Wasmiddel-vrije ultrasnelle reconstitutie van membraaneiwitten in lipide-Bilayers met behulp van Fusogenic aanvullende geladen Proteoliposomes.

1. bereiding van fusogenic SUV en LUV Voorbereiding van fusogenic lipide mengsel Bereiden van stamoplossingen van neutrale, kationische anionogene en fluorescerende lipiden in chloroform bij 25-50 mg/mL (bijvoorbeeld, neutrale DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), kationische ethyl-PC (1,2- dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), anionogene POPA (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate), en fluorescerende cholesteryl-Bodipy-FL12, respectievelijk) door weging van de juiste hoeveelheid droge lipiden en hen oplost in 100% chloroform (Let op! Doe dit onder een zuurkast), of verdunnen van verkrijgbare chloroform voorraden van lipiden met chloroform.Opmerking: Zowel natuurlijke lipide extracten en zuivere synthetische lipiden kunnen worden gebruikt en vergelijkbare resultaten tonen. Mix 2,5 mg een kationische en 2,5 mg een neutrale lipide in chloroform voorraad (1.1.1) in een glazen ampul.Opmerking: Deze stap levert 5 mg van kationische lipide mengsel in chloroform, met 50% gewicht Fractie van kationische lipiden. Wanneer nodig, 0,5% gewicht breuk van een fluorescerende lipide aan het mengsel toevoegen. Meng 1 mg anionogene en 4 mg van neutrale lipiden in chloroform voorraden (1.1.1) in een glazen ampul. Dit geeft 5 mg van anionactieve lipide mengsel met 20% gewicht Fractie van anionactieve lipiden. Chloroform onder een stroom van stikstof om te vormen van een dunne laag van droge lipide verdampen. Verwijder de resterende chloroform onder drukvermindering gedurende 10 minuten.Opmerking: Traditioneel deze stap duurt veel langer (1-12 h), maar we vonden dat een langere behandeling geen duidelijke verbetering biedt in de koppeling van de eigenschappen van een SUV. Hydrateer de droge lipide-film door toevoeging van 0,5 mL buffer A (100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM MOPS, pH 7.4) aan elke flacon en waardoor ze staan bij kamertemperatuur voor 30 min, waarna vortex totdat de lipide-film volledig los van het glasoppervlak en b is ecomes een homogene lipide schorsing. Dit moet nemen over 20-40 s. Vorming van de SUV en LUV door extrusie Monteren van een extrusie-systeem (Zie de Tabel van materialen) met twee 1 mL spuiten met behulp van een polycarbonaat-filter met een van de volgende porie maten: 100 of 200 nm aan formulier SUV, en 400 of 800 nm aan formulier LUV. Spoel de suspensie van lipide in een spuit. Geef de diepte van de opschorting door het door het filter 21 keer, zoals elders18,19.Opmerking: Een oneven aantal passages is nodig om het minimaliseren van de overdracht in het vesikel oplossing van grote lipide bosjes vast aan de zijde van de filter naar de oorspronkelijke lipide schorsing. Pipetteer vesikel oplossing in 1,5 mL microcentrifuge buizen. 2. vorming van Fusogenic GUV door omgekeerde emulsie methode Opmerking: Deze procedure wordt geïllustreerd in Figuur 2. Bereiding van lipide-in-olie-oplossing Meng een voorraad van chloroform (zie stap 1.1.1) van een neutrale lipide (2 mg) en een anionogene lipide (0.5 mg) met 1 mL hexadecaan in 1.5-mL microcentrifuge buis. Verdampen chloroform uit het mengsel onder voortdurend mengen en verwarming bij 80 ° C gedurende 30 minuten de buis open te houden. Sluit de buis en laat afkoelen tot kamertemperatuur. Vorming van een lipide enkelgelaagde op het raakvlak van lipide-in-olie/waterige buffer Plaats 200 µL van het lipide-in-olie-oplossing op de top van 0,5 mL buffer B (20 mM KCl, 0.1 mM MgCl2, 10 mM MOPS pH 7.4) in een centrifugebuis 1,5 mL. Opmerking