无洗涤剂超快重组膜蛋白成脂双层使用融合补充充电 Proteoliposomes。

1. 融合 SUV 和爱的准备 融合脂合剂的制备 用25-50 毫克/毫升的氯仿 (例如中性 DOPC (12-dioleoyl-锡-磷脂酰 3-卵磷脂), 制备中性、阳离子、阴离子和荧光脂类的溶液, 阳离子乙基-PC (12-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine)、阴离子 POPA (1-棕榈酰-2-油酰锡-磷脂酰-3-磷酸) 和荧光 cholesteryl-Bodipy-FL12 分别) 称量适量的干脂, 并将其溶解在100%氯仿 (小心!在油烟机下这样做), 或者用氯仿稀释商业上可用的氯仿的脂类。注: 天然脂质提取物和纯合成脂都可以使用, 并显示类似的结果。 在玻璃瓶中混合2.5 毫克阳离子和2.5 毫克的中性脂 (1.1.1)。注: 此步骤在氯仿中产生5毫克阳离子脂质混合物, 含阳离子脂的50% 重量分数。需要时, 将荧光脂的0.5% 重量分数添加到混合物中。 将1毫克的阴离子和4毫克的中性脂混合在一个玻璃瓶中, 氯仿储存 (1.1.1)。这给出了5毫克的阴离子脂质混合物, 含有20% 的阴离子脂。 在氮气流下蒸发氯仿, 形成一层薄薄的干脂。 在真空下去除残留氯仿10分钟。注意: 传统上这个步骤需要更长的时间 (1-12 小时), 但我们发现, 较长的处理对 SUV 的耦合性能没有明显的改善。 通过添加0.5 毫升缓冲 A (100 毫米氯化钾) 水合干脂膜, 1 毫米氯化镁2, 50 毫米拖把, pH 值 7.4) 对每瓶和留下他们在室温下站立30分钟, 然后漩涡直到油脂膜完全地分离从玻璃表面和 becomes 均匀的脂质悬浮液。这需要大约20四十年代。 SUV 的形成与挤压的爱情 用两个1毫升注射器组装一个挤出系统 (参见材料表), 使用聚碳酸酯过滤器, 其中有以下孔径: 100 或200毫微米形成 SUV, 400 或800毫微米形成爱。 将脂质悬浮液转移到注射器中。 通过筛选器21次传递该挂载, 如18、19所示。注意: 需要一个奇数的通道, 以尽量减少转移到囊泡溶液的大脂团粘在过滤侧面对原脂悬浮。 将囊泡溶液转化为1.5 毫升离心管。 2. 反式乳化法融合的形成 注意: 此过程在图 2中进行了说明。 油脂油溶液的制备 在1.5 毫升离心管中, 将中性脂类 (2 毫克) 和阴离子脂 (0.5 毫克) 与1毫升的烷混合使用氯仿 (见步 1.1.1)。 将氯仿从混合物中蒸发, 在恒定的混合和加热80摄氏度30分钟保持管打开。关闭管, 让凉爽的室温。 油脂/水缓冲界面脂质单层的形成 在2毫升离心管中放置200µL 的油脂溶液在0.5 毫升缓冲 B (20 毫米氯化钾, 0.1 毫米氯化镁10, 7.4 毫米拖把 pH 1.5) 的顶部。请注意, 由于油与水缓冲器之间的表面张力不匹配 (图 2A), 相分离边界的凸形。 等到相分离边界平坦化, 这预示着它的脂质单层形成。这通常需要 30-60 分钟的室温。 油水乳液的制备 在缓冲 B 中制备水溶性非离子多糖的溶液, 密度高于水密度 (例如15% Ficoll-400 (w/v), 密度1.05 克/毫升)注: 可选的, 你可以添加荧光水溶性染料的缓冲, 以更好地可视化老爹, 和任何其他希望的水含量的 GUVs。 将上述混合物的0.5 µL 转移到一个单独的1.5 毫升离心管中, 并从2.1.2 中µL 100 的油脂溶液。 油脂实验 (44 赫在 14 W) 混合物为三十年代在一个超声波水浴。然后, 大力涡45分钟形成水中油乳剂, 其中每个液滴将被涂上脂质单层 (图 2B)。 水中油乳剂转化为老大的研究 将所合成的乳液放在油/水界面的顶部, 并立即将该管离心在台式离心机上, 以 1万 x g 为2分钟。