Questo protocollo descrive un nuovo metodo che consente la visualizzazione quantitativa della formazione di complessi di proteine SNARE, basato sul trasferimento di energia per risonanza e la durata di fluorescenza imaging microscopia.
Solubile N– ethylmaleimide sensibile della proteina (NSF) allegato proteina recettore (rullante) proteine di fusione sono la chiave per il traffico di membrana, come essi catalizzano la fusione della membrana all’interno delle cellule eucariotiche. Famiglia delle proteine SNARE è costituito da circa 36 diversi membri. Rotte di trasporto intracellulare specifico vengono catalizzate da specifici gruppi di 3 o 4 proteine SNARE che quindi contribuiscono alla specificità e fedeltà del traffico di membrana. Tuttavia, studiando la funzione precisa di proteine SNARE è tecnicamente impegnativo, perché le insidie sono molto abbondanti e funzionalmente ridondanti, con la maggior parte delle insidie avendo multipli e funzioni di sovrapposizione. In questo protocollo, è descritto un nuovo metodo per la visualizzazione della formazione del complesso SNARE in cellule vive. Questo metodo si basa su che esprimono le proteine SNARE C-terminale fuse a proteine fluorescenti e loro interazione di misura di energia di risonanza di Förster transfer (FRET) durata di fluorescenza impiegando imaging microscopia (FLIM). Montando gli istogrammi di corso della vita di fluorescenza con un modello di decadimento multicomponente, FRET-FLIM permette (semi-) stima quantitativa della frazione della formazione del complesso SNARE alle diverse vescicole. Questo protocollo è stato applicato con successo per prevedere la formazione del complesso SNARE alla membrana del plasma e alle endosomal scomparti in linee cellulari di mammifero e cellule del sistema immunitario primarie e può essere facilmente esteso per studiare funzioni rullante presso altri organelli in animale, pianta e cellule fungine.
Traffico di membrana è una caratteristica centrale delle cellule eucariotiche, dove vescicole di membrana bud fuori da un organello donatore e quindi spostarsi e fusibile con una destinazione organello1,2. Fatta eccezione per i mitocondri, tutti questi passaggi di fusione della membrana vengono catalizzati dai membri della proteina SNARE famiglia1,2. Famiglia delle proteine SNARE è costituito da circa 36 membri in cellule di mammiferi e circa 20 membri in lievito2. Proteine SNARE contengono uno o due ~ 52 residui-lungo, in modo nativo non strutturate aree denominate SNARE-motivi. Proteine SNARE sono spesso legati alle membrane di un C-terminale dell’elica del transmembrane1,2. Insidie possono essere classificati basato sui residui centrali che contribuiscono per il complesso SNARE in arginina (R) e glutammina (Q) insidie1,2. Fusione della membrana è guidato dall’interazione di 3 o 4 insidie cognate che insieme contribuiscono 4 SNARE-motivi e sono distribuiti sopra il donatore e accettore della membrana1,2. Un complesso SNARE è costituito da un motivo di R-rullante e tre motivi di Q-rullante (chiamati Qa, Qb e Qc). La formazione del complesso inizia alla N-termini di rullante-motivi, formando un cosiddetto trans-rullante-complessi e procede verso la C-termini, formando un fascio di arrotolato-arrotola α-elica stretto chiamato un cis-rullante-complesso. La formazione del complesso di persino un singolo complesso SNARE trascina le membrane donatore e accettore insieme e supera la barriera di energia per membrana fusion3.
