Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Mahlet D. Mersha; Karla R. Sanchez; Murali K. Temburni; Harbinder S. Dhillon

doi:10.3791/56771

JoVE Journal > Developmental Biology

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Gelişim Biyolojisi

Conséquences à long terme de comportements et reproduction d’exposition embryonnaire à faible dose des substances toxiques

Published: March 06, 2018

doi:

10.3791/56771

Mahlet D. Mersha¹, Karla R. Sanchez², Murali K. Temburni², Harbinder S. Dhillon²

¹Department of Neurology,Johns Hopkins School of Medicine, ²Department of Biological Sciences,Delaware State University

Özet

Exposition aux substances toxiques environnementaux peut influer aiguë de développement avec des effets à long terme. Des protocoles détaillés sont fournis pour illustrer une stratégie utilisant un modèle de laboratoire efficace pour étudier l’effet de l’exposition embryonnaire précoce au bisphénol A. Nous fournissons la fécondité et tests comportements pour contrôler l’efficacité de nos produits toxiques exposition bio-essais.

Abstract

Bisphénols, comme le bisphénol A (BPA) et le bisphénol S (BPS) sont polymérisant agents largement utilisés dans la production de plastiques et de nombreux produits d’usage quotidien. Selon leur structure chimique et estradiol-comme des propriétés biologiques, ils ont été classés comme composés (EDC) de perturbation endocrinienne. Une exposition prolongée aux perturbateurs endocriniens, même à faibles doses, a été liée à divers défauts de santé dont le cancer, des troubles du comportement et infertilité, avec une plus grande vulnérabilité a indiqué au cours de périodes de développement précoces. Études moléculaires et cellulaires avec le modèle génétiquement tractable nématode Caenorhabditis elegans ont démontré que l’exposition au BPA provoque l’apoptose, létalité embryonnaire et la perturbation dans l’ADN des mécanismes de réparation. Nous avons déjà rapporté que l’exposition des embryons de c. elegans aux faibles doses de différentes bisphénols diminue la fécondité. En outre, nous avons montré que les effets de l’exposition pendant les tout premiers stades de développement persistent à l’âge adulte comme dosés en quantifiant le comportement de l’habituation, une forme d’apprentissage non associatif. Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour l’exposition embryonnaire à faible dose CDE ainsi que la fécondité associée et antérieur touchent tests d’accoutumance, ainsi que des résultats représentatifs.

Introduction

Exposition aux substances toxiques environnementaux, composés en particulier ceux qui ont tendance à interférer avec le développement, a été sous l’examen minutieux scientifique ces dernières années. Plus de mille produits chimiques dans l’usage quotidien sont classés comme composés (EDC)¹de perturbation endocrinienne. Périodes de croissance rapide et le développement, incluent embryonnaires, infantile et stade de la petite enfance, ont été notées pour être particulièrement vulnérables aux effets délétères à faible dose même EDC. Leurs effets ont démontré que causer de troubles de la reproduction et du développement neurologique². Selon les directives de panneau US Environmental Protection Agency et U.S. National Toxicology Program, une faible dose peut être définie comme n’importe quelle dose au-dessous du niveau de celui qui a été signalé pour provoquer un changement biologique observable ou endommager les³. En plus d’effets à faible dose de perturbateurs endocriniens individuels, mélanges de différents perturbateurs endocriniens présentes en faibles concentrations dans l’environnement ont le potentiel de causer des effets cumulatifs fond⁴.