de bolle vorm van de fase-scheiding grens als gevolg van oppervlaktespanning wanverhouding tussen de olie en de waterige buffer (figuur 2A). Wacht tot de grens van de scheiding fase worden afgevlakt, die is een indicatie van lipide enkelgelaagde vorming op het. Dit duurt meestal 30-60 min bij kamertemperatuur. Voorbereiding van een water-in-olie emulsie Bereiden van een oplossing van een in water oplosbare niet-ionogene polysaccharide in buffer B, met een dichtheid hoger dan de dichtheid van water (bijvoorbeeld 15% densiteitgradiënt-400 (w/v), met dichtheid 1.05 g/mL)Opmerking: Eventueel kan men fluorescente in water oplosbare kleurstoffen toevoegen aan de buffer voor betere visualisatie van GUV, en eventuele andere gewenste waterige inhoud van de GUVs. 0,5 µL van het bovenstaande mengsel een aparte 1.5-mL centrifugebuis met 100 µL van de lipide-in-olie-oplossing van 2.1.2 overbrengen. Bewerk ultrasone trillingen ten (44 kHz op 14 W) het mengsel voor 30 s in een ultrasone waterbad. Dan, krachtig vortex voor 45 min om te vormen van een water-in-olie emulsie, waar elke druppel zal worden bekleed door een lipide enkelgelaagde (figuur 2B). Omzetting van de water-in-olie emulsie in GUV De resulterende emulsie plaats op de top van het lipide-in-olie/waterige interface en centrifugeer onmiddellijk de buis in een tafelblad centrifuge op 10.000 x g gedurende 2 minuten. De resulterende pellet van GUV moet duidelijk zichtbaar (figuur 2C). De buis tot 4 ° C in een koelkast te stollen van het lipide-in-olie mengsel afkoelen (figuur 2D, hexadecaan stolt minder dan 18 ° C), verwijder voorzichtig bevroren olie, en dan trekken de waterige fase.Opmerking: Om olie verwijdering bevriezen een draad in de vorm van een anker gebogen werd gebruikt. Resuspendeer de pellet GUV in 50 µL van verse buffer B, overdracht naar een verse buis, en onder een fluorescentie Microscoop met behulp van een 100 X olie onderdompeling doelstelling (figuur 2E) te inspecteren. 3. toezicht vesikel Fusion met kobalt-calceïne methode Voorbereiding van een gel-filtratie zwaartekracht kolom. Geniet van een gel-filtratie-hars (bijvoorbeeld superfijne sephadex G-50) ~ 10 g in 100 mL gedeïoniseerd water en laat ‘s nachts zwellen. Pak 3 mL van de hars in een wegwerp plastic zwaartekracht stroom kolom, wassen met ultrazuiver water en equilibreer met buffer C (100 mM KCl, 10 mM MOPS, pH 7.4) bij kamertemperatuur. Voorbereiding van de SUV+ of SUV0 geladen met kobalt-calceïne. Bereid een oplossing met calceïne 1 mM, 1 mM CoCl2, 98 mM NaCl, 10 mM MOPS, dan brengen pH aan 7.4.Opmerking: De essentie van de methode is dat die gratis fluorescerende calceïne vormt een niet-fluorescerende complex met Co2 +. Wordt het fluorescerende opnieuw op toevoeging van EDTA, welke met hogere affiniteit voor Co2 +, verdringt calceïne van het kobalt-calceïne complex (figuur 3A). Voeg 500 µL van deze oplossing naar een droge film van kationische of neutrale lipiden voorbereid zoals beschreven in punt 1.1. Bereiden van 100 nm SUV door extrusie zoals beschreven in 1.2. Pellet geëxtrudeerde SUV bij 1.000.000 x g gedurende 20 min in een tafelblad ultracentrifuge en resuspendeer in 1 mL buffer C. Herhaal pillering en resuspensie driemaal; 0,6 mL buffer C voor de laatste resuspensie gebruiken.Opmerking: Deze stappen verwijdert u allermeest naar de externe kobalt-calceïne. Verwijder de resterende externe kobalt-calceïne door SUV passeren een wegwerp zwaartekracht-flow kolom geladen met de gel-filtratie-hars geëquilibreerd met buffer C zoals beschreven voor stap 3.1.2.Opmerking: We doorgaans negeren van het eerste deel van de milliliter van de doorstroming en verzamelen de tweede