Sans tensioactifs ultrarapide Reconstitution des protéines membranaires dans les bicouches lipidiques à l’aide de fusogène complémentaire chargée protéoliposomes.

1. préparation des fusogène SUV et LUV Préparation du mélange lipidique fusogène Préparer les solutions de lipides neutres, cationiques, anioniques et fluorescents dans le chloroforme à 25-50 mg/mL (par exemple, neutre DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), cationique éthyl-PC (1,2- dimyristoleoyl-sn-glycéro-3-ethylphosphocholine), POPA anionique (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate) et fluorescent cholestéryle-Bodipy-FL12, respectivement) en pesant les quantités appropriées de lipides secs et les dissoudre dans 100 % chloroforme (attention ! Ce faire sous une hotte aspirante), ou diluer les stocks de chloroforme disponibles dans le commerce des lipides avec du chloroforme.Remarque : Les lipides naturels extraits et pures lipides synthétiques peuvent être utilisés et démontrent des résultats similaires. Un cationique de Mix 2. 5 mg et 2,5 mg de lipides neutres en stock de chloroforme (1.1.1) dans un flacon en verre.Remarque : Cette étape donne 5 mg de mélange de lipide cationique dans le chloroforme, contenant la fraction de poids de 50 % des lipides cationiques. Si nécessaire, ajouter 0,5 % fraction de poids d’un lipide fluorescent au mélange. Mélanger 1 mg d’anioniques et 4 mg de lipides neutres dans les stocks de chloroforme (1.1.1) dans un flacon en verre. Ce qui donne 5 mg de mélange de lipides anioniques contenant la fraction de poids de 20 % de lipides anioniques. Évaporer le chloroforme sous un courant d’azote pour former une fine couche de lipides sec. Retirez le chloroforme résiduel sous vide pendant 10 min.NOTE : Traditionnellement, cette étape prend beaucoup plus longtemps (1-12 h), mais nous avons constaté qu’un traitement plus long ne fournit aucune amélioration évidente dans le couplage des propriétés des SUV. Hydrater le film lipidique sec en ajoutant 0,5 mL de tampons A (100 mM KCl, 1 mM MgCl2, vadrouilles de 50 mM, pH 7,4) à chaque flacon et laisser reposer à température ambiante pendant 30 min et puis vortex jusqu’à ce que le film lipidique est complètement détaché de la surface du verre et b précèd une suspension homogène de lipides. Cela devrait prendre environ 20 à 40 s. Formation de SUV et LUV par extrusion Monter un système d’extrusion (voir la Table des matières) tailles de pores avec deux seringues de 1 mL en utilisant un filtre en polycarbonate avec une des valeurs suivantes : 100 ou 200 nm à votre SUV et 400 ou 800 nm à forme LUV. Transférer la suspension de lipides dans une seringue. Extruder la suspension en passant à travers le filtre 21 fois, comme le montre d’ailleurs18,19.Remarque : Un nombre impair de passages est nécessaire pour minimiser le transfert dans la solution de vésicules de lipide grandes touffes collé à la face de filtre vers la suspension originale de lipides. Transfert en solution de vésicule dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL. 2. formation de fusogène GUV par méthode émulsion inversé Remarque : Cette procédure est illustrée à la Figure 2. Préparation de la solution de lipide-dans-huile Mélanger un stock de chloroforme (voir étape 1.1.1) d’un lipide neutre (2 mg) et d’un lipide anionique (0,5 mg) avec 1 mL d’hexadécane dans tube microtubes de 1,5 mL. Évaporer le chloroforme du mélange sous la constante mélanger et chauffer à 80 ° C pendant 30 min, maintenir le tube ouvert. Fermer le tube et laisser refroidir à température ambiante. Formation d’une monocouche de lipides à l’interface lipide-dans-huile/aqueuse tampon Place 200 µL de la solution de lipides dans l’huile sur le dessus de 