老大的合成颗粒应该清晰可见 (图 2C)。 冷却管到4°c 在冰箱中, 以巩固油脂在油混合物 (图 2D, 烷固化在18摄氏度以下), 小心地去除冷冻油, 然后提取水相。注: 为便于除油, 采用锚杆形状弯曲的钢丝。 并用重悬在50µL 新鲜的缓冲 B, 转移到一个新鲜的管, 并检查在荧光显微镜下使用100X 油浸泡目标(图 2E)。 3. 用钴-Calcein 法监测囊泡融合 凝胶-过滤重力柱的制备。 浸泡10克的凝胶过滤树脂 (如超细葡 G-50) 在100毫升的去离子水, 让膨胀过夜。 将3毫升的树脂装入一次性塑料重力流柱中, 用超纯水冲洗, 并在室温下与缓冲 C (100 毫米氯化钾、10毫米拖把、pH 值 7.4) 平衡。 准备 suv+或 suv0载有钴 calcein。 准备一个包含1毫米 calcein、1毫米 CoCl2、98毫米氯化钠、10毫米拖把的溶液, 然后将 pH 值降低到7.4。注意: 该方法的本质是自由荧光 calcein 与 Co2 +形成非荧光复合体。它成为荧光再次后, EDTA, 它具有较高的亲和力为 Co2 +, 取代 calcein 从钴 calcein 复合体 (图 3A)。 将此溶液的500µL 加入阳离子或中性脂的干膜, 如1.1 所述。 按照1.2 的描述, 准备100纳米 SUV。 在1毫升的缓冲 C中, 在表顶 ultracentrifuge 和并用重悬中, 用 100万 x g 为20分钟的颗粒挤出 SUV。重复造粒和泥沙三次;使用0.6 毫升的缓冲 C 作为最后泥沙。注意: 这些步骤去除了大部分的外部钴 calcein。 卸下剩余的外部钴 calcein 通过 SUV 通过一个可支配的重力流柱加载与凝胶过滤树脂平衡与缓冲 C 为步骤3.1.2 描述。注: 我们通常丢弃第一毫升的流量, 并收集第二毫升, 其中包含外部钴 calcein 免费 SUV。 用 EDTA 装入的 SUV-的研制 准备溶液的10毫米 EDTA, 80 毫米氯化钠, 10 毫米拖把, pH 值7.4。 将此溶液的500µL 添加到1.1 中所述的阴离子脂干膜中。 按照1.2 的说明, 通过挤压来准备 SUV- 。 颗粒和并用重悬SUV -, 如3.2.4 中所述。 通过将 SUV-通过3.2.5 中所述的凝胶过滤柱, 除去剩余的 EDTA。 为聚变准备 SUV 稀释 suv0, suv+和 suv 与 缓冲 D (1 毫米拖把, pH 7.4) 补充0.2 毫米 CoCl2和预期的氯化钾浓度. 使用每种 SUV 的5µL 每1毫升的缓冲器 D。 将混合物孵化至少1小时。注意: 此步骤将通过阻止与 SUV+的表面绑定的 calcein 来最小化背景荧光级别。 囊泡融合 通过混合1毫升 suv+或 suv0与 1 ml suv− (如上所述的缓冲 D) 在2毫升 fluorimeter 试管, 并监测增加荧光 calcein 使用 480 nm 激发和 510 nm 发射(图 3B)。 等到反应来完成。 加入洗涤剂海卫 X-100 和 EDTA (0.05% 最终浓度和7毫米分别) 的混合物, 释放出囊泡并获得最大荧光信号。 确定被定义为在洗涤剂添加后的最大荧光信号百分比的融合程度, 如图 3C所示。 4. 膜蛋白快速重组成融合 Proteoliposomes 注意: 此过程在图 4A中说明。 用3.1 中描述的凝胶过滤树脂制备重力流柱, 并在室温下平衡。注: 除另有说明外, 所有进一步操作必须严格在≤4°c, 以尽量减少蛋白质活动的损失。 将纯化膜蛋白浓缩至0.7 毫克/毫升, 稀释后用相同的萃取缓冲液分离蛋白质。 混合140µL 的蛋白质与300µL 的预制 SUV, 160 µL 缓冲器 a, 60 µL 10% 胆酸在缓冲区 A;这给一点半蛋白质: 油脂重量比率在最后660µL 容量。 在摇摆平台上轻轻摇动混合物15分钟。