Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

Kishore S. Malyavantham; Lakshmanan Suresh

doi:10.3791/56722

JoVE Journal > Immunology and Infection

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İmmünoloji ve Enfeksiyon

Monospecific 및 소설 형 간염-2 엘리트/DFS70 녹아웃 기판으로 아나 심사 중 혼합된 DFS70 패턴의 동시 구별

Published: January 17, 2018

doi:

10.3791/56722

Kishore S. Malyavantham¹, Lakshmanan Suresh¹

¹Research & Development, Immco Diagnostics,A Trinity Biotech Company

Özet

DFS70 자가 기존의 형 간염-2 기질을 사용 하는 경우 정확한 해석을 도전 만드는 일반적인 반핵 항 체 질병 관련 된 패턴을 모방. 프로토콜에서는 기존의 형 간염-2 검사 및 monospecific 및 혼합된 아나 긍정적인 경우에 높은 신뢰와 DFS70 패턴을 구별 아나 소설 조작된 형 간염 2 기판의 이점을 설명 합니다.

Abstract

조직 자기 면역 결합 조직 무질서는 반핵 항 체 (애 나) 순환 특징. 아나 심사에 사용할 수 있는 여러 기술이 있다, 간접 면역 형광 검사 (IIF) 인간 상피 세포-2 (형 간염-2) 기판을 사용 하 여 우수한 감도 때문에 기본 및 권장 방법 남아 있다. 형 간염 2 기판 다양 한 핵과 세포의 세포질을 통해 배포 하는 다양 한 단백질 및 핵 산 autoantigens autoantibody 바인딩에서 발생 하는 패턴을 검색할 수 있습니다. Monospecific 형 간염 2 기판에 긍정적인 반응에서 또한 인 혼합된 패턴의 큰 다양성 해석 및 보고의 정확도 복잡 하 게. 최대한 주의 최근에 받은 한 특정 예제에서는 밀도 괜 찮 얼룩 덜 룩 한 70 (DFS70) 패턴입니다 렌즈 파생 하는 상피 성장 인자 (LEDGF) 이라고 불리는 단백질에 특히 묶는 신경에서 유래. 명확한 연관 특정 조직의 자가 면역 질환 및 건강 한 인구에 있는 높은 보급의 중요 한 DFS70 패턴의 정확한 해석을 만들었습니다. 기존의 형 간염-2 기판을 사용 하 여 질병 관련 된 패턴에서 DFS70 패턴의 정확한 구별은 도전 이다. 또한, 균질, 얼룩 덜 룩 한, 및 혼합 균질 얼룩 패턴 등 질병 관련 패턴 함께 DFS70 패턴의 빈번한 起 IIF 해석 복잡 하 게. 이 백서의 목적은 소설의 유틸리티 동시에 둘 다에 높은 신뢰와 DFS70 패턴을 구별 하는 기능을 제공 하면서 기존의 형 간염 2 기판의 모든 장점을 유지 하는 형 간염 2 IIF 기판 설계를 설명 하는 monospecific 그리고 혼합된 아나 긍정적인 예입니다. 새로운 기판 수 정체 질환 관련 아나 패턴 이전 DFS70 패턴에 의해 은폐 하 더 이다.