0,5 mL de tampon B (20 mM KCl, 0,1 mM MgCl2, 10 mM MOPS de pH 7,4) dans un tube à centrifuger 1,5 mL. Notez la forme convexe de la frontière de séparation de phase en raison de l’incompatibilité de la tension superficielle entre l’huile et le tampon aqueux (Figure 2 a). Attendre jusqu’à ce que la frontière de séparation de phase s’aplatit, qui témoigne de la formation de monocouches de lipide sur elle. Cela prend généralement de 30 à 60 min à température ambiante. Préparation d’une émulsion eau-dans-huile Préparer une solution d’un polysaccharide soluble dans l’eau non ioniques dans un tampon B, avec une densité supérieure à la densité de l’eau (p. ex. 15 % Ficoll-400 (p/v), avec une densité 1,05 g/mL)NOTE : On peut éventuellement ajouter des fluorochromes soluble dans l’eau à la mémoire tampon pour une meilleure visualisation de GUV et tout autre contenu aqueux souhaitée des GUVs. Transférer 0,5 µL du mélange ci-dessus dans un tube à centrifuger de 1,5 mL séparé avec 100 µL de la solution de lipides dans l’huile de 2.1.2. Soniquer (44 kHz à 14 W) le mélange pendant 30 s dans un bain d’eau à ultrasons. Puis, vigoureusement vortex pendant 45 min former une émulsion eau-dans-huile, où chaque gouttelette sera enduite par une monocouche de lipides (Figure 2 b). Filialisation de l’émulsion eau-dans-huile GUV Placer l’émulsion résultante sur l’interface lipide-dans-huile/aqueux et Centrifuger immédiatement le tube dans une centrifugeuse de table-top à 10 000 x g pendant 2 min. La pastille qui en résultent de GUV doit être clairement visible (Figure 2). Refroidir le tube à 4 ° C dans un réfrigérateur pour solidifier le mélange lipidique dans l’huile (Figure 2D, hexadécane solidifie au-dessous de 18 ° C), retirer délicatement la gelée de pétrole et ensuite retirer la phase aqueuse.NOTE : Pour faciliter l’huile antigel enlèvement un fil plié en forme de point d’ancrage a été utilisé. Resuspendre le culot GUV dans 50 µL de tampon de frais B, transfert vers un nouveau tube et l’examiner sous un microscope à fluorescence à l’aide d’un objectif à immersion d’huile X 100 (Figure 2E). 3. suivi de la Fusion des vésicules avec Cobalt-calcéine méthode Préparation d’une colonne de gravité-filtration sur gel. Faire tremper environ 10 g de résine gel-filtration (p. ex. superfine sephadex G-50) dans 100 mL d’eau désionisée et laissez gonfler pendant la nuit. Paquet de 3 mL de la résine dans une colonne d’écoulement de gravité en plastique jetables, lavez-le avec de l’eau ultrapure et équilibrer avec tampon C (100 mM KCl, vadrouilles de 10 mM, pH 7,4) à température ambiante. Préparation de SUV+ ou SUV0 truffé de cobalt-calcéine. Préparer une solution contenant calcéine 1 mM, 1 mM CoCl2, 98 mM NaCl, 10 mM MOPS, puis amener le pH à 7.4.Remarque : L’essence de la méthode est que calcéine fluorescent libre forme un complexe de non fluorescent avec Co2 +. Il devient fluorescent à nouveau lors de l’addition d’EDTA, qui ayant une affinité plus élevée pour le Co2 +, déplace calcéine du complexe de cobalt-calcéine (Figure 3 a). Ajouter 500 µL de cette solution à un film sec de lipides cationiques ou neutres préparé comme indiqué au point 1.1. Préparer 100 nm vus par extrusion comme décrit dans 1.2. Pellet extrudé SUV à 1 000 000 x g pendant 20 min dans une ultracentrifugeuse table-top et remettre en suspension dans 1 mL de tampon C. Granulation et la remise en suspension le répète trois fois ; utiliser 0,6 mL de tampon C pour la dernière remise en suspension.Remarque : Ces étapes enlèvent la plupart de la cobalt-calcéine externe. Supprimer le cobalt-calcéine externe restant en passant vus à travers une colonne d’écoulement par gravité jetables chargée avec la filtration sur gel