Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

1. Vorbereitung des Fusogenic SUV und LUV Vorbereitung der Fusogenic Lipid-Mischung Vorbereiten der Stammlösungen der neutralen, kationischen anionischen und fluoreszierende Lipide in Chloroform bei 25-50 mg/mL (z. B. neutrale DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), kationischen Ethyl-PC (1,2- Dimyristoleoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine), anionischen POPA (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate), und fluoreszierende Cholesteryl-Bodipy-FL12, beziehungsweise) durch entsprechende Mengen an trockenen Lipide wiegen und in 100 % Auflösung Chloroform (Achtung!) Hierzu unter einem Abzug), oder verdünnen handelsübliches Chloroform Bestände der Lipide mit Chloroform.Hinweis: Sowohl natürliche Lipid-Extrakte und rein synthetische Lipide eingesetzt werden und zeigen ähnliche Ergebnisse. Eine kationische Mix 2,5 mg und 2,5 mg ein neutrales Lipid vorrätig Chloroform (1.1.1) in einer Glasflasche.Hinweis: Dieser Schritt ergibt 5 mg des kationischen Lipid-Gemisches in Chloroform, mit 50 % Gewichtsanteil der kationischen Lipide. Bei Bedarf fügen Sie 0,5 % Gewichtsanteil von fluoreszierenden Lipid auf die Mischung. Mischen Sie 1 mg anionischen und 4 mg von neutralen Lipiden in Chloroform Aktien (1.1.1) in einer Glasflasche. Dadurch werden 5 mg anionischen Lipid-Gemisch mit 20 % Gewichtsanteil von anionischen Lipiden. Verdunsten Sie Chloroform unter dem Strahl des Stickstoff bilden eine dünne Schicht trocken Lipid. Entfernen Sie die restlichen Chloroform unter Vakuum für 10 min.Hinweis: Traditionell dieser Schritt dauert viel länger (1-12 h), aber wir fanden, dass eine längere Behandlung keine offensichtlichen Verbesserung der Kupplung Eigenschaften des SUV bietet. Hydrat trockene Lipid-Film indem jedes Fläschchen 0,5 mL Puffer A (100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM MOPS, pH 7,4) hinzufügen und so dass sie bei Raumtemperatur für 30 min und dann Wirbel stehen, bis der Lipid-Film völlig losgelöst von der Glasoberfläche und b ist Jelka eine homogene Lipid-Suspension. Dies dauert über 20-40 s. Bildung von SUV und LUV durch extrusion Montieren Sie eine Extrusion Systems (siehe Tabelle der Materialien) mit zwei 1 mL Spritzen mit einem Polycarbonat-Filter mit einer der folgenden pore Größen: 100 oder 200 nm zu bilden SUV und 400 oder 800 nm bis Form LUV. Übertragen Sie die Lipid-Suspension in eine Spritze. Extrudieren Sie die Aussetzung, indem man es durch den Filter 21mal, wie an anderer Stelle18,19gezeigt.Hinweis: Eine ungerade Anzahl von Passagen wird benötigt zur Übertragung in die Vesikel-Lösung von großen Lipid Klumpen klebte an der Filter zugewandten die ursprüngliche Lipid-Aussetzung zu minimieren. Übertragen Sie Vesikel-Lösung in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. 