Introduction

아나 스 면역 중재 조직 결합 조직 질병¹의 특징입니다. 여러 가지 방법은 심사와 아나 스의 확인에 대 한 고용 됩니다. IIF 기술 형 간염 2 기판 남아를 사용 하 여 가장 널리 사용 하 고 자주 아나 스¹^,²심사 방법 추천. 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 효소 immunoassay (EIA), 화학 immunoassay (CLIA), 구슬 기반 다중 분석 등 단단한 단계의 진단 분석 방법론의 발전에도 불구 하 고 형 간염-2 IIF는 가장 널리 상영 진단 유용성 및 비용 효율성¹^,²^,³방법. 순화 된 네이티브의 제한 된 집합에 의존 하는 위에서 언급 한 분석 결과 기술 또는 재조합 autoantigens 형 간염-2 셀 단층 준비 유리 슬라이드 우물에 그들의 자연적인 형태로 autoantigens의 광범위 한 배열을 제공 하는 반면에 분산 핵과 세포질을 환자 세라 또는 결과 다양 한 다양 한 면역 상태와 관련 된 패턴에에서 긍정적인 컨트롤에서 신경으로 반응 합니다. 이러한 패턴은 세포에 항 원의 위치에 따라 핵, 세포질와 mitotic 패턴으로 분류 됩니다. 각 패턴 및 관련된 항 원/항 질병 상태는 잘 특징된⁴. IIF 방법에 환자 및 제어 세라 autoantigens 그들의 자연적인 구성에서의 군중을 유지 하기 위해 적절 한 고정 형 간염-2 세포의 단층 문화를 제공 하는 유리 슬라이드 우물에 알을 품는. 환자 혈 청 또는 긍정적인 컨트롤에 신경 외피 동안 형 간염-2 셀 기판 (유리 슬라이드 잘)에 제시한 autoantigens에 바인딩할 수 있습니다. 게시물 인큐베이션, 언바운드 항 체는 씻어 하 고 바운드 항 체 IgG 클래스의 fluorescein/fluorescein isothiocyanate (FITC) 활용 안티 인간 IgG 시 약 검색 됩니다. 언바운드 보고 공액 씻 고 유리 coverslips 반응을 유지 하 고 형광 현미경 관찰을 용이 하 게 장착 매체를 사용 하 여 슬라이드 위에 거치 된다. 반응을 사용 하는 기자에 의하여 구성 된 적절 한 자극 방출 필터 조합을 갖춘 형광 현미경 관찰 된다 (FITC 기자에 대 한 진단 현미경 일반적으로 사용 하 여 필터 467의 구동 범위 -498 nm 및 513-556 nm의 방출 범위). 애 나의 존재는 셀에 특정 구조의 밝은 녹색 형광에 의해 증명 됩니다. 자동된 분석 결과 플랫폼, 달리 IIF 방법론은 세라와는 중요 한 사용자 전문성⁵^,⁶얼룩 패턴의 시각적 긍정적인 결정을 diluting 직렬의 힘 드는 과정에 의존 합니다. 이러한 제한에도 불구 하 고 IIF 형 간염-2로 가장 널리 사용 되 있고 패턴 (ICAP) 위원회, 아나에 국제 합의 의해 패턴 해석 및 명명법으로 표준화 노력으로 인해 아나 스의 심사 방법 권장 IIF 슬라이드 처리, 그리고 결과 해석³에 대 한 자동화 솔루션의 증가 가용성.

Psip1 유전자 제품 (LEDGF/p75/DFS70 라고도 함)을 대상으로 하는 자가 형 간염 2 IIF 메서드에서 검색 패턴의 무리 중, 최근 몇 년 동안 몇 가지 이유로⁴^,^{5에에서 상당한 관심을 얻고 있다} ^,⁶^,^,⁷⁸^,^,⁹¹⁰. DFS70 신경 건강 한 컨트롤, 높은 titers에 존재 하 고 지금까지 연구 DFS70 신경⁷^,^,⁸⁹ ^{의 존재에 대 한 뚜렷한 임상 협회를 설명 하기 위해 실패}¹⁰^,¹¹^,^,¹²¹³. 다양 한 질병 상태와 건강 한 동료 연구⁶^,^,⁸⁹^,¹⁰^,^{14 사이 널리 다양 한 DFS70 신경에 대 한 긍정적인 결과 보고 속도} ^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,^,²¹²²^,²³ ^,^,²⁴²⁵^,²⁶^,^,²⁷²⁸. Monospecific DFS70 패턴 잘 혼합된 균질 얼룩 패턴의 해석 하지만 균질 또는 얼룩 덜 룩 한 패턴에서 차별화 된 그리고 다른 아나 스 공동 발생 방지-DFS70 항 체도 전문가 독자에 대 한 도전 이다. 심사 방법 및 DFS70 특정 단단한 단계의 분석 IIF의 현재 세대 monospecific DFS70 반응 혼합된 패턴 (그림 1A, 알고리즘의 노란색 음영된 지역)에서 분화 할 수 있다. 균질, 얼룩 덜 룩 한, DFS70 패턴 또는 혼합된 패턴, 또는 반대로, 오해는 환자 치료에 심각한 영향을 있을 수 있습니다. 현재 일반적으로 사용 되는 프로토콜은 다음과 같습니다: 아나 스 질병 관련에 대 한 단단한 단계의 확실 한 테스트의 수를 사용 하는 임상 실험실 / DFS70/LEDGF 때 고밀도 미세 얼룩 (AC-2) 패턴에 대 한 immunoadsorption 메서드 (그림 의심 되 1A)⁴^,⁵.

이 프로토콜의 목표는 소설의 유틸리티 형 간염 2 IIF 기판 설계를 설명 하는 (형 간염-2 엘리트/DFS70 녹아웃 (KO), 것 이다 라고도 형 간염-2 엘리트)를 심사 하면서 동시에 아나 기존의 형 간염-2의 모든 장점을 유지 monospecific에 혼합된 아나 긍정적인 경우 (그림 1B, 알고리즘의 노란색 음영된 지역)⁵높은 자신감과 DFS70 패턴을 구별. 형 간염-2 엘리트 기판 수정 되지 않은 기존의 형 간염-2 셀과 1:9 비율⁵항 원 LEDGF/p75/DFS70 없는 조작된 셀의 대략적인 혼합물으로 구성 된다. 형 간염-2 엘리트의 IIF 절차는 기존의 형 간염 2 메서드를 동일 합니다. 형 간염-2 엘리트 기판의 독특한 구성 뿐만 아니라 기존의 HEp2의 모든 장점을 유지 하지만 초기 심사 또는 샘플 (그림 1B의 테스트에서 DFS70 패턴에서 균질, 얼룩 덜 룩 한, 그리고 혼합 반응 패턴을 분화 할 수 있다 )⁵. 환자 혈 청 형 간염 2 IIF 기판으로 슬라이드에 반응 하는 희석된 1:40 상영 희석 또는 개별 실험실 조건에 의하여 해야 한다. 1시 40분 또는 더 높은 titer에 특정 한 반응은 긍정적으로 간주 됩니다.