Le bisphénol A (BPA ou 4,4′-(propane-2,2-diyl)) est un agent de polymérisation dans des articles couramment utilisés tels que des bouteilles d’eau, magasin reçus, scellements de sillons et les garnitures de boisson et⁵boîtes à conserves alimentaires. En raison de sa ressemblance structurale avec 17 β Estradiol (E₂) et son affinité pour les récepteurs des œstrogènes ERα et REβ, BPA a été classé comme un endocriniens chimiques (EDC)⁵^,⁶. Bien que plus faible, affinité du BPA aux récepteurs de œstrogène s’est avérée d’affectent le système de reproduction des deux sexes et de perturber les fonctions neuronales à des doses qui sont considérés comme sûrs⁷^,⁸. Ont observé des changements dans la méthylation de l’ADN par l’intermédiaire de mécanismes épigénétiques réglementés provoque défauts neuronales à long terme chez les souris exposées au BPA⁹. Plus précisément, BPA a également été impliquée comme un coupable possible pour des taux accrus d’hyperactivité, déficit d’attention et une sensibilité accrue aux médicaments en raison de l’augmentation vu en D1 des récepteurs de dopamine dans le cerveau limbique souris après une exposition chronique ⁹ ^, ¹⁰. des éléments de preuve importants sur les effets délétères des perturbateurs endocriniens sur la santé humaine est basée sur des études de corrélation portant principalement sur l’exposition chronique des populations à l’environnementales substances toxiques même à faible dose⁵; Toutefois, des limites dans les conclusions des études chez l’homme et en manipulant les contrôles expérimentaux ont été acceptés tout en tenant compte des critiques infondées hype¹¹^,¹².

Due à la conservation des gènes de Caenorhabditis elegans en ce qui concerne les mammifères, y compris ses gènes de récepteur de l’hormone stéroïde, les chercheurs ont utilisé ce modèle lab génétiquement tractable pour démêler les effets fonctionnels et mécanistes de la REE ¹³. les expériences avec le c. elegans ont montré que ces composés tels que le BPA et BPS peuvent provoquer l’apoptose, la létalité embryonnaire, la perturbation dans les mécanismes de réparation de pause ADN double-brin et fonction neurale¹⁴^,¹⁵ ^,,¹⁶.

Notre laboratoire a déjà montré que l’exposition même faible dose limitée au début de l’embryogenèse mène à la fécondité baisse avec des déficits comportementaux dans les survivants adultes¹⁵. Accoutumance à un stimulus répété est une forme d’apprentissage non associatif dans des systèmes modèles, y compris c. elegans, et notre méthodologie utilise cette forme d’apprentissage non associatif comme une sortie comportementale pour doser les effets à long terme de l’exposition embryonnaire à les substances toxiques¹⁷ plus précisément, nous fournissons des protocoles détaillés pour l’étude d’exposition au BPA sur c. elegans, y compris ses effets immédiats sur la létalité embryonnaire et les effets à long terme sur le comportement adult, avec un schéma global représenté dans Figure 1. Des résultats représentatifs de la fécondité et l’apprentissage associatif non – tests sont fournis pour mettre en évidence l’efficacité de notre méthodologie.