2. Zustandekommen des Fusogenic GUV durch invertierte Emulsion Methode Hinweis: Dieses Verfahren ist in Abbildung 2dargestellt. Vorbereitung der Lipid-in-Öl-Lösung Mischen Sie einen Chloroform bestand (siehe Schritt 1.1.1) ein neutrales Lipid (2 mg) und einem anionischen Lipid (0,5 mg) mit 1 mL Hexadecan in 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Verdunsten Sie Chloroform aus der Mischung unter Konstanten mischen und Erhitzen auf 80 ° C für 30 min die Röhre offen zu halten. Das Röhrchen verschließen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Bildung von einer Lipid monomolekularen Film an der Schnittstelle von Lipid-in-Öl/wässrigen Puffer Platz 200 µL der Lipid-in-Öl-Lösung auf 0,5 mL Puffer B (20 mM KCl, MgCl2, 0, 1 mM 10 mM MOPS pH-Wert 7,4) in einer 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. Beachten Sie die konvexe Form der Phase Trennung Grenze aufgrund der Oberflächenspannung Missverhältnis zwischen dem Öl und der wässrigen Puffer (Abbildung 2A). Warten Sie, bis die Phase Trennung Grenze das ist bezeichnend für Lipid Monolage Bildung drauf flacht. Dies dauert in der Regel 30-60 min bei Raumtemperatur. Vorbereitung einer Wasser-in-Öl-Emulsion Bereiten Sie eine Lösung für eine wasserlösliche nichtionischen Polysaccharid in Puffer B, mit einer höheren Dichte als Dichte des Wassers (z. B. 15 % Ficoll-400 (w/V), mit Dichte 1,05 g/mL)Hinweis: Optional kann eine fluoreszierende wasserlösliche Farbstoffe der Puffer zur besseren Visualisierung der GUV und jede andere gewünschte wässrigen Inhalt die GUVs hinzufügen. 2.1.2 übertragen Sie 0,5 µL der obigen Mischung zu einem separaten 1,5 mL Zentrifugenröhrchen mit 100 µL der Lipid-in-Öl-Lösung. Beschallen (44 kHz bei 14 W) die Mischung für 30 s in ein Ultraschall-Wasserbad. Dann kräftig Vortexen 45 min um eine Wasser-in-Öl-Emulsion bilden wo jedes Tröpfchen durch ein Lipid-Monolayer (Abb. 2 b) beschichtet werden. Umwandlung von Wasser-in-Öl-Emulsion in GUV Legen Sie die resultierende Emulsion auf die Lipid-in-Öl/wässrigen Schnittstelle, und sofort Zentrifugieren Sie das Rohr in eine Tischplatte Zentrifuge bei 10.000 x g 2 min. lang. Die daraus resultierende Pellet der GUV sollte deutlich sichtbar (Abbildung 2). Cool das Rohr auf 4 ° C im Kühlschrank, die Lipid-in-Öl-Gemisch zu festigen (Abb. 2D, Hexadecan erstarrt unter 18 ° C), gefrorene Öl vorsichtig entfernen, und dann zurückziehen die wässrige Phase.Hinweis: Um Öl zu erleichtern wurde Entfernung Einfrieren ein Draht in der Form eines Ankers gebogen verwendet. Die GUV Pellet in 50 µL frische Puffer B, Transfer zu einem frischen Schlauch aufzuwirbeln und unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einem 100 X Öl Immersion Ziel (Abb. 2E) untersuchen. 3. Überwachung Vesicle Fusion mit Kobalt-Calcein Methode Vorbereitung einer Gel-Filtration-Schwerkraft-Spalte. ~ 10 g eines Harzes Gel-Filtration (z.B. superfine Sephadex G50) in 100 mL entionisiertem Wasser einweichen und über Nacht Quellen lassen. 