이 연구, 균질, 얼룩 덜 룩 한, centromere, nucleolar, 세포질 망상/의학 협회, 및 심사 (부정적인 제어 및 키트에서 제공 하는 긍정적인 아나 컨트롤)을 기준으로 중간 긍정적인 신호를 생성 하는 DFS70 패턴에 대 한 긍정적인 세라 1시 40분의 희석 형 간염 2 기판에 모노 및 혼합 패턴 시뮬레이션 선정 되었다 (기존의 고 형 간염-2 엘리트). 1:40 1시 40분으로 희석된 DFS70 긍정적인 세라 혼합 희석 개별 질병 관련 된 아나의 패턴 컨트롤 (균질, 얼룩 덜 룩 한, centromere, nucleolar, 또는 세포질 망상-AMA) 다양 한 비율 (제어: DFS70 100:0, 80:20, 50: 50, 과, 그리고 0:100) 전통적인 평가 형 간염-2 엘리트 기판 다음 아래에 설명 된 표준 IIF 절차.

Protocol

프로토콜은 삼위일체 생명 공학 기관 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 1. 샘플 및 기판 준비 파우치 포함 하는 기판 슬라이드를 허용 (12 웰 스와 HEp2 또는 형 간염을 포함 하는 각 슬라이드에 슬라이드 유리-2 + HEp2 코 셀 혼합물) 최적의 성능을 위해 실내 온도에 equilibrate 이전에 슬라이드 표면에 수 분의 응축을 방지 하는 샘플의 추가입니다. 이것은 약 10-15 분 사이 소요 됩니다. 실내 온도에 equilibrated, 신중 하 게 제거 하는 주머니의 측면을 건드리지 그들 없이 손가락을 사용 하 여 기판 슬라이드. 슬라이드 레이블 하 고 (실 온)에서 보육 실에서 샘플 및 어원이 부 화 하는 동안 슬라이드의 건조를 방지 하기 위해 물에 적신 종이 타월로 줄지어 그들을 배치.참고: 일반적인 얼룩이 드라이 웰 스;에서 발생할 수 있습니다. 젖은 종이 타월 인큐베이션 챔버 내부 습도 제공 하 고 잘 건조를 방지. 2입니다. 추가 컨트롤 및 샘플 이 연구, 또는 개별 슬라이드 우물에 환자 혈 청 샘플에 설명 된 대로 부정/긍정적인 컨트롤, DFS70-아나 긍정적인 세라의 조합의 약 50 µ L을 분배. 슬라이드에서 각 우물에 컨트롤 및 샘플을 분배. 잘 교차 오염을 방지 하기 위해, 우물 overfilling 하지 마십시오. 웰 스 overfilling 하지, 하는 동안 잘 표면의 완전 한 범위를 확인 하 고 공기 방울을 피하기 위해.참고: 권장된 볼륨은 50 µ L 단계 2.1에 의하여. 보육 실에 뚜껑을 배치 하 고 실 온에서 30 분에 대 한 슬라이드를 품 어. 어떤 아나 환자의 혈 청에 있는 경우에, 그것은이 잠복기 동안에 각 잘 현재 셀에 바인딩합니다. 일단 잠복기가 끝나면, 보육 실에서 슬라이드를 제거 합니다. 탭 끝에 슬라이드를 잡고 약 10 mL 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 워시 버퍼를 피 펫을 사용 하 여 키트에 제공 된로 부드럽게 씻어 또는 10-15 미에 대 한 PBS 가득한 비 커에 전송 슬라이드 바로 PBS 워시 버퍼와 세척 (Coplin jar로 담가) 10 분 반복 모든 나머지 슬라이드와 프로세스에 대 한.참고: Coplin jar에서 여러 슬라이드를 배치 되었는지 확인 하면 다른 슬라이드, 슬라이드의 셀 쪽에 연결 하지 못한이 유리 슬라이드에 준수는 세포 손상 됩니다. 3입니다. 형광 공액의 추가 Coplin jar에서 한 번에 하나의 슬라이드를 제거 합니다. 슬라이드에서 초과 PBS 워시 버퍼를 제거 하려면 부드럽게 탭 또는 종이 타월에 슬라이드를 되 리. 각 키트는 FITC 안티 인간 IgG 형광 공액 표시와 함께 제공 됩니다. 각 음에 부드럽게 1 방울 (약 50 µ L) 제공 된 공액 적용 됩니다. 30 분 동안 닫힌된 얼룩 보육 실에서 슬라이드를 품 어.참고: Fc 특정 IgG 켤레를 사용 하 여 것이 좋습니다. 어떤 아나 환자의 혈 청에 있는 경우에, 여 켤레를 우물에 셀의 특정 형광이 잠복기 동안에 각 잘 현재 셀에 바인딩합니다. 공액은 빛에 민감합니다. 닫힌된 인큐베이션 챔버 각 우물에 셀의 어원이 반응으로 빛의 간섭을 방지 하는 데 도움이 됩니다. 일단 잠복기가 끝나면, 보육 실에서 슬라이드를 제거 합니다. 탭 끝에 슬라이드를 보유 하 고 약 10 mL PBS 워시 버퍼를 피 펫을 사용 하 여 키트 또는 PBS로 채워진 비 커를 제공 부드럽게 씻어. 전송 슬라이드 바로 PBS 워시 버퍼와 세척 (소) Coplin jar로 나머지 모든 슬라이드 과정을 반복 하는 10 분에 대 한.참고: Coplin jar에서 여러 슬라이드를 배치 되었는지 확인 하면 다른 슬라이드, 슬라이드의 셀 쪽에 연결 하지 못한이 유리 슬라이드에 준수는 세포 손상 됩니다. 건조 종이 타월에 키트에 제공 되는 coverslips를 배치 합니다. 설치 미디어 키트와 함께 제공 됩니다. coverslip의 아래쪽 가장자리 라인에 설치 미디어의 3-4 방울 사이 적용 합니다. 워시 버퍼를 포함 하는 Coplin jar에서 한 번에 한 슬라이드 밖으로 가져가 라. 초과 워시 버퍼를 제거 하려면 부드럽게 탭 또는 종이 타월에 슬라이드를 되 리. coverslip의 가장자리에 슬라이드의 아래쪽 가장자리를 배치 하 여는 coverslip에 부드럽게 슬라이드를 낮춥니다. 이 흐름에서 슬라이드의 위쪽 가장자리에 더 낮은 가장자리 coverslip에 장착 미디어 존재를 허용 하 고 슬라이드의 각 우물의 읽기를 방해할 수 있는 기포 형성을 최소화 한다.참고: 최소 압력 커버 슬라이드는 슬라이드에 탑재 하는 사용 되어야 한다. 모든 초과 압력 덮개 미 끄 러 짐의 측면 이동을 발생할 수 있습니다. 이 왜곡 셀 및 결과의 단층 준비에 손상을 일으킬 수 있습니다. 2-8 ° c.에 어둠 속에서 슬라이드 저장 최대한 빨리 그들은 탑재 또는 48 h 이내 슬라이드를 검사 합니다.참고: 더 이상 저장 패턴 및 형광 신호 저하 될 수 있습니다. 4입니다. 긍정적이 고 부정적인 결과의 식별 어두운 방에 있는 FITC 필터 세트를 사용 하 여 형광 현미경 슬라이드를 볼. 200 X 또는 큰 양성에 대 한 최종 해석 하 고 패턴의 확대에 형광 현미경 특정 밝은 녹색 형광에 대 한 검사 합니다. 긍정적이 고 부정적인 컨트롤을 관찰 합니다.참고: 긍정적인 컨트롤 (그림 2A, 동종) 핵에 밝은 녹색 형광을 표시 됩니다. 부정적인 통제 없음 특정 녹색 형광 형광 현미경 아래 표시 됩니다. 각 잘에 대 한 긍정적/부정적 결과 기록 하 고 긍정적인 경우 아나 패턴을 포함 합니다.