résine équilibrée avec tampon C comme pour l’étape 3.1.2.NOTE : Nous en général jeter le premier volume de millilitre de l’accréditif et recueillir le deuxième millilitre, qui contient cobalt-calcéine externe libre SUV. Préparation des SUV– chargés avec de l’EDTA Préparer la solution de 10 mM EDTA, 80 mM NaCl, vadrouilles de 10 mM, pH 7,4. Ajouter 500 µL de cette solution à un film sec de lipides anioniques préparé comme indiqué au point 1.1. Préparer les SUV– par extrusion comme décrit dans 1.2. Pellet et resuspendre SUV– comme décrit dans 3.2.4. Supprimer l’EDTA restant en passant SUV– à travers la colonne de filtration sur gel tel que décrit en 3.2.5. Préparation des SUV de fusion Diluer le SUV0, SUV+et SUV– avec le tampon D (MOPS de 1 mM, pH 7,4) additionné de 0,2 mM CoCl2 et la concentration désirée de KCl. utilisation 5 µL de chaque type de SUV pour 1 mL de tampon D. Incuber le mélange pendant au moins 1 h.Remarque : Cette étape réduira le niveau de fluorescence de fond en bloquant calcéine est liée par surface à SUV+. Fusion des vésicules Déclencher la réaction de fusion de mélanger 1 mL de SUV+ ou SUV0 avec 1 mL de SUV− (dilué dans un tampon D tel que décrit ci-dessus) dans une cuvette de 2 mL fluorimètre et moniteur augmentant la fluorescence de calcéine avec 480 nm excitation et 510 nm d’émission (Figure 3 b). Attendez que la réaction vient jusqu’à la fin. Ajouter un mélange de détergent Triton X-100 et EDTA (concentration finale de 0,05 % et de 7 mM, respectivement) de libérer calcéine de vésicules et d’obtenir le signal de fluorescence maximale. Déterminer le degré de fusion défini comme le pourcentage du signal de fluorescence maximale après l’addition de détergent comme le montre la Figure 3. 4. rapide Reconstitution des protéines membranaires dans des protéoliposomes coniques Remarque : Cette procédure est illustrée dans la Figure 4 a. Préparer une colonne débit de gravité avec la résine filtration sur gel comme décrit au point 3.1 et il équilibrer avec tampons A température ambiante.Remarque : Toutes les manipulations supplémentaires doivent être faites strictement à ≤ 4 ° C, sauf indication contraire, à réduire la perte de l’activité de la protéine. Ajuster la concentration de la protéine purifiée de membrane à 0,7 mg/mL en diluant il avec le même tampon d’extraction utilisé pour isoler les protéines. Mix 140 µL de la protéine avec 300 µL de SUV préformé, 160 µL tampon A et 60 µL de cholate de 10 % dans un tampon A ; Cela donne à 01:30 protéines : rapport de poids de lipide dans un volume final de 660 µL. Agiter doucement le mélange sur une plate-forme bascule pendant 15 min.Remarque : Les étapes suivantes peuvent s’effectuer à la température ambiante. Passer le mélange à travers résine gel-filtration et recueillir turbides fractions contenant des protéoliposomes. Pellet protéoliposomes avec une ultracentrifugeuse plateau à 400 000 x g pendant 15 min. Jeter le surnageant contenant des protéines non reconstituée et Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon frais A. Déterminer la teneur en protéines en PL et le surnageant à l’aide de la méthode Amido-noir20. Déterminer le rendement de la reconstitution, qui est généralement d’environ 50 à 70 %.NOTE : Étapes 4,6 et 4,8 peuvent éventuellement être remplacées par passant solution PL par 1 mL de résine Ni-NTA emballé dans une colonne de gravité jetables et laver avec tampons A comme décrit en 3.1.2. Tel passage va se séparer des protéines non reconstituée, qui seront préférentiellement lié à la résine, de PL, plus dont sera dans le cheminement. 