Protocol

Protocoles donnés ci-dessous ont été normalisés pour tester les effets de l’exposition au BPA durant l’embryogenèse précoce et peuvent être modifiées pour une utilisation avec BPS, BPF ou autres perturbateurs endocriniens et des substances toxiques sur les embryons de c. elegans . 1. matériau installation Préparer 500 mL de médias18 nématode croissance Media (NGM) en dissolvant 1,5 g de NaCl, 1,25 g de peptone et 8,5 g d’agar dans de l’eau de 500 mL. Après autoclavage (121 ° C, pression de 15 PSI, 20 min), ajouter 0,5 mL de cholestérol (5 mg/mL dans de l’éthanol), 0,5 mL de 1 M MgSO4, 0,5 mL de 1 M CaCl2 et 12,5 mL de tampon de 1 M potassium phosphate, pH 7,4 (108,3 g de KH2PO4 35,6 g K2HPO4, l’eau à 1 L). Préparer la solution d’hypochlorite en mélangeant 25 mL de 1 N KOH, 4 mL d’eau de Javel et 71 mL d’eau. Faire cette solution fraîche. Préparer M9 tampon en mélangeant 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl, 5 mL de 1 M de MgSO4et l’eau à 1 L. Préparer S tampon18 en mélangeant 129 mL de 0,02 M K2HPO4871 mL de KH2PO4et 5,85 g de NaCl. Stériliser les tampons M9 et S à l’autoclave. Développer une culture d’une nuit d’Escherichia coli (souche OP 50) dans 20 mL de Luria bouillon (LB). Dissoudre le BPA dans les 10 % d’éthanol pour faire une solution mère de 1 mM. Préparer des dilutions subséquentes de 0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM et 10 µM dans un tampon S.NOTE : Dilution dans la solution aqueuse tampon S réduit considérablement la concentration d’éthanol ; par exemple, à la plus forte concentration de BPA décrite dans ce protocole (10 µM), la concentration d’éthanol est 0,1 % v/v. 2. c. elegans Culturing et synchronisation Verser les médias NGM en plaques de 100 mm (environ 25 mL/plaque) et laisser se solidifier. Une fois solidifié, graines les assiettes en répartissant 150 µL d’e. coli OP50 de la culture liquide augmentée pendant la nuit. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit. Le lendemain, transfert vers N2 sur les nouvelles plaques de segmentation une dalle approximative de 1 cm carré. Permettre vers de croître pendant 3 jours à 20 ° C jusqu’à ce que la plaque est remplie avec des adultes bien nourris contenant des embryons visibles. Pour synchroniser, laver chaque plaque de pipetage à 5 mL de tampon de M9 dans l’ensemble de la plaque. Transférer le liquide dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 mL.Remarque : La synchronisation est faite pour tuer les vers adultes et collectionner des embryons qui sont relativement la même scène. Centrifuger à 3 000 x g pendant 4 min à température ambiante afin d’obtenir une boulette de lâche de vers adultes. À l’aide d’une pipette 10 mL, retirez soigneusement le surnageant afin de laisser le culot intact. Ajouter 5 mL de la solution d’hypochlorite et mélanger doucement. Centrifuger à 3 000 g à la température ambiante pendant 4 minutes. Retirer le liquide surnageant avec une pipette de 10 mL et laver avec 7 mL de tampon de M9. Répéter cette étape deux fois. 3. exposer Worms au BPA Après le dernier lavage de l’étape 2.7 ci-dessus, suspendre environ 100 µL d’oeufs avec le tampon de M9. Transférer environ 50 µL d’oeufs dans des microtubes de 2 mL contenant déjà la concentration appropriée que BPA dilué dans un tampon S. Ajuster la quantité de S-tampon afin d’assurer la bonne concentration finale du BPA (µM 0,0 0,1 µM, 0,5 µM, 1,0 µM, 5,0 