milliliter, waarin externe kobalt-calceïne gratis SUV. Voorbereiding van SUV- geladen met EDTA Bereid de oplossing van 10 mM EDTA, 80 mM NaCl, 10 mM MOPS, pH 7.4. Voeg 500 µL van deze oplossing naar een droge film van anionactieve lipiden voorbereid zoals beschreven in punt 1.1. Bereiden SUV- door extrusie zoals beschreven in 1.2. Pellet en resuspendeer SUV- , zoals beschreven in 3.2.4. Verwijder de resterende EDTA door SUV- door de gel-filtratie-kolom zoals beschreven in de punten 3.2.5. Voorbereiding van de SUV voor fusion Verdun SUV0, SUV+en SUV- met buffer D (1 mM MOPS, pH 7.4) aangevuld met 0,2 mM CoCl2 en de gewenste concentratie van KCl. gebruik 5 µL van elke soort SUV per 1 mL buffer overleden Laat het mengsel gedurende ten minste 1 uur inwerken.Opmerking: Deze stap zal het minimaliseren van het achtergrondniveau van de fluorescentie door het blokkeren van calceïne dat oppervlak is gebonden aan SUV+. Vesikel fusion Fusie reactie door 1 mL SUV+ of SUV0 te vermengen met 1 mL van de SUV− (verdund in buffer D zoals hierboven beschreven) start in een cuvet van 2 mL fluorimeter en monitor verhoging van fluorescentie calceïne met behulp van 480 nm excitatie en 510 nm emissie (Figuur 3B). Wacht totdat de reactie bij de voltooiing. Toevoegen van een mengsel van wasmiddel Triton X-100 en EDTA (eindconcentratie van 0,05% en 7 mM, respectievelijk) vrijgeven calceïne uit blaasjes en verkrijgen van het signaal maximale fluorescentie. Het bepalen van de omvang van de fusion gedefinieerd als het percentage van het signaal van de maximale fluorescentie na de wasmiddel toevoeging zoals aangegeven in Figuur 3 c. 4. snelle reconstitutie van membraaneiwitten in Fusogenic Proteoliposomes Opmerking: Deze procedure wordt geïllustreerd in figuur 4A. Bereiden van een zwaartekracht stroom kolom met de gel-filtratie-hars zoals beschreven in 3.1 en equilibreer het met buffer A bij kamertemperatuur.Opmerking: Alle verdere manipulaties moeten gebeuren strikt op ≤ 4 ° C, tenzij anders aangegeven, om te minimaliseren van verlies van eiwit activiteit. Concentratie van het gezuiverde membraan eiwit tot 0,7 mg/mL aanpassen door verdunning van het met de dezelfde extractie buffer die wordt gebruikt voor isolatie van de eiwit. Mix-140 µL van het eiwit met 300 µL van voorgevormde SUV, 160 µL buffer A en 60 µL van 10% cholate in Buffer A; Dit geeft 1:30 eiwit: lipide gewichtsverhouding in een eindvolume van 660 µL. Schud het mengsel zachtjes op een rockende platform voor 15 min.Opmerking: De volgende stappen kunnen worden gedaan bij kamertemperatuur. Laat het mengsel door de gel-filtratie hars, en het verzamelen van troebel breuken met proteoliposomes. Pellet proteoliposomes met een tafelblad ultracentrifuge bij 400.000 x g gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatant die niet-gereconstitueerd eiwitten bevatten, en resuspendeer de pellet in 1 mL verse buffer A. Bepaal het eiwitgehalte in PL en het supernatant met behulp van de methode Amido-zwart20. Bepalen het rendement van reconstitutie, welke meestal rond 50-70%.Opmerking: Stappen 4.6-4.8 kunnen eventueel worden vervangen door het passeren van PL oplossing door 1 mL Ni-NTA hars verpakt in een wegwerp zwaartekracht kolom en gewassen met Buffer A zoals beschreven in 3.1.2. Dergelijke doorgeven worden gescheiden niet-gereconstitueerd eiwit, dat bij voorkeur zullen worden gebonden aan de hars, uit PL, meest waarvan zal worden in de doorstroming. 