신진 대사 매핑: 양적 효소 Cytochemistry 및 Histochemistry Dehydrogenases 세포와 조직에서의 활동을 결정 하

이 프로토콜은 학문적 인 의료 센터의 의료 윤리 검토 위원회의 인간 자료의 사용에 지침을 따릅니다. 1입니다. 세포 또는 조직 단면도의 준비 셀 문화에서 10 mm 페 트리 접시에서에서 37 ° C에서 5 분 동안 0.25 %trypsin-EDTA의 1 mL를 사용 하 여 셀을 trypsinize와 50, 000-200, 000 셀/ml, 셀의 크기에 따라는 37 ° C에에서 셀. 실 온에서 5 분 동안 20 x g에서 cytocentrifuge에 cytospin 퍼 널을 사용 하 여 현미경 슬라이드에 세포 현 탁 액의 200 µ L를 연결 합니다. 실 온에서 24 h cytospins 건조 이 효소 활동을 영향을 주지 않습니다. 5 조직 단면도 환자 또는 윤리적인 허가 따라 동물에서 조직 추출. 조직의 10 m m3 는 여러 실험에 대 한 충분 합니다. 직물의 조각을 작은 발명된 2 mL 플라스틱 튜브에 넣고 스냅-동결 액체 질소에 조직의 조각을 포함 하는 튜브. −80 ° C에서 조직 조각을 추가 처리까지 포함 된 튜브를 저장 합니다. 사용 하 여 최적의 절삭 온도 (10 월) 라고 하는 젤 같은 매체 물 결정을 형성할 수 없습니다 있도록 조직 샘플-20 ° c-25 ° C를 급속 하 게, 정지 척에 탑재. 절단 및 처음 트림 원하는 수준으로 블록을 cryostat 사용 (이상적으로 현미경의 절반 폭 유리 슬라이드, 예를 들면 5 x 5 mm). 단면, 시 브러시와 안티 롤 접시 위쪽으로 컬에서 섹션을 사용 합니다. 느리지만 지속적인 속도로 6-10 µ m 두께 섹션으로 조직 샘플을 잘라 (1 섹션 당 s). 섹션은 제대로 잘라, 안티 롤 접시 아래 톰 칼에 남아 있다. 마이크로 유리 슬라이드에 1-3 섹션을 선택 하 고 사용까지 −80 ° C에 저장. 준비 섹션의 수는 조직 샘플의 크기와 섹션의 원하는 두께에 따라 달라 집니다. 2. 효소 조직/Cytochemistry 성 Dehydrogenases 반응 버퍼를 준비. 올바른 pH의 인산 염 버퍼의 100 mL를 준비 ( 표 1; 참조 모든 효소는에서 그것의 활동은 최고 최적의 pH). 예를 들어 올바른 ph 버퍼 때까지 0.1 m M KH2포4 (산 성)과 0.1 m M 나2HPO4 (기본)의 솔루션을 혼합. PVA는 먼지와 독성 증기 두건에서 인산 염 버퍼에 폴 리 비닐 알코올 (PVA)의 18 g를 무게. 18 %w / v PVA 100 ° C에서 인산 염 버퍼에서 버퍼 온난 하 여 분해 au 베인 마리 (끓는 물에 넣어 유리 병)과 PVA 완전히 녹아 때까지 저 어. 솔루션은 교 반에 의해 발생 하는 작은 기포와 함께 다음, 투명 한 될 것입니다. 그것은 일반적으로 ~ 15 분 해산 PVA에 대 한 필요 합니다.참고: 18 %w / v PVA 인산 염 버퍼에 점성 이며 15 mL 반응 버퍼 튜브 넓은 피 펫을 사용 하 여 전송할 수 있습니다. 18 %w / v PVA 인산 염 버퍼에서의 단기 저장 ≥ ≥40 ° C 및 장기 저장 (최대 2 주)에서 발생 한다 60 ° c. 18 %w / v PVA 인산 염 버퍼에서의 250 µ L는 500 µ L은 조직 섹션 필요한 cytospin 준비에 대 한 일반적으로 필요 합니다. Tetrazolium 소금 (nitroBT) 솔루션을 준비 합니다. 