注: 以下步骤可在室温下完成。 通过凝胶过滤树脂将混合物通过, 收集含有 proteoliposomes 的混浊馏分。 颗粒 proteoliposomes 与表顶 ultracentrifuge 在 40万 x g 15 分钟。 丢弃含有非重组蛋白的上清液, 并用重悬1毫升的新鲜缓冲 A 中的颗粒。 使用氨基黑色方法20确定 PL 和上清液中的蛋白质含量。 确定重组的产量, 通常是50-70% 左右。注: 步骤 4.6-4.8 可以选择通过通过 PL 解决方案通过毫升的镍 NTA 树脂包装成一个一次性重力柱和洗涤的缓冲区 a, 如3.1.2 所述。这种传递将分离非重组蛋白, 这将优先与树脂, 从 PL, 其中大部分将在流动通过。 5. Proteoliposomes 蛋白质活性的功能测试 注: 本研究中使用的两种蛋白质都是强大的质子泵, 在添加基板 (辅酶 Q1为 bo3氧化酶, 以及 F1fo的 ATP) 时, 将 H+泵入 proteoliposomes, 从而构建一个质子梯度横跨膜 (ΔpH)。在融合成功的情况下, 这种酸化可观察为 pH 敏感探针 ACMA (9-氨基-6-氯-2-Methoxyacridine)12,15的荧光减少 (图 4B-c)。另外蛋白质的基体特定活动 (辅酶 Q1氧化由 bo3-氧化酶22和 ATP 水解由 F1Fo23,24) 可以被监视spectrophotometrically 使用各种方法。在这里, 我们使用 atp 再生检测 (图 4D) 来演示 f1fo PL 的 atp 水解活动, 其中两种酶 (丙酮酸激酶 (PK) 和乳酸脱氢酶 (LDH) 保持 atp 的恒定浓度如下。PK 回收 atp, 将由 f1fo生成的 ADP 返回到 atp, 代价是其基板 phosphoenolpyruvate (PEP)。丙酮酸是这种反应的产物, 以 NADH 为代价, 用乳酸脱氢酶转化成乳酸, 这种氧化可以被监测为降低 340 nm 的光学密度。 化学品的制备 在乙醇中准备1毫米 ACMA 的库存。 在乙醇中准备1毫米尼日利亚菌素 (或任何其他 uncoupler) 的存货。 在乙醇中准备25毫米辅酶 Q1 , 1 米在缓冲器 A 中进行了混合的库存。 准备一股100毫米 ATP 在缓冲 a, 并调整其 pH 值为7.4。 在缓冲器中准备 ATP 再生系统组件的库存 A: 100 毫米 PEP, 1 毫米 NADH, 以及 PK 和 LDH 的溶液浓度为 500-1, 000 单位/毫升。 辅酶 Q1氧化驱动质子抽运的波3-氧化酶 PL 添加20µL 的 PL 到一个 fluorimeter 试管与2毫升缓冲区 a 存在0.5 µM ACMA, 并等待, 直到稳定信号使用 430 nm 励磁和 515 nm 发射。 将40µM 辅酶 Q1添加到试管。 在 PL (图 4B) 中, 启动质子泵浦, 增加2毫米。注: 用数码来减少氧化辅酶 Q1 , 使其可用于 bo3氧化酶。 通过添加2µM uncoupler (例如尼日利亚菌素), 消散形成的ΔpH。ACMA 荧光信号应迅速恢复到几乎原来的水平。注: 如果 uncoupler 在最初的反应混合物中存在, 就不应该有 ACMA 淬火。 ATP 水解驱动质子泵浦的 f1foPL 将 PL 40 µL 添加到 fluorimeter 试管中, 如5.2 所述。 通过向 PL 中添加0.2 毫米 ATP 来启动质子泵浦 (图 4C)。 消散ΔpH 如5.2.4 所述。 由 f1foPL 进行的 ATP 水解及其 uncoupler 的激发 添加40µL 的 PL 到分光光度计试管与2毫升缓冲 a, 包含1毫米 ATP, 0.2 毫米 NADH, 2 毫米 PEP 和15µL 每个 PK 和 LDH。 通过测量 NADH 在 340 nm 的吸光度减少来跟踪反应。