5. functionele effectiviteitstesten eiwit in Proteoliposomes Opmerking: Beide eiwitten gebruikt in deze studie zijn krachtige proton pompen, die H+ in proteoliposomes bij toevoeging van hun substraten pompen (co-enzym Q-1 voor bo3-oxidase en ATP voor F-1Fo, respectievelijk), dus bouw een proton verloop over het membraan (ΔpH). In geval van succesvolle co reconstitutie door fusie, kan dergelijke verzuring worden waargenomen als een afname van de fluorescentie van een sonde van de pH-gevoelige ACMA (9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine)12,15, die routinematig voor dergelijke taken gebruikt is ( Figuur 4B -C). Bovendien substraat-specifieke activiteit van de eiwitten (co-enzym Q1 oxidatie door bo3-oxidase22 en ATP-hydrolyse door F1Fo23,24) kan worden gecontroleerd spectrophotometrically met behulp van verschillende methoden. Hier tonen we ATP hydrolyse-activiteit van F1Fo PL met behulp van een ATP regenereren assay (Figuur 4 d), waar twee enzymen (pyruvaat kinase (PK) en lactaat dehydrogenase (LDH) handhaving van een constante concentratie van ATP als volgt. PK recycleert ATP door het omzetten van ADP geproduceerd door F1Fo terug in ATP ten koste van zijn substraat phosphoenolpyruvate (PEP). Pyruvaat, dat een product van deze reactie is, wordt omgezet in melkzuur door LDH ten koste van NADH, de oxidatie van die kan worden gecontroleerd als minderen optische dichtheid bij 340 nm. Voorbereiding van chemische stoffen Bereiden 1 mM ACMA voorraad in ethanol. Een 1 mM voorraad van nigericin (of elke andere uncoupler) in ethanol te bereiden. Bereiden van 25 mM co-enzym Q1 voorraad in ethanol, en 1 M DTT voorraad in buffer A. Bereiden van een voorraad van 100 mM ATP in Buffer A en breng de pH op 7.4. Bereiden van voorraden van ATP regenereren systeemonderdelen in Buffer A: 100 mM PEP, 1 mM NADH en oplossingen van PK en LDH bij concentratie van ~ 500-1000 eenheden/mL. Co-enzym Q1 oxidatie-gedreven proton pompen door bo3-oxidase PL Voeg 20 µL van PL naar een fluorimeter Cuvet met 2 mL buffer A in aanwezigheid van 0,5 µM ACMA en wachten tot stabiel signaal met 430 nm excitatie en 515 nm emissie. Voeg toe 40 µM co-enzym Q1 aan de cuvette. Initiëren proton pompen door toevoeging van 2 mM DTT aan PL (figuur 4B).Opmerking: DTT vermindert geoxideerde co-enzym Q1 en maakt het beschikbaar voor bo3-oxidase. Verdrijven gevormde ΔpH door toevoeging van 2 µM uncoupler (bijvoorbeeld nigericin). ACMA fluorescentie signaal moet snel terugkeren naar bijna het oorspronkelijke niveau.Opmerking: Er mag geen ACMA blussen na toevoeging van het substraat, als de uncoupler in eerste instantie in het reactiemengsel aanwezig is. ATP hydrolyse-gedreven proton pompen door F1FoPL Voeg 40 µL van PL naar een fluorimeter cuvette zoals beschreven in punt 5.2. Initiëren proton pompen door het toevoegen van 0,2 mM ATP aan PL (figuur 4C). Verdrijven ΔpH zoals beschreven in 5.2.4. ATP-hydrolyse door F1FoPL, en het stimuleren van de uncoupler Voeg 40 µL van PL naar een spectrofotometer Cuvet met 2 mL buffer A, met 1 mM ATP, 0,2 mM NADH, 2 mM PEP, en 15 µL van PK en LDH. Volg de reactie door het meten van de extinctie daling van NADH bij 340 nm. 2 µM uncoupler toevoegen 3-4 min later aan de cuvette vrij te geven van de tegendruk van de ΔpH op de ATP-hydrolyse. De reactiesnelheid moet onmiddellijk verhogen.Opmerking: PL gepasseerd Ni-NTA hars zoals beschreven in 4.10 Demonstreer de sterkste stimulatie door de uncoupler (Figuur 4 d, rode trace), terwijl het eluaat zullen nauwelijks gestimuleerd (blauwe trace). 