µM et 10 µM) par tube. Le tableau 1 illustre un moyen de rendre ces dilutions. Pour la Concentration de BPA Final Stock de BPA (100 μM) Tampon de S Synchronisées vers 0.1 ΜM 1 ΜL 949 ΜL 50 ΜL 0,5 ΜM 5 ΜL 945 ΜL 50 ΜL 1 ΜM 10 ΜL 940 ΜL 50 ΜL 5 ΜM 50 ΜL ΜL 900 50 ΜL 10 ΜM 100 ΜL ΜL 850 50 ΜL Tableau 1 : Stock BPA, tampon S et synchronisés vers utilisés pour atteindre les concentrations désirées utilisées pour notre étude. Placer les tubes sur un shaker et agiter doucement pendant 4 heures à 20° C, à 25 tr/min pour un agitateur rotatif ou 25 s’incline/min pour un agitateur basculant. Après 4 h, placer les tubes dans le porte-tube et laisser les vers de s’installer. Jeter le surnageant et transférer vers ensemencés plaques NGM avec OP50 e. coli. Rendre le milieu de culture liquide OP50 e. coli comme indiqué dans la 1.5 et les plaques des graines comme indiqué en 2.1. Laissez les vers à pousser pendant 60 heures à 20 ° C. Examiner les plaques tous les jours pour la contamination. Contaminés NGM plaques sont habituellement décolorées et accompagnés par les colonies individuelles. Vérifier vers sous le microscope de surpeuplement. Un manque de pelouse OP50 e. coli et concentré vers de petites taches signifient la surpopulation. 4. antérieure Touch accoutumance Assay Transférer environ 10 jeunes synchronisées vers adultes de nouvelles plaques NGM non ensemencées en utilisant un fil de 30 G de platine stérilisée par feu pick. Laisser les vers pendant 5 min pour leur permettre de temps pour s’acclimater à la nouvelle plaque. Pour la réponse de l’habituation, utilisez un poil de sourcil attaché à l’extrémité d’une brochette en bois ou cure-dents et stériliser par immersion dans l’éthanol à 70 %. Essuyer avec un chiffon propre non pelucheux et attendre 1 min pour l’éthanol à évaporer. Touchez légèrement le ver sur la tête (partie antérieure de l’ampoule du pharynx) en utilisant les poils des sourcils. Répétez la touche, ce qui permet de 10 s entre touches afin de permettre le ver récupérer. Continuer à toucher (permettant des intervalles interstimulus s 10) jusqu’à ce que le ver ne bouge plus en arrière. À ce stade, le ver a habitués à la stimulation. Noter le nombre de touches nécessaires pour le ver à s’habituer. Analyser la différence entre les taux d’accoutumance moyenne des commandes traitées et non traitées à l’aide d’ANOVA à suivie les post-hoc test de Tukey. 5. test de fécondité ver Transfert individuel L3 vers à un plat frais et boutonnée à l’aide d’une pioche de platine. Veillez à que ce qu’un ver est placé par plaque.Remarque : après le stade larvaire de L3, les vers se développent en L4 stade larvaire et l’âge adulte. Il est commode de ramasser au début car ils sont assez grands pour le transfert d’animaux tout en s’assurant qu’ils n’ont pas déjà jeté des œufs qui, autrement, seraient incomprises dans le comptage. Compter le nombre de œufs pondus tous les 12 à 24 h. Après avoir compté, transférer le ver parent à une nouvelle plaque. Répétez jusqu’à ce que le ver s’arrête aux oeufs, en général après 5 jours incubés à 20 ° C.Remarque : en moyenne, un ver de type sauvage peut pondre jusqu’à 300 œufs ; dès lors, transférant le parent à une nouvelle plaque quotidiennement n’empêche la surpopulation. Analyser la différence entre le nombre moyen de œufs pondus par les commandes traitées et non traitées à l’aide d’ANOVA à suivie les post-hoc test de Tukey.

