Livre de detergente ultra reconstituição das proteínas de membrana em lípidos Bilayers usando Fusogenic Proteoliposomes complementares carregada.

1. preparação de fusogenic SUV e LUV Preparação da mistura de lipídios fusogenic Preparar soluções estoque de lipídios neutros, catiônicos, aniônicos e fluorescentes no clorofórmio em 25-50 mg/mL (por exemplo, neutro DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), etil-PC catiônica (1,2- dimyristoleoyl-sn-glicero-3-ethylphosphocholine), aniônico POPA (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate) e fluorescente colesterol-Bodipy-FL12, respectivamente) por pesagem de quantidades adequadas de lipídios secos e dissolvendo-os em 100% clorofórmio (cuidado! Fazer isso sob uma coifa), ou diluir a existências de clorofórmio comercialmente disponível de lipídios com clorofórmio.Nota: Tanto lipídica natural extrai e lipídios sintéticos puros podem ser usados e demonstram resultados semelhantes. Mix de 2,5 mg uma catiônica e 2,5 mg de um lipídio neutro no estoque de clorofórmio (1.1.1) em um frasco de vidro.Nota: Esta etapa produz 5 mg de mistura de lipídios catiônicos em clorofórmio, contendo fração de peso de 50% de lipídios catiônicos. Quando necessário, adicione 0,5% fração de peso de um lipídio fluorescente à mistura. Misture 1 mg de aniônicos e 4 mg de lípidos neutros em estoques de clorofórmio (1.1.1) em um frasco de vidro. Isto dá 5 mg de mistura de lipídios aniônicos contendo fração de peso 20% de lípidos aniónicos. Evapore o clorofórmio sob um fluxo de nitrogênio para formar uma fina camada de lipídios seco. Remova o clorofórmio residual sob vácuo por 10 min.Nota: Tradicionalmente esta etapa leva muito mais tempo (1-12 h), mas achamos que um tratamento mais não fornece nenhuma melhoria óbvia no acoplamento Propriedades de SUV. Hidrate o filme lipídico seco, adicionando 0,5 mL de tampão A (100 mM KCl, 1 mM MgCl2, MOPS 50 mM, pH 7,4) a cada frasco e deixá-las repousar à temperatura ambiente por 30 min e, em seguida, vórtice até o filme lipídico é completamente separado da superfície de vidro e b te uma suspensão lipídico homogênea. Isso deve levar cerca de 20-40 s. Formação de SUV e LUV por extrusão Montar um sistema de extrusão (consulte a Tabela de materiais) com duas seringas de 1 mL, usando um filtro de policarbonato com um dos seguintes tamanhos de poros: 100 ou 200 nm para formar o SUV e 400 ou 800 nm a forma LUV. Transferi a suspensão lipídico em uma seringa. EXTRUDE a suspensão, passando-o através do filtro 21 vezes, conforme mostrado em outro lugar18,19.Nota: Um número ímpar de passagens é necessário para minimizar a transferência para a solução de vesículas de lipídios grandes aglomerados preso ao lado de filtro, enfrentando a suspensão lipídico original. Transferi a solução de vesículas para tubos de microcentrifuga de 1,5 mL. 2. formação de Fusogenic chefe pelo método de emulsão invertida Nota: Este procedimento é ilustrado na Figura 2. Preparação da solução de lipídios em óleo Misture um estoque de clorofórmio (consulte a etapa 1.1.1) de um lipídio neutro (2 mg) e um lipido aniônico (0,5 mg) com 1 mL de hexadecano no tubo de 1,5 mL microcentrifuge. Evapore o clorofórmio da mistura sob constante mistura e aquecimento a 80 ° C por 30 min, mantendo o tubo aberto. Fechar o tubo e deixe esfriar a temperatura ambiente. Formação de uma monocamada de lipídios na interface de reserva lipídica-em-óleo/aquoso Lugar de 200 µ l da solução de lipídios em óleo em cima 0,5 mL tampão B (20 mM KCl, 0,1 mM MgCl2, pH de MOPS 10mm 