3 mL des Harzes in einer Einweg-Kunststoff-Schwerkraft fließen Spalte packen, waschen Sie es mit Reinstwasser und equilibrate mit Puffer C (100 mM KCl, 10 mM MOPS, pH 7,4) bei Raumtemperatur. Vorbereitung von+ Geländewagen oder SUV0 geladen mit Kobalt-Calcein. Bereiten Sie eine Lösung mit 1 mM Calcein, 1 mM CoCl2, 98 mM NaCl, 10 mM MOPS, dann bringen Sie pH auf 7,4.Hinweis: Das Wesen der Methode ist, dass freie fluoreszierende Calcein nicht fluoreszierenden Komplex mit Co2 +bildet. Es wird wieder nach Zugabe von EDTA, welche mit fluoreszierenden höherer Affinität für Co2 +, verdrängt Calcein vom Kobalt-Calcein Komplex (Abb. 3A). Einen trockenen Film von kationischen oder neutralen Lipiden wie in 1.1 beschrieben fügen Sie 500 µL dieser Lösung hinzu. Bereiten Sie 100 nm SUV durch Extrusion wie unter 1.2 beschrieben. Pellet-extrudierte SUV bei 1.000.000 x g für 20 min in eine Tischplatte Ultrazentrifugen und in 1 mL des Puffers Caufzuwirbeln. Wiederholen Sie Pelletierung und Wiederfreisetzung dreimal; Verwenden Sie 0,6 mL Puffer C für die letzten Wiederfreisetzung.Hinweis: Diese Schritte entfernt die meisten externen Kobalt-Calcein. Entfernen Sie die restlichen externen Kobalt-Calcein indem man SUV durch eine Einweg-Schwerkraft-Flow-Spalte mit dem Gel-Filtration-Harz, equilibriert mit Puffer C beschriebenen Schritt 3.1.2 geladen.Hinweis: Wir in der Regel die ersten Milliliter Band der durchströmten verwerfen und sammeln die zweite Milliliter, enthält externe Kobalt-Calcein kostenlos SUV. Vorbereitung der SUV– geladen mit EDTA Lösung von 10 mM EDTA, 80 mM NaCl, 10 mM MOPS, pH 7.4 vorbereiten. Einen trockenen Film von anionischen Lipiden wie in 1.1 beschrieben fügen Sie 500 µL dieser Lösung hinzu. Bereiten Sie SUV– durch Extrusion wie unter 1.2 beschrieben. Pellet und Aufschwemmen SUV– , wie in 3.2.4 beschrieben. Entfernen Sie die restlichen EDTA indem man SUV– durch die Gel-Filtration-Spalte wie in 3.2.5 beschrieben. SUV vorbereiten für fusion Verdünnen Sie SUV0,+Geländewagen und SUV– mit Puffer D (1 mM MOPS, pH 7,4) ergänzt mit 0,2 mM CoCl2 und die gewünschte Konzentration von KCl. Verwendung 5 µL jeder Art von SUV pro 1 mL Puffer D. Inkubieren Sie die Mischung für mindestens 1 h.Hinweis: Dieser Schritt wird minimiert die Hintergrundkonzentration Fluoreszenz durch die Blockierung von Calcein, die Oberfläche SUV+gebunden ist. Vesicle fusion Starten Sie Fusionsreaktion durch das Mischen von 1 mL+ Geländewagen oder SUV0 mit 1 mL SUV− (verdünnt im Puffer D wie oben beschrieben) in einem 2-mL-Fluorimeter Küvette und Erhöhung der Fluoreszenz von Calcein mit 480 nm Anregung und 510 nm Emission monitor (Abb. 3 b). Warten Sie, bis die Reaktion zum Abschluss kommt. Fügen Sie eine Mischung aus Spülmittel Triton x-100 und EDTA (0,05 % Endkonzentration und 7 mM bzw.) Calcein aus Vesikeln und das maximale Fluoreszenzsignal zu erhalten. Bestimmen Sie den Umfang der Fusion definiert als prozentualer Anteil der maximale Fluoreszenzsignal nach dem Waschmittel hinzufügen, wie in Abbildung 3dargestellt. 