인큐베이션 매체의 모든 1 mL, nitroBT 솔루션의 40 µ L가 필요, 20 µ L dimethylformamide (DMF)의 혼합에 녹아 있는 nitroBT (노란 분말)의 5 밀리 그램의 구성 및 20 µ L의 에탄올, 밝은 노란색 투명 한 솔루션 것입니다.참고: nitroBT의 안정성은 모든 필요한 시 약의 가장 낮은, 그것 것이 좋습니다 마지막 nitroBT 재고 솔루션을 준비 하 여 먼저 반응 매체에 있는 nitroBT를 분해. DMF에 에탄올 nitroBT 유리 유리병에 시간의 짧은 기간 동안 그것을 열 하 여 분해 (~ 10 s) 분 젠 버너를 사용 하 여. 가 열 하는 동안 유리병을 흔들어 하 고 증발을 방지 하기 위해 불꽃에 너무 오래 유리병을 두지 마십시오. 10% 추가 nitroBT 솔루션 녹이는 과정 DMF와 에탄올의 증발 수 있도록. 방패 전자 캐리어 phenazine methosulfate (PMS) 또는 (1-methoxy)-유리 저장 병 주위 은박지 포장 하 여 직접적인 빛에서 m(PMS)를 포함 하는 phenazine methosulfate (Mpm), 및 부 화 미디어. 증 류 된 H2o.에서에서 그들을 용 해 하 여 표 1 에 따라 시 약 솔루션을 준비 일부 시 약 빠르게 멸망, 그래서 가능한 실험 직전으로 그들을 준비 합니다. 까지 사용 시 솔루션 또는 얼음에 4 ° C에서 유지. 표 1 에서 같이 부 화 미디어를 준비 하 고 부드러운 교 반으로 각 단계 후 솔루션을 균질. 지속적으로 교 반 하 고 교 반 하면서 인큐베이션 매체의 표면 아래 주걱을 유지 하 여 인큐베이션 매체에 있는 기포의 생성을 하지 마십시오. 조직 섹션에 인큐베이션 매체 적용 미리 따뜻한 현미경 cytospins와 슬라이드 또는 조직 단면도 15 분 대 한 immunohistochemistry 보육 실에서 37 ° C에 연결 된 잠수함에서 일정 한 온도 유지 하기 위해 따뜻한 물으로 immunohistochemistry 인큐베이션 챔버의 하단은 인큐베이터입니다. 조심 스럽게 나 넓은 부분에는 좁은에서 전환에서 파스퇴르 펫을 보았다. 정기적인 파스퇴르 펫 너무 좁은 게 파스퇴르 인큐베이션 매체의 열망에 대 한 충분히 넓은 펫이이 단계 필요 그래서 점성 인큐베이션 매체를 발음 하는. 250-500 µ L 적절 한 인큐베이션 매체의 각 셀 준비 또는 조직 섹션 파스퇴르 피 펫의 넓은 부분을 사용 하 여 현미경 슬라이드에 적용 됩니다. 피 펫 팁을 사용 하 여 외피 중간에 밖으로 균등 하 게 확산. 이러한 표면에 플 로트 것입니다 때문에 현미경 슬라이드에 세포 준비 또는 조직 섹션에서 효소 반응 간섭 하지 것입니다 인큐베이션 매체에 작은 기포를 무시. 효소 반응 속도 론 및 특정 셀 준비에 그 표현에 따라 미리 지정 된 기간에 대 한 셀 준비 또는 조직 섹션 (예: 조직 문화 인큐베이터)는 37 ° C 배양 기에서 현미경 슬라이드에 품 어 또는 조직 (표 1)입니다. 밖으로 건조에서 반응 버퍼를 방지 하기 위해 습 한 환경을 유지 하기 위하여 폐쇄 immunohistochemistry 보육 실의 뚜껑을 유지. 현미경 슬라이드를 세척 조직에 초과 인큐베이션 매체에서 누릅니다. 기계적으로 60 ° C 인산 염 버퍼, 버퍼에 현미경 슬라이드를 아래로 이동 하 여 pH 5.3, 현미경 슬라이드에서 인큐베이션 매체에서 씻어. 이 효소 반응을 중지합니다. 