7,4) num tubo de centrífuga 1,5 mL. Observe a forma convexa da borda de separação de fase, devido a tensão superficial de incompatibilidade entre o óleo e o tampão aquoso (Figura 2A). Espere até que nivela a fronteira de separação de fase, que é indicativo de formação de monocamada lipídica nele. Isso normalmente demora 30-60 min à temperatura ambiente. Preparação de uma emulsão de água em óleo Preparar uma solução de um polissacarídeo solúvel em água não-iônico em tampão B, com uma densidade mais elevada do que a densidade da água (por exemplo, 15% Ficoll-400 (p/v), com densidade de 1,05 g/mL)Nota: Opcionalmente, pode-se adicionar corantes fluorescentes solúveis em água para o buffer para melhor visualização do chefe e qualquer outro desejado conteúdo aquoso dos GUVs. Transferi 0,5 µ l da mistura acima para um tubo de centrifugação separados de 1,5 mL com 100 µ l da solução de lipídios em óleo de 2.1.2. Proceda à sonicação (44 kHz em 14 W) a mistura por 30 s em um banho ultra-sônico. Então, vigorosamente vórtice por 45 min formar uma emulsão de água em óleo, onde cada gota será revestida por uma monocamada de lipídios (Figura 2B). Conversão da emulsão água em óleo em chefe Coloque a emulsão resultante em cima a interface lipídio-em-óleo/aquosa e imediatamente centrifugar o tubo em uma centrífuga de mesa a 10.000 x g por 2 min. O sedimento resultante do chefe deve ser claramente visível (Figura 2). Fixe o tubo a 4 ° C no frigorífico para solidificar a mistura da emulsão lipídica (Figura 2D, hexadecano solidifica abaixo de 18 ° C), retire com cuidado o óleo congelado e depois retirar a fase aquosa.Nota: Para facilitar o óleo foi usado remoção congelar um arame dobrado em forma de âncora. Ressuspender o chefe em 50 µ l de tampão fresco B, transferir para um tubo de fresco e inspecionar sob um microscópio de fluorescência usando um 100 objectivo de imersão de óleo X (Figura 2E). 3. fusão de vesículas com cobalto-calceína método de monitoramento Preparação de uma coluna de gravidade de gel filtração. Mergulhe ~ 10 g de uma resina de gel filtração (por exemplo, sephadex superfino G-50) em 100 mL de água desionizada e deixe inchar durante a noite. Pack 3 mL da resina em uma coluna de fluxo de gravidade descartáveis de plástico, lave-o com água ultrapura e equilibrar com tampão C (pH 7,4 de 100 mM KCl, ESPANADORES de 10 mM,) à temperatura ambiente. Preparação de SUV+ ou SUV0 carregado com cobalto-calceína. Preparar uma solução contendo calceína 1 mM, 1 mM CoCl2, 98 mM NaCl, ESPANADORES de 10 mM, em seguida, trazer o pH para 7,4.Nota: A essência do método é que aquele gratuito calceína fluorescente forma um complexo não-fluorescente com Co2 +. Torna-se fluorescente novamente sobre adição de EDTA, que tendo maior afinidade pelo Co2 +, desloca calceína do complexo de cobalto-calceína (Figura 3A). Adicione 500 µ l desta solução para um filme seco de lipídios catiônicos ou neutros, preparados conforme descrito no ponto 1.1. Preparar 100 nm SUV por extrusão conforme descrito no ponto 1.2. Sedimento extrudido SUV a 1.000.000 x g por 20 min em uma mesa se e Resuspenda em 1 mL de tampão C. Repetir a granulação e ressuspensão três vezes; Use 0,6 mL de tampão C para a ressuspensão de ontem.Nota: Estes passos remover a maior parte do cobalto-calceína externo. Remova o restante cobalto-calceína externo passando SUV através de uma coluna de fluxo de gravidade descartáveis carregada com a resina de gel filtração incubada com buffer C conforme descrito por passo 3.1.2.Nota: Nós normalmente descartar o