradation subséquente de Tau, conduisant éventuellement à l’agrégation. C’est juste un des nombreux exemples de la diaphonie PTM réglementaire, et l’utilité de cette technique contribuera à éclairer l’importance du MEA et leur interférence dans la régulation des protéines clés dans la santé et la maladie.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions cytosquelette Inc. recherche scientifiques et Drs Brian Hoover et Ashley Davis pour leur examen critique, l’édition et des discussions fructueuses sur le manuscrit. En outre, nous remercions le Dr Robert Hom pour sa contribution au cours de la production du manuscrit vidéo. Ce travail a été soutenu par un financement du cytosquelette Inc.

Materials

Cell lysis/genomic DNA removal and analysis
1x phosphate buffered saline (PBS)	common buffer		Recipe: NaCl, KCl, Na₂HPO₄, KH₂PO₄
BlastR lysis buffer	Cytoskeleton Inc.	BLST01	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA)	common buffer		Recipe: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal
Mammalian protein extraction reagent (mPER)	Thermofisher	78503	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Immunoprecipitation (IP) Lysis	Pierce	87787	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
1% sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing buffer	common buffer		Recipe: PBS, SDS, EDTA, EGTA
Laemmli	common buffer		Recipe: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromophenol blue
BlastR dilution buffer	Cytoskeleton Inc.	BDB01	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Protease Inhibitor Cocktail	Cytoskeleton Inc.	PIC02
N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN)	Cytoskeleton Inc.	NEM09BB
Trichostatin A (TSA) & Nicotinamide	Cytoskeleton Inc.	TSA01
Activated Sodium Orthovanadate (Na₃VO₄₎	Cytoskeleton Inc.	PYI01
cell scrapers	Costar	3008
BlastR Filter	Cytoskeleton Inc.	BLR02
BD Insulin syringe needle	BD	08290-3284-11
sonicator (Branson Sonifier)	Branson	Sonifier 450
Precision Red Advanced Protein Reagent	Cytoskeleton Inc.	ADV02
1 mL cuvettes	Fisher	14955127
Spectrophotometer (Genesys20)	Thermofisher	4001	Other spectrophotomers can be used to measure protein concentration
Agarose	Fisher	BP1356-500
1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder	NEB	N3232L
DNA gel box	Thermofisher	7312 B1A
Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer	common buffer		Recipe: Tris-HCl, Boric Acid, EDTA
PTM Immunoprecipitation
Phosphotyrosine beads	Cytoskeleton Inc.	APY03-beads
Ubiquitination beads	Cytoskeleton Inc.	UBA01-beads
SUMOylation 2/3 beads	Cytoskeleton Inc.	ASM24-beads
Acetylation beads	Cytoskeleton Inc.	AAC04-beads
Phosphotyrosine control beads	Cytoskeleton Inc.	CIG01-beads
Ubiquitination control beads	Cytoskeleton Inc.	CUB02-beads
SUMOylation 2/3 control beads	Cytoskeleton Inc.	CIG01-beads
Acetylation control beads	Cytoskeleton Inc.	CIG02-beads
BlastR wash buffer	Cytoskeleton Inc.	BWB02	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Bead elution buffer	Cytoskeleton Inc.	BEB01	Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
microcentrifuge	Eppendorf	5417	Other microcentrifuges can be used
tube rotator	ATR	RKVSD	Other end-over-end tube rotators can be used
protein loading tips	VWR	37001-150
spin columns	Cytoskeleton Inc.	SPN22
heat block 95 °C	Benchmark	BSH1002
SDS-PAGE/Transfer/Western analysis
5x sample buffer	common buffer		recipe: Bromophenol blue, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl
novex wedge well 4-20% Tris-gly gels	Invitrogen	XP04200BOX	The large wedgewells are excellent for loading large volumes
1x Running buffer	common buffer		recipe: Tris-HCl , Glycine, SDS
seeblue protein ladder	Life Technologies	LC5625
electrophoresis cell	Invitrogen	Xcell surelock electrophoresis cell	Other electrophoresis cells can be used, however these are compatible the novex wedgewell gels
power supply	Biorad	PowerPac HC	Other power supplies can be used
1x Transfer buffer	common buffer		recipe: Tris-HCl, glycine, methanol
Transfer cell	Biorad	mini trans-blot cell	Other transfer cells can be used
Immobilon- P membranes (PVDF)	millipore	IPVH 304F0
non-fat milk	thrive	813503015095
Tris buffered saline with tween (TBST)	common buffer		recipe: Tris-HCl, NaCl, Tween 20
Chemiluminescent Detection Reagent	Cytoskeleton Inc.	CLRA/CLRB
Cell growth and treatment
Dulbecco's Modified Eagle's medium	ATCC	30-2002
Fetal bovine serum	ATLAS	F-0500-A
Epidermal growth factor	Cytoskeleton Inc.	CN02-A
150 mm cell culture plates	Corning	430599

Referanslar

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Immunoprecipitation PTM Post-translational Modification Cell Signaling Lysate Blaster Filter Protein Quantitation A431 Cells Lysis Buffer DNA Removal

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Horita, H., Law, A., Middleton, K. Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins. J. Vis. Exp. (131), e56912, doi:10.3791/56912 (2018).