4. schnelle Wiederherstellung von Membranproteinen in Fusogenic Proteoliposomes Hinweis: Dieses Verfahren ist in Abbildung 4Adargestellt. Bereiten Sie eine Schwerkraft fließen Spalte mit dem Gel-Filtration-Harz wie unter 3.1 beschrieben, und equilibrate es mit Puffer A bei Raumtemperatur.Hinweis: Alle weiteren Manipulationen müssen streng auf ≤ 4 ° C, durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben, um Verlust der proteinaktivität zu minimieren. Einstellen Sie Konzentration des gereinigten Membran Proteins bis 0,7 mg/mL durch Verdünnen es mit dem gleichen Extraktionspuffer verwendet für Protein isoliert. Mix-140 µL des Proteins mit 300 µL der vorgeformten SUV, 160 µL Puffer A und 60 µL 10 % Cholate in Puffer A; Dies gibt 01:30 Protein: Lipid-Gewichts-Verhältnis in einem 660 µL Endvolumen. Schütteln Sie die Mischung auf einer rockigen Plattform für 15 Minuten.Hinweis: Die folgenden Schritte können bei Raumtemperatur erfolgen. Die Mischung durch Gel-Filtration Harz übergeben, und trübe Brüche mit Proteoliposomes zu sammeln. Pellet-Proteoliposomes mit einer Tischplatte Ultrazentrifugen 400.000 x g für 15 Minuten. Verwerfen des Überstands enthält nicht rekonstituiert Protein und Aufschwemmen das Pellet in 1 mL frische Puffer A. Bestimmen Sie den Proteingehalt in PL und der Überstand mit Amido Black Methode20. Bestimmen Sie den Ertrag der Rekonstitution, das ist in der Regel rund 50-70 %.Hinweis: Schritte 4,6-4,8 können optional ersetzt werden, indem man PL Lösung durch 1 mL Ni-NTA-Harz in einer Einweg-Schwerkraft-Spalte verpackt und mit Puffer A gewaschen, wie unter 3.1.2 beschrieben. Diese Weitergabe wird nicht rekonstituiert Protein trennen, die bevorzugt an das Harz gebunden sein wird, von PL, wovon in der durchströmten sein werden. 5. Funktionsprüfungen der Proteinaktivität in Proteoliposomes Hinweis: Beide Proteine, die in dieser Studie verwendeten sind leistungsstarke Protonenpumpen, die H+ in Proteoliposomes bei Zugabe von ihrer Substrate zu Pumpen (Coenzym Q1 für Bo3-Oxidase und ATP für F1Fo, beziehungsweise), damit Gebäude ein Proton Gradienten durch die Membran (ΔpH). Im Falle einer erfolgreichen Co Rekonstitution von Fusion kann solche Versauerung als eine Abnahme der Fluoreszenz eines pH-Sensitive Sonde ACMA (9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine)12,15, beobachtet werden, die routinemäßig, für solche Aufgaben verwendet wird ( Abbildung 4 b -C). Zusätzlich Substrat-spezifische Aktivität der Proteine (Coenzym Q1 Oxidation durch Bo3-Oxidase22 und ATP Hydrolyse durch F1Fo23,24) können überwacht werden spektralphotometrisch mittels verschiedener Methoden. Hier zeigen wir ATP Hydrolyse Aktivität der F1Fo PL mit einer ATP regeneriert Assay (Abbildung 4), wo zwei Enzyme (Pyruvat-Kinase (PK) und Laktat-Dehydrogenase (LDH) pflegen Sie wie folgt eine Konstante Konzentration von ATP. PK recycelt ATP von ADP produziert von F1Fo wieder in ATP auf Kosten seiner Substrat Phosphoenolpyruvat (PEP) konvertieren. Pyruvat, die ein Produkt dieser Reaktion, in Laktat umgewandelt wird, von LDH auf Kosten von NADH, die Oxidation von denen lässt sich vermindernden optische Dichte bei 340 nm. Vorbereitung von Chemikalien Bereiten Sie 1 mM ACMA Lager in Ethanol. Bereiten Sie einen 1 mM bestand von Nigericin (oder andere Entkuppler) in Ethanol. 