primeiro volume de mililitro do escoamento e coletar o segundo mililitro, que contém cobalto-calceína externo gratuito SUV. Preparação de SUV– carregado com EDTA Prepare a solução de 10 mM de EDTA, 80 mM de NaCl, ESPANADORES de 10 mM, pH 7,4. Adicione 500 µ l desta solução para um filme seco de lipídios aniônicos preparado como descrito no ponto 1.1. Prepare o SUV– por extrusão conforme descrito no ponto 1.2. De pelotas e ressuspender SUV– , conforme descrito em 3.2.4. Remova o restante EDTA passando SUV– através da coluna de gel filtração, conforme descrito no ponto 3.2.5. Preparando o SUV para fusão Diluir o SUV0,+de SUV e SUV– com tampão D (MOPS de 1 mM, pH 7,4) suplementado com 0,2 mM de CoCl2 e a concentração desejada de KCl. Use 5 µ l de cada tipo de SUV por 1 mL de tampão D. Incube a mistura pelo menos 1 h.Nota: Este passo irá minimizar o nível de fluorescência do fundo através do bloqueio de calceína que é superfície limite a SUV+. Fusão de vesículas Começa a reação de fusão misturando-se 1 mL de SUV+ ou SUV0 com 1 mL de SUV− (diluído em tampão D conforme descrito acima) em uma cubeta do fluorímetro de 2 mL e monitor aumento da fluorescência de calceína usando 480 nm de excitação e emissão de 510 nm (Figura 3B). Espere até que a reação vem a conclusão. Adicione uma mistura de detergente Triton X-100 e EDTA (concentração final de 0,05% e 7 mM, respectivamente) para liberar calceína fora de vesículas e obter o sinal de fluorescência máxima. Determine a extensão da fusão definida como a porcentagem do sinal de fluorescência máxima após a adição de detergente, como mostrado na Figura 3. 4. rápida reconstituição das proteínas de membrana em Fusogenic Proteoliposomes Nota: Este procedimento é ilustrado na Figura 4A. Preparar uma coluna de fluxo de gravidade com a resina de gel filtração, conforme descrito em 3.1 e equilibrar isso com tampão à temperatura ambiente.Nota: Todas as manipulações mais devem ser feitas estritamente a ≤ 4 ° C, a menos que indicado de outra forma, para minimizar a perda de atividade da proteína. Ajuste a concentração da proteína purificada de membrana para 0,7 mg/mL diluindo-lo com a mesma solução tampão usado para isolamento de proteína. µ L 140 de mistura da proteína com 300 µ l de SUV pré-formadas, 160 µ l tampão A e 60 µ l de colato de 10% em tampão A; Isto dá 01:30 proteína: relação do peso de lipídios em um volume final de 660 µ l. Agite a mistura em uma plataforma de balanço por 15 min.Nota: As etapas a seguir podem ser feitas à temperatura ambiente. Passe a mistura por meio de resina de gel filtração e coletar frações turvas contendo proteoliposomes. Granule proteoliposomes com uma mesa se a 400.000 x g, durante 15 min. Descartar o sobrenadante contendo a proteína não-reconstituído e resuspenda o pellet em 1 mL de tampão fresco A. Determine o teor de proteínas no PL e o sobrenadante usando o método de Amido-preto20. Determine o rendimento de reconstituição, que normalmente é de cerca de 50-70%.Nota: Passos 4.6-4.8, opcionalmente, podem ser substituídos, passando a solução PL através de 1 mL de resina Ni-NTA embalado em uma coluna de gravidade descartáveis e lavada com tampão A, conforme descrito em 3.1.2. Essa passagem vai separar a proteína não-reconstituído, que será preferencialmente ligada à resina, do PL, a maioria dos quais será na passagem. 