60 ° C 인산 염 버퍼, pH 5.3 20 분에에서 그들을 유지 하 여 현미경 슬라이드를 씻어. 60 ° C 수돗물에 현미경 슬라이드를 기계적으로 세척. 20 분 동안 60 ° C 수돗물에 그들을 유지 하 여 현미경 슬라이드를 씻어. 물 하 고 슬라이드 아래로 천천히 1 분 동안 60 ° C 수돗물으로 상 온 수돗물을 혼합 하 여 냉각. 실 온 소 주 물에는 최종 기계적 세척 단계를 수행 합니다. 얼룩진된 Cytospins 또는 조직 단면도 현미경 슬라이드에 포함 전 슬라이드 50-60 ° c.에서 따뜻한 따뜻한 신중 하 게 종이 타월을 사용 하 여 현미경 슬라이드의 뒷면을 건조 하 고 따뜻한 현미경 슬라이드의 상단 측면을 건조 하는 슬라이드에 배치. 슬라이드는 건조, 셀 준비 또는 글리세롤 젤리 장착 매체 및 coverslips를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 조직 단면도 묶습니다. 4 ° C에서 냉장고에 어둠 속에서 셀 준비 또는 조직 섹션 현미경 슬라이드를 저장 하거나 즉시 이미지 수집을 진행 합니다. 3. 이미지 수집 이미지를 기록 (적어도 8 비트 하지만 선호 10-비트 또는 12 비트), 충분 한 다이나믹 범위와 과학적인 흑백 CCD 카메라 고정 이득 그리고 선형 응답. (Cytospins 위한 X-63 X 20)와 10-63 X 조직 섹션에 대 한 적절 한 목표를 선택 합니다. 보기 보다 약간 더 큰 있도록 필드 다이어 프 램을 좁혀서 눈부심을 줄일 수 있습니다. 적외선 차단 함께에서 formazan 촉진7 의 isobestic 파장 근처 10 nm 넓은 대역 유추 필터를 적용 하 여 단색 광 필터 ( 자료 표참조)를 사용 합니다.참고: nitroBT의 최대 isobestic 흡 광도 585 nm. 조명 카메라의 전체 회색 레벨 범위 사용 되도록 최적화 (즉, 조명 수준을 설정 최대 조명-빈 현미경 슬라이드를 기록할 때를 노출 하지 않고 달성 된다 그래야). 알려진된 흡 광도 (또는 광학 밀도 [OD]) 측정된 회색 레벨 값을 보정. 이 위해 교정 슬라이드 또는 단계의 적어도 10 가지 단계 그레이 스케일 이미지를 캡처 중 상용 (참조 자료 테이블) 알려진 OD 값 (4.1.1 단계 참조), 태블릿 또는로 주문 품 그레이 스케일 쐐기 단계 태블릿을 측정 한 densitophotometer와 보정 결과 측정 사용 회색 알려진된 흡 광도 값을 값. 셀의 photomicrographs 또는 관심의 조직 단면도 캡처하십시오. 4. 이미지 분석 이미지 분석, 전에 흡 광도 측정 ImageJ 소프트웨어 보정. 알려진 OD 값 보정 슬라이드 또는 단계 태블릿 매개 변수 알려진된 흡 광도 10 교정 분야의 photomicrographs의 흡 광도 (OD)를 측정 합니다. ImageJ에서 선택된 영역을 측정 하는 분석 → 측정 메뉴 또는 Ctrl + M 단축키를 사용 합니다. 분석 하 여 흡 광도 보정 절차를 시작 → 교정. 함수 “Rodbard (NIH 이미지)”를 선택 하십시오. 열리는 창의 왼쪽된 열에서 보정 슬라이드/단계 태블릿 4.1.1에서 수행의 각 단계에서 회색 레벨 측정의 결과 이미 존재. 그렇지 않다면 ImageJ 결과 화면에서 그들을 복사. 오른쪽 열에서 보정된 단계 정제와 함께 인증서에 인쇄 각 해당 알려진된 흡 광도 값을 입력 합니다. 