3-4 分钟后, 加入2µM uncoupler 试管, 释放ΔpH 对 ATP 水解的背压。反应速度应立即增加。注: 通过镍 NTA 树脂, 如4.10 所述, 将显示最强的刺激由 uncoupler (图 4D, 红色跟踪), 而洗脱液将勉强刺激 (蓝色的痕迹)。 6. 检测脂质环境和离子强度对融合 Proteoliposomes 膜蛋白功能的影响 评估质子泵浦的40µL 的 PL+, pl-和 PL0与 ACMA 淬火试验在2毫升缓冲 D 补充1毫米氯化镁2和 20 (图 5, 面板 A) 或100毫米氯化钾 (面板 B), 如5.2 或5.3 所述 (图 5, 红色, 黑色和蓝色的痕迹)。 保险丝40µL+与同样容量的爱在2毫升的缓冲 D 补充20毫米氯化钾, 并测试 ACMA 淬火 (绿迹). 运行控制实验, 如步骤2中的混合, 例如, PL 和 SUV 的相同电荷 (灰色跟踪)。注: 质子泵浦应通过 postfusion 改善。 7. 融合 Proteoliposomes 将膜蛋白传递给爱和老爹 保险丝50µL+与50µL 800 毫微米爱在1毫升缓冲 D 补充与1毫米氯化镁 2和20毫米氯化钾为5分钟。 将囊泡以 6000 x g 为5分钟, 并丢弃含有反应 PL+的上清液。并用重悬1毫升的缓冲器 D 补充1毫米氯化镁2 和100毫米氯化钾, 并重复造粒和 resuspending 两次。 运行 ACMA 淬火试验, 如5.2 或5.4 所述。 运行控制实验, 如步骤 1-3, 使用补充带电泡的组合在高盐 (200 毫米氯化钾), 非融合泡, 只是空的爱-没有 PL+。注: 只有当互补性带电泡被使用如图 6所示时, 才应检测到 postfusion 的质子泵浦。 8. 从爱和老爹的细胞膜上的单个成分组装电子传输链, 并由这个链的 ATP 生产。 注意: 此过程的示意图在图 7A中说明。本实验产生的 atp 将由荧光素-荧光素酶系统注册, 在那里, 合成的 atp 转化为焦磷酸酯和安培的荧光素酶, 其次是在紫外线注册的光发射。我们建议使用单管紫外线, 而不是较不敏感的微板块 luminometers。 混合3µL 的 bo3-氧化酶 PL+和5µL f1Fo PL+组成, 如第4节所述。 将他们与3µL 的爱或老大- (形成如2节所述) 在800µL 的缓冲 D 补充与20毫米氯化钾和1毫米氯化镁2 5 分钟。 使用高浓度的库存, 添加氯化钾和拖把到100毫米和50毫米最终浓度的 postfusion 膜。注: 在融合后的爱的情况下, 这一步骤将防止其肿胀由于渗透抵消之间的外部 (缓冲区 A) 和 intravesicular (缓冲 D) 盐浓度。 (可选) 将 postfusion 膜按7.2 中所述的颗粒分开反应 SUV+, 并在缓冲区 A 的800µL 中并用重悬颗粒。 准备200µL 的荧光素-荧光素-adp 鸡尾酒, 含有400µM adp, 50 µM 荧光素, 2.5 µg 在缓冲器 a 将鸡尾酒加入 Step8.3 的 postfusion 混合物中。 添加40µM 氧化辅酶 Q1, 并通过增加2毫米的通电来触发 postfusion 膜的波3氧化酶。等1分钟。 通过添加5毫米磷酸钾 (KPi, pH 7.4) 来启动 atp 合成, 并通过紫外线 (图 7B) 检测 atp 生产。运行反应为 ~ 3 分钟。注: ATP 合成反应持续5-7 分钟, 直到缺氧消耗的波3-氧化酶和荧光素素。 将 atp 参考标准 (0.5 nmol atp) 添加到反应混合物两次。测量 ATP 产生。 通过 atp 参考标准信号对 atp 合成反应中的信号进行划分, 获得反应产生的 atp 的实际量。将此值调整为反应中使用的 f1fo的总金额, 最后表示在µmol atp/(mg f1Fo~ min) 中 atp 合成的速率。