Representative Results

간염-2 엘리트/DFS70 코 기판 고전적인 아나 패턴을 유지 하 고 DFS70 패턴의 명확한 구별을 용이 하 게: 전통과 조작 셀 형 간염-2 엘리트/DFS70 고 기판에는 동일, LEDGF/p75 제외한 모든 autoantigens 보존 합니다. 키트에 의해 제공 하는 부정적인 제어 기준 형광 신호를 설정 합니다. 형 간염-2 엘리트에 균질, 얼룩 덜 룩 한, centromere, nucleolar, 그리고 미토 콘 드 리아 패턴에 대 한 긍정적인 컨트롤 기존의 형 간염 2 IIF 기판 (그림 2A)에 예상된 패턴을 동일한 패턴을 생성합니다. 이러한 참조 패턴 각 패턴의 항 원 및 질병 협회 함께 상세히에서 설명 되었습니다 이전4,29. 표 1에 그림 2A 에서 관찰 된 패턴에 대 한 간략 한 설명이 제공 됩니다. 형 간염-2 엘리트에 DFS70 패턴: 각 셀의 약 10% 잘 보여 고밀도 미세 얼룩 덜 룩 한 패턴 (ICAP 명명법을 할당: AC-2) 그 interphase 핵에 관찰 될 수 있다와 mitotic 핵 (그림 2B)에 본은 chromatin 관련 얼룩. 기존의 형 간염 2 기판에 모든 셀이이 패턴 DFS70 긍정적인 샘플 반응 때 할 것 이다. 형 간염-2 셀의 나머지 ~ 90% 기 절 LEDGF 항 원 인코딩 psip1 유전자 있고 따라서 신호 또는 패턴 monospecific DFS70 긍정적인 세럼 (그림 2B)와 반응 하는 때를 생성 하지 않습니다. 형 간염-2 세포의 10%에 DFS70 패턴 및 셀 현재 추가 패턴 (예를 들어, 잘 얼룩 덜 룩 한 또는 nucleolar)의 나머지 부분에 해당 하는 밝은 형광 있다면 혼합된 패턴의 존재를 나타냅니다. 이러한 패턴의 가까이 시험 DFS70 패턴 이외에 존재 하는 모든 autoantibody 특이성을 확인 필수적 이다. 형 간염-2 엘리트 기판, 샘플으로 만든 세라의 패널의 기능을 보여 주기 위해 DFS70와 아나의 다양 한 농도 세라를 제어 하 고 기존에 테스트 및 형 간염-2 엘리트 기판 표준 IIF를 사용 하 여 프로토콜 (그림 3 , 그림 4, 그림 5, 그림 6, 그림 7). DFS70 Monospecific와 기존의 고 형 간염-2 엘리트 기판에 혼합된 반응의 해석: 각 특정 질병 관련 된 아나 패턴 (그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6, 그림 7), monospecific 아나 왼쪽에 대부분 열 패턴 및 monospecific DFS70 맨 오른쪽에 패턴 관찰할 수 있습니다. 중간에 3 열 다양 한 질병 관련의 비율 및 DFS70 패턴 긍정적인 컨트롤을 나타냅니다. 결과 혼합된 패턴은 (그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6, 그림 7, 맨 위 행) 기존 형 간염 2 기판에 분별을 도전. 그러나, 대부분의 예제를 소설 형 간염-2 엘리트 기판 셀 수정 되지 않은 및 설계 강도에 차이 별개 (때 밝은 덜 밝은 셀의 비율을 뿐만 아니라 DFS70 신경의 존재를 확인 1:9) 하지만 또한 보조 아나 패턴을 보여준다. 균질 DFS70 또는 얼룩-DFS70 혼합 반응, 자신 있게 다양 한 추가 분석 (그림 1A)를 실행 하는 실험실에 이르게 올바른 패턴을 예측할 수는. Centromere-DFS70 및 nucleolar DFS70 혼합 반응, DFS70 양성은 매우 도전적인 의심 (그림 5, 그림 6). Nucleolar 및 세포질 망상/의학 반응, DFS70 패턴은 지배적인 세라 비율 50%에 도달할 때까지. 모든 예에서 형 간염-2 엘리트 기판 DFS70 패턴을 제시할 수 있습니다 고 강도의 넓은 범위 기본 보조 패턴 레벨 따라서 더 정확한 아나 해석을 용이 하 게 한다. 에 밀접 하 게 혼합된 패턴, 아나 고 DFS70 긍정적인 컨트롤 했다 확대 (그림 8) 모두 기존의 고 형 간염-2 엘리트 기판의 다양 한 50: 50 조합에 대 한 결과 관찰 합니다. 