상자 “글로벌 교정” 및 “보기 음모” 똑 딱 거리 십시오 하 고 “확인”을 누릅니다. 품질 관리에 대 한 확인 R2 의 Rodbard 함수는 > 0.99. 만약 그것이 < 0.99, 확인 여부 교정 슬라이드 촬영 되었고 정확 하 게 측정 여부 알려진된 흡 광도 매개 변수가 올바르게 입력 했다. ImageJ는 지금 프로그램을 닫을 때까지 교정 (따라서 “글로벌 교정”). 흡 광도 측정에 대 한 보정된 ImageJ 세션 항상 변환 관찰된 흡 광도 여기서 0 0과 1 사이의 값을 의미 하 고 1 0의 점근 이며 전체 흡 광도, 각각. Cytospins, 선택 > 임의의 방식으로 100 단일 셀. 조직 섹션에 대 한 모든 섹션에 고정된 길이 너비의 관심의 하나 이상의 필드를 선택 합니다. 프로젝트 편견된 셀 선택에 도움을 photomicrographs 통해 래스터. ImageJ, 플러그인 → 분석 → 그리드 메뉴를 통해 이미지 위에 격자 프로젝트. ImageJ에서 타원형 도구를 사용 하 여 단일 셀을 선택 하 고 사각형 도구를 사용 하 여 조직 영역을 선택 합니다. 흡 광도 조직 지역 또는 선택 된 셀의 영역을 측정 합니다. 광학 밀도 지역 “의미” 라고 하며 “지역”는 ImageJ 결과 스프레드시트, 각각.참고: 셀 또는 조직 영역 (만약 당신이 다른 크기를 가진 여러 조직 지역 선택)의 총 흡수도 모든 분리 된 픽셀 absorbances의 합과 같습니다. 셀은 1000 픽셀로 몇 군데, 총 흡수도 1000 absorbances의 합계에 의해 주어진 다 고 평균 흡 광도 전체 흡 광도/1000에 의해 주어진 다. 이 절차는 또한 분포 오류를 방지합니다. 결정의 평균 총 흡 광도 > 30 셀 또는 공동 인자 존재 하지만 기판의 부재에서 인큐베이션 매체 제어에 노출 되었다 샘플을 포함 하는 컨트롤 슬라이드에서 조직 지역. 이 제어 흡 광도 비 특정 효소 활동 얼룩에 대 한 제어를 사용 하 고 흡 광도 유물 매체, 커버 슬립 또는 현미경 장착 사용된 현미경 슬라이드에 의해 유도 된. 공동 인자 (하지만 기판 억제제의 다른 농도)의 동일한 농도로 인큐베이션 매체에 노출 된 샘플의 모든 총 흡 광도 측정에서 평균 제어 흡 광도를 뺍니다. 이것은 세포 또는 조직 영역의 수정된 총 흡수도 준다. 통계적으로 평균 수정된 총 absorbances 학생의 T 시험 또는 실험 설계에 따라 단방향 ANOVA 테스트를 사용 하 여 비교 합니다. Formazan의 흡 광도 효소 활동 (mL 당 분 당 µmol 변환 기판) 사용 하 여 변환할 수 있는 램버트-맥주의 법칙: c=A/(є×d), 여기서 c는 반응 매체에서 formazan의 농도, A는 교정; 후 ImageJ에서 측정 된 흡 광도 우크라이나는 formazan의 소멸 계수 (585에서 16.000 nm)8 , d는 평균 셀 두께 또는 공칭 단면 절단 두께 (6-10 µ m이 프로토콜에서)가 거리를 여행 하는 빛.참고: 건조 후, 조직 섹션 두께 감소 공칭 단면 절단 두께에서 50% 그러나 공칭 단면 절단 두께 생물학적으로 가장 관련성이 높은 있기 때문에이 위에 계산에 반영 되지. 평균 셀 간격 및 셀 preparates 현미경 유리 슬라이드에 준수의 영역 크기는 confocal 현미경 검사 법 또는 넓은 필드 현미경 검사 법, 어떤 프로토콜 찾을 수 있습니다 다른 곳을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 9 , 10