25 mM Coenzym Q1 Lager in Ethanol und 1 M DVB-t-Aktie im Puffer A. vorbereiten Bereiten Sie einen Bestand von 100 mM ATP in Puffer A und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4. Bereiten Sie Vorräte an ATP regeneriert Systemkomponenten im Puffer A: 100 mM PEP, 1 mM NADH und Lösungen von PK und LDH in Konzentration von ca. 500-1.000 Einheiten/mL. Coenzym Q1 Oxidation-driven Proton durch Bo3Pumpen-Oxidase PL Ein Fluorimeter Küvette mit 2 mL Puffer A in Gegenwart von 0,5 µM ACMA 20 µL PL hinzu, und warten Sie, bis stabiles Signal mit 430 nm Anregung und 515 nm Emission. Die Küvette 40 µM Coenzym Q1 hinzufügen. Proton Pumpen durch Zugabe von 2 mM DTT, PL (Abbildung 4 b) zu initiieren.Hinweis: DVB-t reduziert oxidierte Coenzym Q1 und stellt es zur Verfügung Bo3-Oxidase. Zerstreuen Sie gebildeten ΔpH durch Zugabe von 2 µM Entkuppler (z. B. Nigericin). ACMA Fluoreszenzsignal sollte schnell auf fast das ursprüngliche Niveau zurückkehren.Hinweis: Es sollte keine ACMA abschrecken nach Zugabe des Substrates, wenn die Entkuppler zunächst in das Reaktionsgemisch vorhanden ist. ATP Hydrolyse angetriebenen Proton Pumpen von F1FoPL Fügen Sie 40 µL PL zu einem Fluorimeter Küvette wie unter 5.2 beschrieben hinzu. Initiieren Sie, Proton Pumpen durch Zugabe von 0,2 mM ATP, PL (Abbildung 4). ΔpH zu zerstreuen, wie in 5.2.4 beschrieben. ATP-Hydrolyse durch F1FoPL und seine Stimulation durch die Entkuppler 40 µL PL, ein Spektrofotometer Küvetten mit 2 mL Puffer A, mit 1 mM ATP, 0,2 mM NADH, PEP, 2 mM und 15 µL PK und LDH hinzufügen. Folgen Sie die Reaktion durch Messung der Extinktion Abnahme von NADH bei 340 nm. ca. 3-4 min später hinzufügen 2 µM Entkuppler auf die Küvette den Gegendruck des ΔpH auf der ATP-Hydrolyse zu veröffentlichen. Die Reaktionsgeschwindigkeit sollte sofort erhöhen.Hinweis: PL Ni-NTA Harz siehe 4.10 durchlaufen zeigen die stärkste Stimulierung durch die Entkuppler (Abbildung 4, rote Spur), während das Eluat wird kaum stimuliert (blaue Spur). 6. Prüfung eine Beeinflussung der Lipid-Umwelt und Ionenstärke Funktionalität von Membranproteinen in Fusogenic Proteoliposomes Bewerten, Proton Pumpen von 40 µL PL+, PL– und PL0 mit ACMA abschrecken Assay in 2 mL Puffer D ergänzt mit 1 mM MgCl2 und 20 (Abbildung 5, zentrale A) oder 100 mM KCl (Gruppe B) wie unter 5.2 oder 5.3 (Abbildung 5 rot, schwarz und blau Spuren). Sicherung 40 µL PL+ mit gleichen Volumen von LUV– in 2 mL des Puffers D mit 20 mM KCl und Test für ACMA abschrecken (grüne Spur) ergänzt. Führen Sie Experimente wie in Schritt2 durch Mischen, z. B. PL und SUV die gleiche Ladung (graue Spur).Hinweis: Proton Pumpen sollten durch postfusion pl verbessert werden 7. Lieferung von Membranproteinen in LUV und GUV durch Fusogenic Proteoliposomes Sicherung von 50 µL PL+ mit 50 µL von 800 nm LUV– in 1 mL des Puffers D ergänzt mit 1 mM MgCl2und 20 mM KCl für 5 