Representative Results

Des études antérieures avec le c. elegans ont signalé que l’exposition continue à des concentrations élevées de BPA (≥ 1 mM) tout au long du développement de l’embryon et l’âge adulte diminue la fécondité14. Des études ultérieures signalés dans notre laboratoire ont montré que les embryons qui ont été exposés au BPA pendant une période limitée de 4 h dans les premiers stades de leur développement ont montré une diminution du nombre de œufs viables mis comme adultes15 (Figure 2). Deux éléments essentiels de la méthodologie ont été que (i) les concentrations de BPA utilisées ont été significativement inférieur (0,1 µM à 10 gamme µM) et (ii) l’exposition a été limitée à la période embryonnaire précoce. En plus de la diminution de la fécondité même à des doses plus faibles, notre accoutumance des essais révèlent que vers exposés au BPA embryons conformément à des stimuli plus à devenir habitués par rapport vers exposés au véhicule seul15 (Figure 3). Ces effets sont remarquables en ce qu’elles reposent sur l’exposition au BPA faible dose, suivant le raisonnement que plus subtils effets sur la fonction neuronale qui ne peut pas être morphologiquement apparentes sont susceptibles d’être perceptible à travers les changements de comportement. En bref, les résultats représentatifs présentés ici soulignent le fait que les effets nuisibles de l’exposition au BPA à un embryon impact sur son développement, y compris la fonction neuronale qui peut être évaluée par des tests comportements adultes chez c. elegans. Protocoles fournis ici peuvent être utilisés pour tester les effets de faible dose mais aussi à long terme d’autres toxiques potentiels notamment des perturbateurs endocriniens. Figure 1 : représentation schématique de la conception expérimentale. Vers à maturité ont été recueillies et exposées à la solution d’hypochlorite afin de recueillir des embryons synchronisés. Les embryons ont été ensuite exposés à différentes concentrations de bisphénol a pendant 4 h. Les embryons exposés ont été transférés sur géloses ensemencées de NGM, où ils ont été autorisés à se développer pendant 60 heures à 20 ° C. Pour tester l’efficacité de l’exposition durant les premiers stades du développement, les vers L4 ont été transférés à plaques individuelles et testés pour la fécondité, et les jeunes adultes ont été testés avec touch antérieure accoutumance. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : la fécondité est abaissée par BPA. Exposition à 1 µM et des concentrations plus élevées de BPA a significativement diminué le nombre de œufs pondus par rapport au contrôle (représenté par la ligne horizontale ; n = 10, *p < 0,05). Barres d’erreur indiquent SEM. analyse effectuée à l’aide d’analyse de la variance, les post-hoc test de Tukey. Ce chiffre a été modifié par Alexandre et al., 201515. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : les effets à long terme de l’exposition au BPA embryonnaire sont reflètent un comportement adulte. Embryons exposés à des concentrations aussi faibles que 0,1 µM touche tactile antérieur non associatif accoutumance chez les adultes BPA (n = 60, *p < 0,05). Barres d’erreur indiquent SEM ; Analyse de la variance, les post-hoc test de Tukey. Ce chiffre a été modifié par Alexandre et al., 201515. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Phases de croissance rapide et de développement tels que l’embryogenèse sont particulièrement vulnérables aux effets néfastes de divers composés perturbateurs endocriniens, y compris les BPA. Nous fournissons des protocoles détaillés pour étudier les effets de l’exposition au BPA ou d’autres substances toxiques dans le modèle d’invertébrés de c. elegans , qui permet la pratique titrage d’une plage de concentrations afin d’évaluer son effet sur la viabilité de l’embryon (Figure 2) . Suite à des expériences comportementales survivants adultes qui se développent à partir des embryons qu’ont été exposés à faibles doses de BPA permettent de doser les effets à long terme sur la fonction neuronale (Figure 3). L’idée centrale de ce livre est de fournir des protocoles détaillés pour l’exposition des embryons à diverses substances toxiques au cours de la période de l’embryogenèse précoce dans le modèle de c. elegans ; la première fenêtre de 4 h de sa période de développement embryonnaire de 11,5 heures (à 20 ° C) correspond à la période de prolifération, qui est suivie d’organogenèse. À cette fin, nous avons fourni la validation des points fin grâce à la fécondité et des essais non-apprentissage associatif. Tandis que la base mécanique de l’action de BPA et autres bisphénols est le Saint Graal vers lequel vise la recherche dans ce domaine, nous n’avons pas une tentative d’offrir une explication mécaniste de l’action du BPA dans cet article ciblé de la méthodologie. Toutefois, nous tenons à souligner que le modèle de c. elegans offre un système idéal pour disséquer davantage le mécanisme d’action. Par exemple, à l’avenir travailler sur le décryptage des mécanismes d’action de BPA, c. elegans mutants peuvent être générés et projeté pour une résistance aux effets du BPA et ainsi ouvrent la voie à déchiffrer la voie. En outre, notre document d’accompagnement porte sur les effets du BPA au niveau de la synchronie réseaux neuronaux chez les vertébrés, fournissant une autre avenue pour comprendre la base pour l’étude des mécanismes d’éventuels effets toxiques¹⁹.

Dans la méthodologie détaillée dans cet article, certaines des étapes essentielles qui doivent être exécutées extra soigneusement comprennent ce qui suit : choix ou une plaque avec bien nourris c. elegans adultes avec des ovules matures visibles au microscope de la dissection est essentielle, et ne pas suivre cette étape se traduira par une taille d’échantillon insuffisant d’embryons pour l’expérience de l’exposition d’EDC. Il est également important de s’assurer que la solution d’hypochlorite est fraîche pour éviter d’obtenir une population non synchronisée qui pourraient interférer avec la capacité d’effectuer l’exposition au BPA durant l’embryogenèse précoce. Lavage des granulés avec M9 (après exposition d’hypochlorite) est également une étape très importante. Si ne pas fait correctement, la forte concentration d’eau de Javel peut entraîner des embryons morts. En outre, des embryons devraient être transférées aux plaques de NGM ensemencées après 4 h. Si laissé dans la solution BPA pendant une longue période de temps, les embryons sont susceptibles d’évoluer vers les larves dauer longue durée de vie. Ceci interférera significativement avec le dosage de la fécondité et analyses comportementales. Si aucune de ces étapes est manquée, il est conseillé de commencer la procédure dès le début. Si pour une raison quelconque, la plaque NGM avec worms est contaminée ou n’a pas assez de nourriture, il va ajouter des contraintes sur les vers l’inclinaison ainsi les données recueillies. Ces plaques doivent être jetés et ne pas être utilisées pour l’expérience.