5. fonctionnels Tests d’activité de la protéine dans les protéoliposomes Remarque : Les deux protéines utilisées dans cette étude sont des pompes à protons puissant qui pompent H+ dans des protéoliposomes lors de l’addition de leurs substrats (Coenzyme Q1 pour bo3-oxydase et l’ATP pour F1Fo, respectivement), ce bâtiment un gradient de protons à travers la membrane (ΔpH). En cas de succès co reconstitution par fusion, cette acidification peut être observée une diminution de fluorescence d’une sonde pH sensibles ACMA (9-amino-6-chloro-2-méthoxyacridine)12,15, qui est utilisé couramment pour ces tâches ( Figure 4 b -C). L’activité des protéines de plus axée sur le substrat (Coenzyme Q1 oxydation par bo3-oxydase22 et hydrolyse de l’ATP par F1Fo23,24) peuvent être surveillés par spectrophotométrie à l’aide de diverses méthodes. Ici, nous démontrons l’activité de l’hydrolyse d’ATP de F1Fo PL utilisant un ATP régénérant assay (Figure 4), où deux enzymes (pyruvate kinase (PK) et la lactate déshydrogénase (LDH) maintiennent une concentration constante de l’ATP comme suit. PK recycle ATP en convertissant ADP produite par F1Fo retour dans l’ATP aux dépens de son substrat phosphoénolpyruvate (PEP). Qui est un produit de cette réaction, le pyruvate est converti en lactate par LDH au détriment de la NADH, l’oxydation qui peut être contrôlée en diminuant la densité optique à 340 nm. Préparation de produits chimiques Préparation de 1 mM ACMA stock dans l’éthanol. Préparer un stock de 1 mM de nigéricine (ou n’importe quel autre découpleur) dans l’éthanol. Préparer le stock de 25 mM de Coenzyme Q1 dans l’éthanol et stock DTT 1 M dans un tampon A. Préparation d’un stock de 100 mM ATP en tampons A et ajuster son pH à 7,4. Préparer des stocks d’ATP régénérant des composants du système tampon A: 100 mM PEP, NADH de 1 mM, et solutions de PK et LDH à concentration de ~ 500-1 000 unités/mL. Coenzyme Q1 pilotée par oxydation proton pompage par bo3-oxydase PL Ajouter 20 µL de PL dans une cuvette de fluorimètre avec tampons 2 mL A en présence de 0,5 µM ACMA et attendre le signal stable à l’aide de 430 nm excitation et 515 nm d’émission. Ajouter 40 µM Coenzyme Q1 à la cuvette. Initier le proton pompage en ajoutant 2 mM DTT au PL (Figure 4 b).NOTE : TNT réduit oxydé Coenzyme Q1 et rend accessible au bo3-oxydase. Dissipent ΔpH formé en ajoutant 2 découpleur µM (par exemple nigéricine). Signal de fluorescence ACMA devrait revenir rapidement à presque le niveau d’origine.Remarque : Il ne faudrait aucun ACMA trempe lors de l’addition du substrat, si le découpleur est initialement présent dans le mélange réactionnel. Proton de pilotée par l’hydrolyse d’ATP de pompage de F1FoPL Ajouter 40 µL de PL dans une cuvette de fluorimètre comme décrit au point 5.2. Initier le proton pompage en ajoutant ATP de 0,2 mM à PL (Figure 4). Dissiper les ΔpH comme décrit dans 5.2.4. Hydrolyse de l’ATP par F1FoPL et sa stimulation par découpleur Ajouter 40 µL de PL dans une cuvette de spectrophotomètre avec 2 mL tampon A, contenant 1 mM ATP, NADH de 0,2 mM, 2 mM PEP et 15 µL de chaque de PK et LDH. Suivre la réaction en mesurant la diminution de l’absorbance du NADH à 340 nm. 3-4 min plus tard, ajouter 2 découpleur µM à la cuvette pour libérer la contre-pression de ΔpH sur l’hydrolyse de l’ATP. La vitesse de réaction devrait augmenter immédiatement.NOTE : PL traversé résine Ni-NTA comme décrit dans 4.10 démontrera la stimulation plus forte par le découpleur (Figure 4, rouge trace), tandis que l’éluat sera à peine stimulée (trace bleue). 