Assegnazione di distinti complessi SNARE a vie di trasporto specifici all’interno delle cellule è spesso tecnicamente impegnativo. Sebbene insidie chiaramente contribuiscono alla specificità del traffico di membrane, sono promiscua, funzionalmente ridondanti e le loro funzioni si sovrappongono1,2. Per questo motivo, esperimenti di perturbazione targeting insidie, come per knockout del gene, l’interferenza del RNA, l’introduzione del blocco anticorpi o con frammenti di rullante solubili che agiscono come dominanti negativi, spesso non risultano in fenotipi chiari come gli altri Insidie compensano2,4. Inoltre, è difficile da differenziare passaggi fusione specifiche della membrana da eventi di traffici a Monte, perché insidie possono essere coinvolti in più percorsi di trasporto2. Studi di localizzazione delle insidie di approcci di microscopia, utilizzando immunolabeling o fusione genetica di proteine reporter fluorescenti, soffrono di problemi che: (i) insidie individuare al più organelli come mediano spesso più traffici passi e (ii) loro localizzazioni non significano automaticamente che funzionalmente sono impegnati nella formazione del complesso SNARE. Infine, complessi SNARE possono essere identificati mediante esperimenti di immunoprecipitazione utilizzando una delle insidie come esca e altre insidie come obiettivi, ma questo non consente l’assegnazione di questi complessi di organelli specifici o rotte del narcotraffico. Così, attualmente, non esiste nessuna tecnica alternativa per visualizzare complessi SNARE con risoluzione organellari. Immunofluorescenza non è in grado di dimostrare le interazioni di rullante, ma può mostrare solo la presenza o l’assenza di co-localizzazione, mentre immunoprecipitazione può mostrare solo rullante interazioni in tutta la popolazione di cella ma non assegnare gli organelli dove questi verificarsi di interazioni.
Per superare queste limitazioni, un nuovo metodo che consente la visualizzazione quantitativa dei complessi SNARE all’interno di cellule vive con risoluzione organellari recentemente è stato sviluppato da Verboogen et al. 5 questo metodo è basato sull’espressione di paia di lacci con proteine fluorescenti spettralmente spostate fuse C-terminale a loro eliche transmembrane. Dopo il completamento della fusione della membrana e la formazione di un cis-rullante complesso, questi fluorofori alla C-termini delle eliche transmembrane immediatamente vengono accostate a vicenda. I fluorofori sono quindi ben all’interno della distanza di Förster (in genere < 5 nm), con conseguente FRET dal fluoroforo donatore verde-spostato al fluoroforo accettore rosso-spostato5,6. FRET risultati nell’estinzione del fluoroforo donatore e un’aumentata emissione del fluoroforo accettore che può essere misurato dai rapporti dell’emissione donatore e accettore (raziometrici FRET). Tuttavia, raziometrico FRET tra due diverse molecole è impegnativo, a causa di livelli di cross-talk e diversi di fluorescenza del donatore e accettore insidie a diversi organelli e tra cellule7,8. FRET può anche essere misurata dalla durata di fluorescenza, che è il tempo tra l’eccitazione e l’emissione di un fotone. Se il fluoroforo donatore può liberare la sua energia di FRET, questo risultato di processo concorrenti in un apparente accorciamento del ciclo di vita di fluorescenza. Ciò può essere misurata da FLIM7,8. Durata FRET è molto più robusto di raziometrici FRET per misurare le interazioni tra due molecole diverse, come la durata di fluorescenza è una proprietà intrinseca di un fluoroforo ed è insensibile alla sua concentrazione. Inoltre, FRET è da approssimazione quantitativa, perché l’efficienza della FRET è inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza tra il donatore e accettore fluorofori (essenzialmente una funzione di passaggio). Quindi, montando gli istogrammi di vita di fluorescenza registrati da FLIM con un modello di decadimento doppio componente, FRET-FLIM consente la stima quantitativa (semi-) della frazione di molecole di rullante impegnati, la formazione del complesso SNARE5.
Recentemente, è stato utilizzato questo metodo di FLIM FRET da Verboogen et al. per visualizzare la formazione del complesso SNARE in cellule dendritiche primarie del sistema immunitario5. È stato dimostrato che, incontrando uno stimolo patogeno, cellule dendritiche reindirizzare loro traffico di membrane accompagnato da un complessante aumentata della proteina di membrana della vescicola-collegata di R-rullante (VAMP) 3 con il Qa-SNARE sintaxina 4 specificamente alla membrana del plasma. Questa maggiore formazione del complesso SNARE è probabilmente necessaria per soddisfare la maggiore capacità secretiva per la secrezione di citochine infiammatorie quali l’interleuchina-65. Questo protocollo descrive le fasi sperimentali necessarie per l’acquisizione di FRET-FLIM dati per la visualizzazione e (semi-) misurazione quantitativa dei complessi SNARE.Viene spiegato come adattare gli istogrammi di vita di fluorescenza di cellule intere con mono – e bi-esponenziale funzioni di decadimento, conseguente la durata apparente fluorescenza come una stima quantitativa alle interazioni di rullante. In questo protocollo, la linea delle cellule HeLa ampiamente usato è utilizzata come esempio, ma il metodo può essere facilmente esteso per studiare complessi SNARE in altre cellule eucariotiche.