그것은 interphase와 mitotic 얼룩 해석 및 보고 된 패턴의 정확도 향상을 형 간염 2 기판에 DFS70를 포함 하 여 모든 아나 패턴에 대 한 관찰을 권장 합니다. 그러나, 혼합 패턴, 세포 핵을 나누어 제시 차동 패턴 정확한 해석을 용이 하 게 하기에 충분 하지 않을 수 있습니다. 빨간색 화살표 (그림 8) 설계와 기존의 셀에 mitotic 핵을 나타냅니다. 그것은 혼합 반응 셀 분할에 준수 하지 않는 DFS70 질병 관련 된 해석에 대 한 규칙의 설립된 세트와 함께 애 나 패턴을 관찰할 수 있습니다. 노란색과 파란색 화살표 수정 되지 않은 (DFS70 KO) 형 간염-2 설계 된 세포 핵, 각각 나타냅니다. 모든 조합 (그림 8), 분명 강도 차이가 수정 되지 않은 세포 핵 얼룩 (~ 10%)와 조작된 세포 핵 (~ 90%) 패턴 같은 현미경 시야에서 관찰, 동시 상영을 가능 하 게 하 고 DFS70 패턴의 확인입니다. 그림 1: 아나 기존의 형 간염-2 고 형 간염-2 엘리트/DFS70 코 IIF 메서드를 사용 하 여 알고리즘을 심사. (A) 회로도 unravels 심사 단계 (노란색 음영된 지역)에서 monospecific 및 혼합된 DFS70 긍정적인 패턴 식별에서 기존의 형 간염 2 IIF의 결핍 및 질병 관련 보조 아나 패턴을 배제 하지 못하는 수 있습니다 DFS70 패턴에 의해 감춰 될. 또한, 현재 세대의 DFS70 특정 단단한 단계의 확실 한 분석은 아나 스에 대 한 추가 확인 테스트에 이르게 monospecific DFS70 양성 확인 수 없습니다. (B) 회로도 아나 스, monospecific 및 혼합된 DFS70 반응의 동시 구별의 심사에 대 한 형 간염-2 엘리트의 기능을 보여 하 고 단단한 단계 DFS70에 대 한 필요성을 없애 확인 분석 실험. 크게 형 간염-2 엘리트를 사용 하 여 알고리즘 아나 심사 간소화 되 고 확인 분석 실험의 필요한 수를 감소 시킨다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2: 클래식 애 나 및 DFS70 패턴 형 간염-2 엘리트/DFS70 고 기판에. (A) 형 간염-2 엘리트/DFS70 고 기판 고전적인 아나 패턴 유지. 고전적인 균질 반응 및 DFS70 긍정적인 반응 키트에서 제공 하는 긍정적인 컨트롤을 사용 하 여 생산 되었다. 다른 반응 얼룩 덜 룩 한, centromere, nucleolar, 그리고 세포질 망상/의학 반응5에 대 한 이전 설립된 긍정적인 제어 세라를 사용 하 여 제작 했다. (B) 형 간염-2 엘리트/DFS70 고 기판 설계와 기존의 셀, DFS70 패턴의 쉬운 구별을 용이 하 게 제공 합니다. 회로도 결과 DFS70 monospecific 반응 패턴 interphase에 얼룩이 기존의 고 설계 (DFS70-KO) 셀에 대 한 세포 핵을 나누어 보여 줍니다. 설계 형 간염-2 세포는 일반적으로 기존의 형 간염 2 기판에 DFS70 autoantibody 반응에 의해 은폐 보조 패턴의 동시 탐지를 가능 하 게 LEDGF/p75/DFS70 항 원 없는. 화살표 (노란색) mitotic 세포 핵의 예를 나타냅니다. 스케일 바 대표 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3: DFS70와 조합에 균질 세라. DFS70 monospecific 세라 다양 한 비율 (100:0, 80:20, 50: 50과, 및 0:100)에 긍정적인 균질 패턴 제어와 결합 하 고 기존의 고 설계 (DFS70-KO) 형 간염-2 기판에서 테스트 했다. 스케일 바 대표 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4: DFS70 세라 조합에 얼룩 및. DFS70 monospecific 세라 다양 한 비율 (100:0, 80:20, 50: 50과, 및 0:100)에 긍정적인 얼룩 덜 룩 한 패턴 제어와 결합 하 고 전통과 설계 (DFS70-KO) 형 간염-2 기판에서 테스트 했다. 