胚胎暴露于低剂量毒物的长期行为和生殖后果

下面给出的协议已经标准化, 以测试 BPA 暴露在早期胚胎发生中的影响, 并可能被修改, 用于与 BPS, BPF 或其他 EDCs 和毒物在C. 线虫胚胎。 1. 材料设置 500毫升的线虫生长培养基 (NGM)18培养基, 溶解1.5 克氯化钠, 1.25 克的蛋白胨, 和8.5 克的水中的琼脂到500毫升。热处理后 (121 摄氏度, 15 PSI, 20 分钟), 添加0.5 毫升的胆固醇 (5 毫克/毫升乙醇), 0.5 毫升1米 MgSO4, 0.5 毫升 1 m CaCl2和12.5 毫升磷酸钾的缓冲, pH 1 (7.4 g 的 108.3 PO 2, 35.6 克 K2HPO4, 水到1升)。 混合25毫升1氮 KOH, 4 毫升漂白剂和71毫升水, 制备次氯酸盐溶液。使这个解决方案新鲜。 通过混合3克2PO4, 6 g 的 Na2HPO4, 5 克氯化钠, 5 毫升1米的 MgSO4和水到1升, 准备 M9 缓冲区。 通过混合 129 mL 0.02 米 K2HPO4, 871 毫升的 18 ml2PO4和5.85 克氯化钠, 准备 S 缓冲区。 用热处理消毒 M9 和 S 缓冲器。 在20毫升的 Luria 汤 (磅) 中生长一夜间大肠杆菌 (OP 50 菌株) 的培养。 将 BPA 溶解在10% 乙醇中, 制成1毫米的库存溶液。在 S 缓冲区中进行后续稀释0.1 µM、0.5 µM、1µM、5µM 和10µM。注: 稀释水中的缓冲液可大大降低乙醇的浓度;例如, 在本议定书所描述的最高 BPA 浓度 (10 µM) 中, 乙醇的浓度为0.1% 伏/v。 2.线虫培养和同步 将 NGM 介质倒入100毫米板 (约25毫升/片), 并使其凝固。一旦固化, 种子的板块通过传播150µL 的大肠杆菌OP50 从液体培养一夜之间生长。孵化盘在37°c 过夜。 第二天, 将 N2 蠕虫转移到新的板块上, 通过分块1厘米正方形的近似板。允许蠕虫生长3天, 在20摄氏度, 直到板块填充有良好喂养成熟的成年人, 含有可见的胚胎。 要同步, 请通过吹打5毫升的 M9 缓冲板来清洗每个盘子。将液体转移到无菌的15毫升锥形离心管。注意: 同步是为了杀死成年蠕虫并收集相对相同阶段的胚胎。 离心机以 3000 x g 为4分钟室温, 以获得一个松散的成人蠕虫颗粒。 使用10毫升吸管, 小心地取出上清, 以保持颗粒完好。加入5毫升的次氯酸盐溶液, 轻轻地混合。 离心机在 3000 x g室温下4分钟。 用10毫升吸管去除上清, 用7毫升的 M9 缓冲液冲洗。重复此步骤两次。 3. 将蠕虫暴露于 BPA 中 在最后一次洗涤从上面步骤 2.7, 暂停大约100µL 蛋与 M9 缓冲。将大约50µL 的卵转移到2毫升离心管, 已经含有适当浓度的 BPA 稀释在 S 缓冲器中。调整 S 缓冲量以确保每管的 BPA (0.0 µM、0.1 µM、0.5 µM、1.0 µM、5.0 µM 和10µM) 的最终浓度正确。表1说明了使这些稀释的一种方法。 最终的 BPA 浓度 库存 BPA (100 微米) S 缓冲区 同步蠕虫 0.1 微米 1 ul 949 ul 50 ul 0.5 微米 5 ul 945 ul 50 ul 1微米 10 ul 940 ul 50 ul 5微米 50 ul 900 ul 50 ul 10微米 100 ul 850 ul 50 ul 表 1: 库存 BPA, S 缓冲和同步蠕虫用于达到所需的浓度用于我们的研究。 把管子放在一个振动筛上, 在20°c 时轻轻摇动4小时, 在 25 rpm 的旋转振动筛或25倾斜/分钟的摇摆振动筛。 4小时后, 将管子放在管架上, 允许蠕虫沉淀。 丢弃上清并将蠕虫转移到种子板上 (NGM 板与 OP50 的大肠杆菌)。使液体 OP50大肠杆菌文化, 如1.5 所述, 并将2.1 中所述的板材播种。 让蠕虫生长60小时, 在20摄氏度。每天检查盘子是否有污染。受污染的 NGM 板块通常是变色的, 并伴有个别的菌落。检查显微镜下的蠕虫是否人满为患。缺乏 OP50 的大肠杆菌草坪和集中的蠕虫在小斑点意味拥挤。 4. 前接触适应性试验 将大约10个同步的年轻的成人蠕虫转移到新的非种子选手 NGM 板使用一个火消毒30克铂丝挑选。让蠕虫不受干扰的5分钟, 让他们的时间适应新的板块。 对于适应反应, 用一根挂在木制串或牙签末端的眉毛, 用70% 乙醇浸泡消毒。用干净的无绒纸巾擦拭, 等待1分钟乙醇蒸发掉。用眉毛轻轻地触摸头上的蠕虫 (咽前的灯泡)。重复触摸, 允许十年代在触摸之间, 以允许蠕虫恢复。 继续触摸 (允许十年代 interstimulus 间隔), 直到蠕虫不再向后移动。在这一点上, 蠕虫已经习惯了刺激。记录蠕虫对习惯所需的接触次数。 用单向方差分析法和 Tukey 后的特殊试验, 对治疗和未治疗对照的平均适应率的差异进行研究。 5. 蠕虫繁殖试验 使用铂金采摘将单个 L3 蠕虫转移到新鲜的和种子的盘子里。确保每个盘子只放置一个蠕虫。注: L3 幼虫期后, 蠕虫发育为 L4 幼虫期和成年。及早采摘他们是方便的, 因为他们足够大, 以转移个别动物, 同时确保他们还没有产卵, 否则将错过在伯爵。 计算每12–24个的卵数。计数后, 将父蠕虫转移到新的盘中。重复直到蠕虫停止产卵, 通常在5天后孵化20摄氏度。注: 野生型蠕虫平均可产卵300只;因此, 每天将父母转移到新的盘子里可以防止过度拥挤。 用单向方差分析法和 Tukey 后的临时试验, 对治疗后和未经治疗的对照组的平均卵数进行了比较。