Questo protocollo viene illustrato l’utilizzo del FLIM in apprensione per la visualizzazione delle interazioni SNARE sintaxina 4 e VAMP3 in cellule HeLa vive. Sintaxina 4 è una proteina di Qa-rullante localizzare prevalentemente sulla membrana plasmatica dove media esocitosi1,2,20,21. VAMP3 è un R-rullante che principalmente è descritto per individuare a riciclare endosomal scomparti e media il traffico ad altri gli endosomi pure per quanto riguarda la membrana plasmatica1,2,20. Tuttavia, il dosaggio di FRET-FLIM può essere facilmente adattato per lo studio di altre proteine SNARE. L’unica condizione è che queste trappole contengono un’elica transmembrana del C-terminale, che è il caso per la maggior parte delle proteine SNARE da lontano1,2. Inoltre, il protocollo descritto qui può essere adattato per la visualizzazione dei complessi SNARE in qualsiasi tipo di cellula eucariotica, comprese piante e lievito. In questo protocollo, abbiamo usato l’accorciamento della vita di fluorescenza del fluoroforo donatore come una misura di FRET. Come un approccio complementare, della durata del fluoroforo accettore potrebbe essere esaminata, che fornisce la prova inequivocabile che trasferimento di energia di risonanza si verifica perché l’emissione sensibilizzato provoca una fase di netto aumento.
Attualmente, la tecnica FLIM FRET può non essere in grado di visualizzare complessi SNARE in compartimenti lisosomiale. Per il costrutto di 3-mCitrine-mCherry tandem sintaxina, la fluorescenza di mCherry si trovano spesso più accumulata in una zona di juxtanuclear, che probabilmente corrisponde ai compartimenti lisosomiale, considerando che il segnale di mCitrine è più abbondante nei cellulari periferia5. È stato osservato un accumulo di juxtanuclear simili di mCherry rispetto a mCitrine, quando le stesse proteine SNARE fuse a queste proteine fluorescenti erano co-espressi5. I lisosomi sono caratterizzati da un pH estremamente basso (< 4) e un’elevata attività degli enzimi proteolitici. L’accumulo di juxtanuclear di mCherry è probabilmente causato da una maggiore resistenza del fluoroforo mCherry a degradazione lisosomiale rispetto al fluoroforo mCitrine. Non è a causa di pH-tempra di mCitrine, come juxtanuclear accumulo di mCherry si verifica anche al momento della fissazione delle cellule5. Così, la tecnica FRET-FLIM sottovaluta la quantità di apprensione nelle regioni juxtanuclear (lisosomiali) e questo richiederebbe altre proteine reporter fluorescenti che sopravvivono ai termini duri all’interno dei lumen dei lisosomi.