스케일 바 대표 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5: 조합에서 DFS70 및 centromere 세라. DFS 70 monospecific 세라 다양 한 비율 (100:0, 80:20, 50: 50과, 및 0:100)에 긍정적인 centromere 패턴 제어와 결합 하 고 전통과 설계 (DFS70-KO) 형 간염-2 기판에서 테스트 했다. 스케일 바 대표 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 6: DFS70와 함께에서 nucleolar 세라. DFS 70 monospecific 세라 다양 한 비율 (100:0, 80:20, 50: 50과, 및 0:100)에 긍정적인 nucleolar 패턴 제어와 결합 하 고 기존의 고 설계 (DFS70-KO) 형 간염-2 기판에서 테스트 했다. 스케일 바 대표 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 7: DFS70와 조합에 세포질 망상/의학 세라. DFS70 monospecific 세라 다양 한 비율 (100:0, 80:20, 50: 50과, 및 0:100)에 긍정적인 미토 콘 드 리아 패턴 제어와 결합 하 고 기존의 고 설계 (DFS70-KO) 형 간염-2 기판에서 테스트 했다. 스케일 바 대표 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 8: 혼합 패턴 (50: 50 비율) 기존에 생산 고 형 간염-2 엘리트 기판. 두 기판 사이의 차이 계시 했다. 빨간색 화살표는 두 기판 설계와 기존의 셀에 mitotic 핵을 나타냅니다. 이러한 조합에 대 한 기존의 형 간염-2 기질에 세포 핵을 나누어 제시 차동 패턴 혼합된 패턴의 정확한 해석에 대 한 충분 하지 않습니다. 세포 분열에 혼합된 DFS70 반응 수 교란 질병 관련 된 해석에 대 한 규칙의 설립된 세트 애 나 패턴을 관찰할 수 있습니다. 노란색과 파란색 화살표 수정 되지 않은 (DFS70 KO) 형 간염-2 설계 된 세포 핵, 각각 나타냅니다. 모든 조합에 대 한 얻은 결과 설계 기판에 테스트: 분명 강도 차이에 속하는 interphase 핵 패턴 수정 되지 않은 셀 (~ 10%)와 조작된 셀 (~ 90%)은 관찰, 활성화 동시 검색 및 DFS70 패턴의 확인 스케일 바 대표 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 아나 패턴 설명 균질 전체 핵 fluoresces 확산 얼룩 패턴으로 균등 하 게. 얼룩 이산, 얼룩의 벌금 굵고 핵에 걸쳐 형광. 미세 얼룩 덜 룩 한 하 고 거친 얼룩 덜 룩 한 패턴 설명 되었습니다. Nucleolar nucleoli 핵 내의 여러 고체 또는 얼룩 덜 룩 한 시체로 얼룩. 하위 이전 설명 했습니다. Centromere 한정 된 수의 큰 얼룩입니다. 반응 항 원 세포 유사 분열을 겪고 있는 압축 된 염색체와 분리. 세포질 망상/의학 세포질은 미토 콘 드리 아의 긍정적인 얼룩과 세분화 된 나타납니다. DFS70 •Conventional 형 간염-2 셀: 고밀도 미세 얼룩 덜 룩 한 패턴 mitotic 핵에 볼 얼룩 interphase 핵 chromatin 관련에 관찰. •Engineered DFS70 코 셀: 안티-DFS70 항 체 생산 부정적인 얼룩이 지기 형 간염-2 엘리트 DFS70 코 / 약 1:9 비율에, 기존의 고 설계 (DFS70 KO) 세포. 기존의 셀 전형적인 DFS70 패턴을 생성 하 고 조작된 셀 DFS70 monospecific/절연의 긍정적인 반응으로 반작용 하는 때 부정적인 패턴을 생성. 표 1: 아나 패턴의 설명.