Auparavant, une étude remarquable utilisé avec succès le modèle de c. elegans de démontrer que les anomalies chromosomiques provoquées par résultat BPA en raison de la ventilation des machines de réparation ADN dans les cellules germinales¹⁴. Toutefois, il convient de noter que la conception de l’étude ci-dessus a utilisé une exposition continue de BPA de c. elegans à de fortes doses de bisphénol a, tout au long de sa durée de vie. Notre méthodologie a été conçu pour étudier les faibles doses d’exposition au BPA durant l’embryogenèse précoce, afin de doser ses effets sur la viabilité embryonnaire et les effets à long terme plus subtils sur les survivants. À notre connaissance, aucune méthodologie n’a été élaborée afin d’exposer les embryons au stade précoce à très faibles doses de BPA, limitée à une période déterminée ; ainsi, le procédé de fabrication présenté ici roman.

En outre, les protocoles fournis ici peut être facilement adapté pour étudier les effets d’autres perturbateurs endocriniens lors de la phase de prolifération de l’embryogenèse. Toutefois, afin d’étudier les stades embryonnaires, le protocole exigera des modifications clées à la fenêtre de temps critique de développement dans le cadre de mise au point. En outre, notre protocole ne sera pas approprié pour les expériences nécessitant plus longs de l’exposition toxique, car elle ouvre la possibilité de la voie de développement alternatif, entraînant l’arrestation de dauer longue durée de vie dans le second cycle de mue, qui résiste pour conditions difficiles²⁰. Autres modifications et améliorations seront nécessaires pour les temps d’exposition par le biais de complément avec une source de nourriture qui n’a pas de potentiel de métaboliser la substance toxique ou EDC par exemple stérilisé e. coli. En conclusion, notre méthodologie peut être utilisé pour évaluer les effets des perturbateurs sur la fécondité et la fonction neuronale dans le système de modèle d’invertébrés de divers endocriniens elegans de c.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Soutenir par la NSF (EPSCoR EPS-0814251) et NIH (1P20GM103653-01 a 1) MKT et HSD, aide aux étudiants de l’institutionnel de l’Université de Delaware State MDM (titre III HBGI) et KRS (NIH-INBRE) est grandement appréciées. Grâce au centre de génétique c. elegans (pris en charge par les NIH Office of Research Infrastructure programmes P40 OD010110) pour la souche de c. elegans sauvage N2.

Materials

NaCl	Fisher	7647-14-5
Peptone	Fisher	S25761B
Agar	Fisher	BP1423-500
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
MgSO₄	Fisher	7487-88-9
CaCl₂	Fisher	C79-500
KH₂PO₄	Fisher	P286-1
K₂HPO₄	Fisher	7758-11–4
KOH	Fisher	1310-58-3
Bleach	Clorox	n/a
Na₂HPO₄	Fisher	BP332-500
LB	Fisher	BP1426-500
BPA	Sigma-Aldrich	239658-250g
BPS	Sigma-Aldrich	103039-100g
EtOH	Sigma-Aldrich	64-17-5
E.coli OP50	CGC		Repository at U of Minnesota
N2 (Wild-type C. elegans) worms	CGC		Repository at U of Minnesota
Platinum wire pick	Genesee Scientific	59-AWP
Petri plates	Fisher	07-202-011
Dissection Microscope	AmScope	SM-2TYY

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C. Elegans Bisphenol A (BPA)Embryonic Exposure Low-dose Toxicants Long-term Effects Fecundity Learning Behavior Endocrine Disrupting Compounds Developmental Effects Behavioral Assays Synchronization Hypochlorite Solution M9 Buffer

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Mersha, M. D., Sanchez, K. R., Temburni, M. K., Dhillon, H. S. Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants. J. Vis. Exp. (133), e56771, doi:10.3791/56771 (2018).