FRET-FLIM in linea di principio permette di ottenere una stima quantitativa (semi-) della frazione di insidie nel complesso5. Come abbiamo spiegato in questo protocollo, ciò richiede il montaggio degli istogrammi di corso della vita di fluorescenza con funzioni di decadimento doppio-esponenziale (equazione 2), dove l’ampiezza della componente veloce è proporzionale alla frazione di insidie nel complesso ( L’equazione 3). Tuttavia, tale accessorio con un modello bi-componente è tecnicamente impegnativo. Raccordo con più parametri di forma gratuiti (due corsi della vita di fluorescenza e due ampiezze) richiede un numero molto grande di fotoni, soprattutto perché i parametri influenzano a vicenda e piccoli errori nel corso della vita influenzerà le ampiezze e vice versa. Per superare questi problemi di montaggio, le durate di fluorescenza del componente lenta possono essere fissate per la durata della condizione unico donatore (cioè, non FRET; solo mCitrine presenti) e quella del componente veloce alla durata del tandem costruire ( massima si presenterebbe FRET). Tuttavia, questo dovrebbe anche essere interpretato con cautela, perché le durate di fluorescenza non possono essere lo stesso come in questi stati di controllo e potrebbero deviare a causa di diverse ragioni (self-tempra, orientamento del dipolo, variazioni nel microambiente). Più complessi SNARE nelle immediate vicinanze (< 10 nm) può risultato in distanza-dipendente FRET, lo stesso principio che permette FRET essere utilizzato come un “righello molecolare”, ma in questo caso, oscura la quantificazione di complessi SNARE. Inoltre, una stima quantitativa non è sempre significativa, perché le insidie con etichettate competono con endogeno SNAREs (senza etichetta). Di conseguenza, il livello di espressione di mCherry-labeled rullante è un determinante principale per la percentuale FRET5. A causa di tutti questi avvertimenti, si consiglia di montare gli istogrammi di vita fluorescente con una funzione di decadimento mono-esponenziale (equazione 1). Questo ha il vantaggio che non richiede alcuna conoscenza a priori dei tempi di vita e la vita fluorescente media apparente risultante fornisce una misura tinta per rullante complessanti5.
Tuttavia, si prevede che imaging FRET-FLIM quantitativo di modelli del due-componente raccordo avrà potenti applicazioni future. RULLANTE-codifica geni all’interno del cromosoma possono essere fuso con proteine reporter fluorescenti, ad esempio da CRISPR/CAS9. Questo provoca l’etichettatura fluorescente delle proteine SNARE endogene, con livelli di proteina endogena e senza sfondo delle insidie senza etichetta e quindi consente una stima quantitativa significativa della frazione di complessi SNARE di FRET-FLIM. Mentre i livelli di espressione delle insidie endogeni potrebbero essere piuttosto basso e dare relativamente basse segnali fluorescenti, si prevede che un numero sufficiente di fotoni possa essere ottenuto, soprattutto per l’intera cellula FLIM (che richiede solo pochi 1, 000s di fotoni). Inoltre, queste misurazioni FRET-FLIM possono essere eseguite con rivelatori di fotodiodo valanga più sensibili che comporterà anche i segnali di fluorescenza elevata e migliori statistiche di fotone.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da una borsa di studio di Ipazia da Radboud University Medical Center, il Career Development Award da Human Frontier Science Program, il programma di gravitazione 2013 dall’organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO; ICI-024.002.009), un VIDI concedere da NWO (ALW VIDI 864.14.001) e una sovvenzione a partire dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell’ambito settimo programma dell’Unione europea quadro (Grant contratto numero 336479).
Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine' | Addgene | ID 92422 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry' | Addgene | ID 92423 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry' | Addgene | ID 92426 | Positive control for maximum achievable FRET. |
Hela cells | |||
35 mm glass bottom dishes | Willco Wells | HBST-3522 | Other live cell imaging chambers will work as a substitute |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco, Life Technologies | 31966-021 | |
Fetal calf serum | Greiner Bio-one | 758093 | |
Antibiotic-antimycotic solution | Gibco, Life Technologies | 15240-062 | Pen/Strep will work as a substitute |
Live cell imaging medium | Thermo Fisher Scientific | A14291DJ | Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented |
Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective | Leica | SP8 | Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used |
Pulsed white light laser | Leica | SP8 | Other pulsed laser sources can also be used |
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system | PicoQuant | PicoHarp 300 | |
PT32ICS conversion software | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | ||
data analysis software programme capable of deconvolution | Originlabs | OriginPro 2016 | |
Fiji ImageJ | |||
Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity | Fiji ImageJ | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | |
Bürker Haemocytometer | VWR | 630-1541 | |
HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
PBS | B Braun Melsungen AG | 362 3140 | |
EDTA 2 mM | Merck | 108417 | CAS: 60-00-4 |
15 mL tubes | Greiner Bio-one | 188271 | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | CAS: 72-57-1 |
NEON cell electroporation device | Thermo Fisher Scientific | MPK5000S |