Discussion

신경 핵 및 세포질 항 원에 있습니다 높은 조직 자기 면역 질병. IIF 형 간염-2 조직 자기 면역 질병²^,^,³⁴ 에 대 한 매우 민감한이 고 비용 효율적인 심사 방법으로 널리 간주 아니 단일 분석 결과 제공 하지만 최상의 가능한 감도 특이성, . 50 그 해 동안 IIF 프로토콜의 보급에도 불구 하 고 IIF 분석 결과의 정확도 매우 기술자, 프로토콜의 각 단계와 잘 관리를 사용 하 여 결과의 정확한 해석의 주의 실행의 기술에 의존 형광으로 현미경 조직 자기 면역 질병의 진단 하지 형 간염-2 IIF 같은 단일 혈 청 학적인 시험의 결과에 따라 한다.

높은 품질을 사용 하 여 시 약의 재구성 (소 주/이온), 표준화 된 키트 구성 요소 (슬라이드 형 간염-2 셀 monolayers와 샘플 희석제, 긍정적이 고 부정적인 컨트롤, 미리 희석된 최적화 FITC-공액, 장착 매체)의 사용 결과에 긍정적인 영향을 미칠. 웰 스에 컨트롤 추가 예제를 건너뛰는 허위 부정적인 해석 격려 수 있습니다. 언제 든 지 슬라이드의 건조 후 샘플 또는 컨트롤의 추가 artifactual 거짓 긍정적인 반응 그리고/또한 부적당 한 패턴에 발생할 수 있습니다. 슬라이드에 너무 많은 워시 버퍼 왼쪽 또는 아티팩트가 발생할 수 있습니다 설치 매체의 분배 이전 슬라이드 우물의 건조. 매체를 장착 하거나 배치는 coverslip 이전 슬라이드 표면에 거품 생성의 부족 한 수량을 추가 하는 것은 흐리거나 초점 현미경 관찰 될 때 보이는 반응 귀 착될 수 있다. 탑재 된 슬라이드 2-8 ° C에 저장 하 고 false 네거티브 또는 artifactual 결과 최소화 하기 위해 시간 권장된 창 내에서 분석 해야 합니다.