6. het testen van invloed van lipide milieu en Ionische sterkte op functionaliteit van membraaneiwitten in Fusogenic Proteoliposomes Beoordelen proton pompen door 40 µL van PL+, PL- en PL0 met ACMA blussen test in 2 mL buffer D aangevuld met 1 mM MgCl2 en 20 (Figuur 5, deelvenster A) of 100 mM KCl (deelvenster B) zoals beschreven in 5.2 of 5.3 (Figuur 5 rode, zwarte en blauwe sporen). Zekering 40 µL van PL+ met dezelfde hoeveelheid LUV- in 2 mL zuiver buffer D aangevuld met 20 mM KCl, en test voor ACMA blussen (groene trace). Controle experimenten zoals in stap 2 uitvoert door het mengen van, bijvoorbeeld, laden PL en SUV van hetzelfde (grijze trace).Opmerking: Proton pompen moet worden verbeterd door postfusion PL. 7. levering van membraaneiwitten in LUV en GUV door Fusogenic Proteoliposomes Zekering 50 µL van PL+ met 50 µL van 800 nm LUV- in 1 mL buffer D aangevuld met 1 mM MgCl2en 20 mM KCl voor 5 min. De blaasjes bij 6.000 x g gedurende 5 min pellet en negeren supernatant met spoorverontreiniging PL+. Resuspendeer de pellet in 1 mL buffer D aangevuld met 1 mM MgCl2 en 100 mM KCl, en herhaal pillering en resuspending twee keer meer. ACMA assay blussen, zoals beschreven in 5.2 of 5.4 uitvoeren Voer controle experimenten, zoals in de stappen 1-3, met behulp van combinaties van aanvullende geladen blaasjes in hoge zout (200 mM KCl), niet-fusogenic blaasjes en loze LUV- zonder PL+.Opmerking: Proton pompen door postfusion LUV moet alleen wordt ontdekt als complementair geladen blaasjes werden gebruikt zoals weergegeven in Figuur 6. 8. assemblage van elektronentransport keten van afzonderlijke onderdelen in de membranen van LUV en GUV en ATP-productie door deze keten. Opmerking: Een schematische voorstelling van deze procedure wordt geïllustreerd in figuur 7A. ATP geproduceerd in dit experiment zal worden geregistreerd door het luciferine-luciferase systeem, wanneer de omzetting van gesynthetiseerde ATP in pyrofosfaat en AMP door luciferase wordt gevolgd door licht emissie geregistreerd met een luminometer. Het is raadzaam om met behulp van een single-buis-luminometer, in plaats van het minder gevoelig microplate-luminometers. Mix 3 µL van bo3-oxidase PL+ en 5 µL van F1Fo PL+ gevormd zoals beschreven in sectie 4. Zekering hen met 3 µL van LUV of GUV- (gevormd zoals beschreven in sectie 2) in 800 µL van buffer D aangevuld met 20 mM KCl en 1 mM MgCl2 voor 5 min. KCl en MOPS wordt met behulp van hoge concentratie voorraden, toevoegen aan de definitieve concentratie van 100 mM en 50 mM aan de postfusion membranen.Opmerking: In geval van post fusie LUV, deze stap wordt voorkomen dat hun zwelling als gevolg van de verschuiving van de osmotische tussen de externe (buffer A) en de intravesicular (buffer D) concentratie zouten. Eventueel de postfusion membranen pellet zoals beschreven in 7.2 te scheiden spoorverontreiniging SUV+en resuspendeer de pellet in 800 µL van buffer A. Bereiden van 200 µL van een luciferine-luciferase-ADP cocktail met 400 µM ADP, 50 µM luciferine en 2,5 µg luciferase in buffer A De cocktail toevoegen aan het postfusion mengsel van Step8.3. Voeg toe 40 µM van geoxideerd co-enzym Q1en energization van de postfusion membranen trigger door bo3-oxidase door toevoeging van 2 mM DTT. 1 min wachten. Starten van de ATP-synthese door toevoeging van 5 mM kalium fosfaat (KPik, pH 7.4) aan energiek blaasjes en detecteren van de ATP productie met een luminometer (figuur 7B). De reactie van ~ 3 min lopen.TOELICHTING: ATP synthese reactie opbrengsten gedurende 5-7 minuten tot uitputting van zuurstof verbruikt door bo3-oxidase en luciferase. ATP-norm (0.5 nmol ATP) aan het reactiemengsel tweemaal toevoegen. Maatregel ATP geproduceerd. Het werkelijke bedrag van ATP geproduceerd in de reactie door het verdelen van het signaal van de ATP synthese reactie door de ATP referentie standaardsignaal verkrijgen. Pas deze waarde aan het totale bedrag van F1Fo gebruikt in de reactie, en ten slotte express het tempo van de ATP-synthese in µmol ATP / (mg F1Fo* min).