Embriyonik maruz kalma düşük doz Toxicants uzun vadeli davranış ve üreme sonuçları

Aşağıda verilen iletişim kuralları etkileri BPA maruz kalma sırasında erken embriyogenez test etmek için standart ve bit/sn, BPF veya diğer EDCs ve toxicants C. elegans embriyo üzerinde kullanılmak üzere değiştirilebilir. 1. malzeme Kur Yuvarlak solucanlar büyüme medya (NGM)18 medya 500 mL 1,5 gr NaCl, pepton 1,25 g ve 8,5 gram agar 500 ml suda çözülerek hazırlayın. (121 ° C, 15 PSI, 20 dk) ısıyla sonra kolesterol (5 mg/mL etanol), 0,5 mL 1 M MgSO4, 0.5 mL 1 M CaCl2 ve 1 M potasyum fosfat tampon, pH 7,4 (108.3 g KH2PO4 12,5 mL 0.5 mL ekleyin. K2HPO4, su 1 M’ye 35,6 g). Hipoklorit çözüm 1 N KOH 25 mL, çamaşır suyu 4 mL ve 71 mL su karıştırılarak hazır olun. Bu çözüm taze olun. M9 arabellek karıştırma KH2PO43 g, 6 g Na2HPO4, 5 gr NaCl, 5 mL su 1 M’ye ve MgSO41 m hazırlayın S arabellek18 0,02 M K2HPO4129 mL, KH2PO4871 mL ve NaCl 5.85 g karıştırarak hazırlayın. M9 ve S arabellekleri tarafından ısıyla sterilize. Bir gecede kültür Escherichia coli (OP 50 zorlanma) 20 ml Luria suyu (LB) büyümek. BPA 1 mM hisse senedi çözüm yapmak için % 10 etanol geçiyoruz. Sonraki dilutions 0,1 µM, 0.5 µM, 1 µM, 5 mikron ve 10 µM S arabellekte olun.Not: Seyreltme sulu S arabellek etanol konsantrasyonu büyük ölçüde azaltır; Örneğin, bu Protokolü (10 µM) açıklanan en BPA yoğun etanol konsantrasyonu % 0,1 v/v olduğunu. 2. C. elegans Culturing ve eşitleme NGM medya (yaklaşık 25 mL/plaka) 100 mm kalıplara dökmek ve kuvvetlendirmek sağlar. Bir kez katılaşmış, tabakları E. coli OP50 gecede yetiştirilen sıvı kültüründen 150 µL yayarak tohum. Tabak 37 ° C’de gecede kuluçkaya. Ertesi gün, yaklaşık bir levha 1 cm karelik parçalama tarafından N2 solucanlar yeni plakalar üzerine aktarın. Solucanlar plaka görünür embriyo içeren iyi beslenmiş olgun yetişkin ile doldurulur kadar 20 ° C’de 3 gün boyunca büyümeye izin. Eşitlemek için her plaka plaka arasında en fazla 5 mL M9 arabelleği pipetting tarafından yıkayın. Sıvı bir steril 15 mL konik santrifüj tüpü aktarın.Not: Eşitleme yetişkin solucanlar öldürmek ve nispeten aynı sahne olan embriyo toplamak için yapılır. Oda sıcaklığında 4 dk 3000 x g de yetişkin solucanlar gevşek bir Pelet elde etmek için santrifüj kapasitesi. 10 mL pipet kullanarak, pelet olduğu gibi bırakmak böylece süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın. 5 mL hipoklorit çözeltisi ekleyin ve karışımı yavaşça. 3000 x g oda sıcaklığında de 4 dakika santrifüj kapasitesi. 10 mL pipet ile süpernatant kaldırmak ve M9 arabellek 7 mL ile yıkayın. Bu iki kez tekrarlayın. 