5. funcionais testes de atividade da proteína em Proteoliposomes Nota: Ambas as proteínas usadas neste estudo são bombas de prótons poderoso, que bomba H+ em proteoliposomes sobre adição de seus substratos (coenzima Q1 para bo3-oxidase e ATP para F1Fó, respectivamente), assim, a construção um gradiente de protões através da membrana (ΔpH). Em caso de sucesso co reconstituição por fusão, tal acidificação pode ser observada como uma diminuição na fluorescência de uma sonda de pH sensíveis ACMA (9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine)12,15, que é usada rotineiramente para tais tarefas ( Figura 4B -C). Além disso substrato específico atividade das proteínas (coenzima Q1 oxidação por bo3-oxidase22 e hidrólise de ATP por F1Fó23,24) pode ser monitorado por espectrometria usando vários métodos. Aqui, demonstramos a atividade de hidrólise de ATP de F1Fo PL usando um ATP Regenerando o ensaio (Figura 4), onde duas enzimas (piruvato quinase (PK) e lactato desidrogenase (LDH) mantém uma concentração constante de ATP como segue. PK recicla ATP através da conversão de ADP produzido por F1Fó volta para ATP, em detrimento de seu substrato fosfoenolpiruvato (PEP). Piruvato, que é um produto desta reação, é convertido em lactato pela LDH em detrimento do NADH, a oxidação dos quais pode ser monitorizada como diminuindo a densidade óptica em 340 nm. Preparação de produtos químicos Prepare-se 1 mM estoque ACMA em etanol. Prepare um estoque de 1 mM de nigericin (ou qualquer outro desacoplador) em etanol. Preparar o estoque de 25mm coenzima Q1 em etanol e estoque de TDT 1m no buffer A. Preparar um estoque de 100 mM de ATP em tampão A e ajustar o pH para 7,4. Prepare estoques de ATP regenerando os componentes do sistema em Buffer r: PEP de 100 mM, 1mm NADH e soluções de PK e LDH em concentração de ~ 500-1.000 unidades/mL. Orientada por oxidação coenzima Q1 próton de bombeamento por bo3-oxidase PL Adicionar 20 µ l de PL para uma cubeta do fluorímetro com tampão de 2 mL A na presença de 0,5 µM ACMA e esperar até o sinal estável usando 430 nm de excitação e emissão de 515 nm. Adicione 40 µM coenzima Q1 para a cubeta. Inicie o bombeamento de prótons adicionando 2 mM DTT PL (Figura 4B).Nota: TDT reduz oxidado coenzima Q1 e torna disponível para bo3-oxidase. Dissipe o ΔpH formado adicionando 2 desacoplador µM (por exemplo nigericin). Sinal de fluorescência ACMA deve retornar rapidamente ao nível quase original.Nota: Não deve haver nenhum ACMA têmpera sobre adição do substrato, se o desacoplador está presente na mistura reacional inicialmente. Próton orientada por hidrólise de ATP bombeamento por F1FoPL Adicione 40 µ l de PL para uma cubeta do fluorímetro conforme descrito em 5.2. Inicie o bombeamento de prótons pela adição de 0,2 mM ATP para PL (Figura 4). Dissipe ΔpH conforme descrito em 5.2.4. Hidrólise de ATP por F1FoPL e sua estimulação pelo desacoplador Adicione 40 µ l de PL de um fluorímetro com 2 mL tampão A, contendo ATP de 1 mM, 0.2 mM NADH, 2mm PEP e 15 µ l cada de PK e LDH. Siga a reação medindo decréscimo de absorbância do NADH a 340 nm. 3-4 min mais tarde, adicionar 2 desacoplador µM para a cubeta para liberar a contrapressão de ΔpH na hidrólise de ATP. A velocidade da reação deve aumentar imediatamente.Nota: PL passada resina Ni-NTA conforme descrito em 4.10 demonstrará o estímulo mais forte pelo desacoplador (Figura 4, vermelho rastreamento), enquanto o eluato será mal estimulado (traço azul). 