6. essai Influence du milieu lipidique et de la force ionique sur la fonctionnalité des protéines membranaires aux coniques protéoliposomes Évaluer le proton pompage de 40 µL de PL+, PL– et PL0 avec dosage trempe ACMA dans 2 mL de tampon D additionné de 1 MgCl2 et 20 (Figure 5, groupe A) ou 100 mM KCl (groupe B), comme décrit dans 5.2 ou 5.3 (Figure 5 des traces de rouges, noirs et bleus). Fusible 40 µL de PL+ avec le même volume de LUV– dans 2 mL de tampon D additionné de 20 mM KCl et test d’une trempe (trace verte) ACMA. Exécuter des expériences de contrôle comme dans l’étape 2 en mélangeant, par exemple, PL et SUV de même charge (trace de gris).NOTE : Proton pompage devrait être améliorée en traduisaient PL. 7. livraison des protéines membranaires dans LUV et GUV de coniques protéoliposomes Fusible 50 µL de PL+ avec 50 µL de 800 nm LUV– dans 1 mL de tampon D complété avec 1 mM MgCl2et 20 mM KCl pendant 5 min. Pellet les vésicules à 6 000 x g pendant 5 min et jeter le surnageant contenant n’a pas réagi PL+. Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon D additionné de 1 mM MgCl2 et 100 mM KCl, puis répétez la granulation et resuspendant deux fois plus. Exécutez l’ACMA trempe le test décrit à 5.2 ou 5.4. Exécuter des expériences de contrôle, tout comme aux étapes 1-3, à l’aide de combinaisons de complémentaires vésicules chargées en sel élevée (200 mM KCl), des vésicules non-coniques et juste vide LUV– sans PL+.NOTE : Proton pompage par après LUV devrait être détecté uniquement lorsque la complémentarité chargée de vésicules ont été utilisés comme illustré à la Figure 6. 8. montage de la chaîne de Transport d’électrons provenant des composants individuels dans les Membranes de LUV et GUV et la Production d’ATP par cette chaîne. Remarque : Un schéma de cette procédure est illustré dans la Figure 7 a. ATP produite dans cette expérience sera enregistré par le système luciférine-luciférase, où la conversion de l’ATP synthétisée en pyrophosphate et AMP de la luciférase est suivie luminescence enregistré avec un luminomètre. Nous recommandons d’utiliser un luminomètre simple-tube, au lieu des luminomètres microplaque moins sensibles. Mix 3 µL de bo3-oxydase PL+ et 5 µL de F1Fo PL+ forment comme décrit à la Section 4. Les fusionner avec 3 µL de LUV ou GUV– (formé comme décrit dans la Section 2) en 800 µL de tampon D additionné de 20 mM de KCl et 1 mM MgCl2 pendant 5 min. À l’aide de stocks de haute concentration, ajoutez KCl et vadrouilles à 100 mM et 50 mM de concentration finale aux membranes traduisaient.Remarque : En cas de fusion après LUV, cette étape empêche leur gonflement en raison du décalage osmotique entre l’externe (tampons A) et l’intravésiculaire (tampon D) concentration des sels. Éventuellement, les membranes traduisaient à pellets comme décrit au point 7.2 de séparer SUV n’ayant pas réagi+et Resuspendre le culot dans 800 µL de tampon A. Préparer 200 µL d’une luciférine-luciférase-ADP cocktail contenant 400 µM ADP, 50 luciférine µM et 2,5 µg luciférase dans tampons A Ajouter le cocktail au mélange traduisaient de Step8.3. Ajouter 40 µM d’oxydé Coenzyme Q1et déclencher la mise sous tension des membranes traduisaient par bo3-oxydase en ajoutant 2 mM TNT. Attendre 1 min. Initier la synthèse d’ATP par l’ajout de phosphate de potassium de 5 mM (PKj’ai, pH 7,4) aux vésicules sous tension et de détecter la production d’ATP avec un luminomètre (Figure 7 b). Exécutez la réaction pendant environ 3 min.NOTE : Réaction de synthèse d’ATP produit pendant 5-7 min jusqu’à épuisement de l’oxygène consommé par bo3-oxydase et la luciférase. Ajouter étalon de référence ATP (0,5 nmol ATP) au mélange réactionnel deux fois. Mesure ATP produites. Obtenir le montant réel de l’ATP produit lors de la réaction en divisant le signal de la réaction de synthèse d’ATP par le signal standard de référence de ATP. Régler cette valeur sur la quantité totale de F1Fo utilisés dans la réaction et enfin d’exprimer le taux de synthèse de l’ATP en µmol ATP / (mg F1Fo* min).