3. solucanlar için BPA maruz Yukarıda adım 2.7 gelen son yıkama sonra yumurta M9 arabelleği ile yaklaşık 100 µL askıya alma. Yaklaşık 50 µL yumurta 2 mL microfuge tüpler zaten BPA S arabellekte seyreltilmiş uygun konsantrasyon içeren aktarın. BPA (0.0 µM, 0,1 µM, 0.5 µM, 1.0 µM, 5.0 µM ve 10 µM) doğru son konsantrasyonu tüp ücret sağlamak için S-arabellek miktarını belirleyin. Tablo 1 bir yolu bu dilutions göstermektedir. Son BPA konsantrasyon için Stok BPA (100 mikron) S arabellek Eşitlenmiş solucanlar 0,1 MİKRON 1 μL 949 μL 50 μL 0,5 MİKRON 5 μL 945 μL 50 μL 1 MİKRON 10 μL 940 μL 50 μL 5 MİKRON 50 μL 900 μL 50 μL 10 MİKRON 100 μL 850 μL 50 μL Tablo 1: Hisse senedi BPA, S arabellek ve senkronize solucanlar çalışmamız için kullanılan istenen konsantrasyonları ulaşmak için kullanılan. Bir shaker tüpler yerleştirin ve nazikçe 20 ° C’de, döner bir shaker için 25 rpm ya da sallanan bir shaker 25 Eğer/dk’ya 4 h için sallamak. 4 h sonra tüpler tüp sahipleri yerleştirin ve solucanlar yerleşmek sağlar. Süpernatant atın ve solucanlar numaralı seribaşı Tabaklar (NGM tabaklar OP50 E. coliile) aktarın. Sıvı OP50 E. coli kültür 1,5 belirtildiği gibi yapmak ve tabakları 2.1 belirtildiği gibi temel olarak belirler. 20 ° c 60 h için büyümek solucanlar izin Levhalar her gün kirlenme için inceleyin. Kirlenmiş NGM tabak genellikle renksiz ve bireysel koloniler tarafından eşlik etti. Aşırı kalabalık için mikroskop altında onay solucanlar. OP50 E. coli çim ve küçük spot renkleri de konsantre solucan eksikliği aşırı kalabalık anlamına gelir. 4. ön Touch Habituation tahlil Yaklaşık 10 eşzamanlı genç yetişkin solucanlar için bir yangın sterilize 30 G Platin tel kullanarak yeni seribaşı NGM plakaları almak aktarın. Solucanlar onlara izin vermek 5 min için rahatsız bekletin yeni plaka parkenizin vakti. Habituation yanıt için bir tahta şiş veya kürdan sonu iliştirilmiş bir kaş saç kullanın ve % 70 etanol daldırma tarafından sterilize. Temiz havsız bir doku ile silin ve etanol kapalı buharlaşır için 1 dk bekleyin. Solucan (faringeal ampul anterior) kafasına hafifçe dokun kaş saç kullanarak. 10 izin dokunuşlar, tekrar s arasında solucan kurtarmak izin vermek için dokunur. (10 s interstimulus aralıkları izin verir) solucan artık geriye doğru taşır kadar dokunmaya devam edin. Bu noktada, solucan için uyarıcı habituated. Solucan alıştırmak gerekli dokunuşlar kaydedin. Tek yönlü ANOVA Tukey’nın öğleden hoc testi ile takip kullanarak tedavi ve tedavi edilmezse denetimlerini ortalama habituation oranları arasındaki fark analiz. 5. solucan verimlilik tahlil Bireysel L3 solucanlar bir taze ve numaralı seribaşı tabak Platin bir pick kullanarak aktarın. O sadece bir solucan plaka yerleştirildiğinden emin olun.Not: L3 larva aşamadan sonra solucanlar geliştirmek L4 larva sahne ve yetişkinlik. Onlar zaten kadar hangi başka türlü-sayıma özledim herhangi bir yumurta bırakırlar değil sağlarken bireysel hayvanlar transferi için yeterince büyük onları erken seçmek uygun olmamasıdır. Her 12-24 h koydu yumurta sayıları saymak. Sayım sonra üst solucan yeni bir tabağa aktarın. Solucan yumurtaları, genellikle 5 gün sonra durana kadar tekrar ne zaman 20 ° C’de inkübeNot: ortalama 300 yumurta bir vahşi türü solucan düzenleyebilirsiniz; Bu nedenle, üst yeni bir tabak için günlük aktarma aşırı kalabalık engeller. Tek yönlü ANOVA Tukey’nın öğleden hoc testi ile takip kullanarak tedavi ve tedavi edilmezse denetimleri barındırmanın yumurta ortalama sayısı arasındaki farkı analiz.