6. influência do ambiente de lipídios e força iônica na funcionalidade de proteínas de membrana de teste em Fusogenic Proteoliposomes Avaliar o bombeamento de prótons por 40 µ l de PL+,– de PL e PL0 com ensaio de têmpera ACMA em 2 mL de buffer D suplementado com 100 mM KCl (painel B) conforme descrito em 5.2 ou 5.3 (Figura 5 e 20 (Figura 5, painel A) ou 1 mM MgCl2 traços de vermelhos, pretos e azuis). Fusível 40 µ l de PL+ com o mesmo volume de LUV– em 2 mL de tampão D suplementado com 20 mM KCl e teste de ACMA têmpera (verde trace). Execute experimentos de controle como no passo 2, misturando, por exemplo, PL e SUV de mesma carga (traço cinzento).Nota: Bombeamento de prótons deve ser melhorada pelo pl postfusion 7. entrega de proteínas de membrana em LUV e chefe de Fusogenic Proteoliposomes Fusível de 50 µ l de PL+ com 50 µ l de 800 nm LUV– em 1 mL de tampão D suplementado com 1 mM MgCl2e 20 mM KCl por 5 min. As vesículas a 6.000 x g por 5 min de pelotas e descartar o sobrenadante contendo reagido PL+. Resuspenda o pellet em 1 mL de tampão D suplementado com 1 mM de MgCl2 e 100 mM KCl e repetir a granulação e resuspending duas vezes mais. Execute ACMA extinguer ensaio conforme descrito em 5.2 ou 5.4. Execute experimentos de controle, como nos passos 1-3, usando combinações de vesículas carregadas complementares em sal elevada (200 mM KCl), não-fusogenic vesículas e só vazio LUV– sem PL+.Nota: Bombeamento de prótons pelo postfusion LUV deve ser detectado somente quando vesículas complementarmente carregadas foram usadas como mostrado na Figura 6. 8. montagem da cadeia de transporte electrónico de componentes individuais em membranas de LUV e chefe e produção de ATP por essa cadeia. Nota: Um esquema deste procedimento é ilustrado na Figura 7A. ATP produzido neste experimento será registrado pelo sistema luciferina-luciferase, onde a conversão de ATP sintetizado em pirofosfato e AMP por luciferase é seguido por emissão de luz registrado com um luminómetro. Recomendamos usar um único-tubo luminómetro, em vez do luminometers de microplacas menos sensíveis. Mix 3 µ l de bo3-oxidase PL+ e 5 µ l de F1Fo PL+ formaram conforme descrito na seção 4. Fusível-los com 3 µ l de LUV ou chefe– (formada conforme descrito na secção 2) em 800 µ l de tampão D suplementado com 20 mM KCl e 1 mM MgCl2 por 5 min. Usando ações de alta concentração, adicione KCl e MOPS para concentração final de 100 mM e 50 mM para as membranas postfusion.Nota: Em caso de LUV pós-fusão, esta etapa irá impedir que seu inchaço devido ao deslocamento osmótico entre o externo (tampão A) e intravesicular (buffer D) concentração de sais. Opcionalmente, as membranas postfusion de Pelotas, conforme descrito em 7.2 para separar não tenha reagido SUV+e resuspenda o pellet em 800 µ l de tampão A. Prepare-se 200 µ l de uma luciferina-luciferase-ADP ADP contendo coquetel 400 µM, 50 luciferina µM e 2.5 µ g luciferase no tampão A Adicione o cocktail à mistura de postfusion de Step8.3. Adicionar 40 µM de oxidado coenzima Q1e disparar a energização das membranas postfusion de bo3-oxidase, adicionando 2 mM DTT. Espere por 1 min. Iniciar a síntese de ATP pela adição de fosfato de potássio de 5mm (KPeu, pH 7,4) a vesículas energizadas e detectar a produção de ATP com um luminómetro (Figura 7B). Execute a reação para ~ 3 min.Nota: Reação de síntese de ATP continua por 5-7 min até esgotamento de oxigênio consumido por bo3-oxidase e luciferase. Adicione um padrão de referência de ATP (0,5 nmol ATP) a mistura de reacção duas vezes. Medida de ATP produzido. Obter a quantidade real de ATP produzido na reação, dividindo-se o sinal de reação de síntese de ATP pelo sinal padrão de referência de ATP. Ajustar este valor para a quantidade total de F-1Fo utilizado na reação e finalmente expressar a taxa de síntese de ATP em µmol ATP / (mg F1Fó* min).