Minuten. Pellet-Vesikel bei 6.000 x g für 5 min, und entsorgen Sie überstand enthaltenden nicht umgesetztes PL+. Das Pellet in 1 mL des Puffers D ergänzt mit 1 mM MgCl2 und 100 mM KCl aufschwemmen und Pelletierung und resuspending zweimal mehr wiederholen. Führen Sie ACMA Assay abschrecken, wie in 5.2 oder 5.4 beschrieben aus. Führen Sie Experimente, wie in den Schritten 1-3, mit Kombinationen von ergänzenden geladenen Vesikel in hohen Salz (200 mM KCl), nicht Fusogenic Vesikel und nur leere LUV– ohne PL+.Hinweis: Proton Pumpen durch Postfusion LUV sollte erkannt werden nur ergänzend geladenen Vesikel verwendet wurden, wie in Abbildung 6dargestellt. 8. Montage der Elektronentransport-Kette aus Einzelkomponenten in Membranen von LUV und GUV und ATP-Produktion von dieser Kette. Hinweis: Eine schematische Darstellung dieser Verfahren ist in Abbildung 7Adargestellt. ATP produziert in diesem Experiment wird durch das Luciferin-Luciferase-System registriert werden, wo Umwandlung von synthetisiert ATP zu AMP und Pyrophosphat durch Luciferase von Lichtemission bei einem Luminometer registriert gefolgt. Wir empfehlen die Verwendung einer einzigen Röhre Luminometer statt unempfindlicher Mikrotestplatte Luminometer. Mix 3 µL Bo3-Oxidase PL+ und 5 µL F1Fo PL+ gebildet, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Verschmelzen sie mit 3 µL LUV oder GUV– (gebildet wie in Abschnitt 2 beschrieben) in 800 µL Puffer D mit 20 mM KCl und 1 mM MgCl2 für 5 min ergänzt. Mit hoher Konzentration Lager, KCl und MOPS fügen Sie 100 mM und 50 mM Endkonzentration in die postfusion Membranen hinzu.Hinweis: Bei Post-fusion LUV, diesen Schritt wird verhindert, dass die Schwellung durch osmotische Versatz zwischen der externen (Puffer A) und intravesicular (Puffer D) Salze Konzentration. Optional, pellet postfusion Membranen wie unter 7.2 nicht umgesetztes SUV+zu trennen, und das Pellet in 800 µL Puffer A. Aufschwemmen Bereiten Sie ein Luciferin-Luciferase-ADP cocktail mit 400 µM ADP, 50 µM Luciferin und 2,5 µg Luciferase in Puffer A 200 µL Fügen Sie den Cocktail in der postfusion Mischung aus Step8.3. Hinzufügen von 40 µM oxidierte Coenzym Q1und auslösen Bestromung der postfusion Membranen von Bo3-Oxidase durch Zugabe von 2 mM DTT. 1 min. warten. Initiieren Sie ATP-Synthese zu, indem Sie erregt Vesikel 5 mM Kalium Phosphat (KPich, pH 7,4) hinzufügen und erkennen Sie ATP-Produktion mit einem Luminometer (Abb. 7 b) zu. Laufen Sie die Reaktion für ~ 3 min.Hinweis: ATP Synthese Reaktion verläuft für 5-7 min bis Erschöpfung der Sauerstoff verbraucht durch Bo3-Oxidase und Luciferase. Das Reaktionsgemisch zweimal ATP Referenzstandard (0,5 Nmol ATP) hinzufügen. Maßnahme ATP produziert. Erhalten Sie die tatsächliche Menge von ATP in der Reaktion produziert, indem man das Signal vom ATP Synthese Reaktion durch die ATP-Referenz-standard-Signal. Passen Sie diesen Wert auf den Gesamtbetrag der F1Fo in der Reaktion verwendet, und schließlich ausdrücklich die Rate der ATP-Synthese in µmol ATP / (mg F1Fo* min).