적절 한 LED/Hg/크 세 논 빛 소스와 깨끗 한 광학 부품이 손상 되지 여기 및 방출 필터 등을 잘 피 형광 현미경을 사용 하 여 하는 것이 정확한 IIF 결과 얻기 위해 중요 합니다. 최종 사용자 차별 긍정/부정적 반응 농도 및 패턴의 해석에 대 한 훈련은 중요 합니다. 형 간염 2 IIF 분석 실험 절차, 현미경 구성 및 최종 사용자 교육 또는 기술 표준화의 부족으로 취약 하다. 합의 명명법과 대표 패턴 및 다양 한 제조 업체를 사용 하 여 인수 하는 이미지의 예 수에 의해 만들어집니다 ICAP () 교육 목적⁴. 형 간염-2 셀 패턴 분류 트리 ICAP에 의해 제공 하는 다양 한 핵, 세포질, mitotic 패턴에 대 한 다양 한 패턴 연습을 쌓지 않은 눈⁴와 비슷한 보일 수 있습니다 사이의 미묘한 차이 배울 수 귀중 한 자원 이다. 면역 상태와 뚜렷한 협회 부족 DFS70 도전 패턴의 기본 예의 하나 이며 이전 섹션에서 설명한 대로이 패턴은 매우 건강 한 인구⁵에서 유행 이다.

연구에 따라 안티-DFS70 신경의 보급 달라 건강 한 동료 애 나 심사 인구, 그리고 아나 긍정적인 개인 조직의 자가 면역 질환⁹^,¹⁶^,^{20의 증거와} ^,^,³⁰³¹. DFS70 신경 절연 뿐만 아니라 다른 질병 관련 된 아나 패턴 발생 보고 되었습니다. 절연 또는 monospecific DFS70 패턴 건강 한 컨트롤의 2-22%에서 하지만 자가 면역 류 마티스 질환³²케이스의 1% 미만에서 보고 됩니다. 이러한 추세에 따라, DFS70 모노-긍정적인 패턴 ICAP 위원회³^,^,³¹³²에 의해 면역 류 마티스 질환에서 제외 하는 조건으로 제안 했다. Autoantibody 테스트 명명법의 조화 및 애 나 보고 하는 동안 DFS70 양성을 보고 권장 형 간염 2 IIF 결과의 해석에 설립 ICAP 위원회 검사 결과⁴.

배제 DFS70 모노-양성 기반 조직 자기 면역 질병, 이전 현재 심사 및 확인 방법 (특히 DFS70에 대 한 그 특정)의 상태를 검토 생명 이다. DFS70 형 간염 2 IIF 및 단단한 단계의 확실 한 분석 즉 ELISA 양성, CLIA, 및 선 immunoassay/점 오 점 방법 사이 계약) 다양 한 연구¹³^,^,²²²⁵^,^{33 사이 널리 다양}. 이 불일치에 기여 하는 매개 변수 왔다 IIF 해석 및 확실 한 분석 결과 이전⁵^,¹³^,³⁴을 논의 했다. 안티-DFS70 항 체 확인에 대 한 최근 제안 된 immunoadsorption 접근 (DFS70)에 대 한 일부 현재 단단한 단계의 분석 실험의 결함을 해결 하지만 의심된 샘플에 IIF 절차에서 추가 단계를 수행 하는 연구소는 결과¹³보고 비용과 처리 시간을 증가 시킵니다. 형 간염-2 엘리트/DFS70 코 셀 루틴 아나 심사에 대 한 사용 하는 경우이 추가 단계가 필요 하지 않습니다. 이 전체 비용 고 또한 처리 시간에 영향을 주지 않습니다 DFS70 패턴은 초기 심사에서 분별²⁷단계입니다. 기존의 형 간염 2 IIF 메서드를 사용 하 여 추가 단점은 공동 발생 다른 아나 패턴 심사 단계에서 DFS70 패턴을 구별할 수는 것입니다. 그러나,이 불리는 형 간염-2 엘리트/DFS70 코 셀²⁷의 사용에 의해 극복 된다.

기존의 형 간염-2와 새로운 조작된 형 간염-2 (형 간염-2 엘리트/DFS70 코) 아나 긍정적인 컨트롤 사용 및 그들의 조합 모노-긍정적인 DFS70 제어와의 비교 평가 동시에 새로운 기판의 능력을의 유틸리티 설명 아나 스 화면 하 고 DFS70 패턴 (그림 1)를 확인 합니다. 새로운 기판에 대 한 IIF 프로토콜은 기존의 형 간염 2 IIF 메서드를 동일 합니다. 모든 질병에 관련 된 아나 패턴에 대 한 해석 체계는 DFS70 패턴 (표 1)를 제외 하 고 동일 합니다. 모노-긍정 및 혼합 DFS70 패턴의 해석 상대적으로 쉽게 새로운 메서드를 사용 하 여 고 추가 분석 (그림 1B)를 보증 하지 않습니다. 임상 실험실에서이 새로운 방법의 구현 DFS70 패턴의 해석 연관 도전을 간소화 하 고 질병 관련 추가 공개 애 나 패턴에 의해 은폐 이전 심사 아나의 전반적인 정확도 향상 DFS70 (혼합 패턴)입니다.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리 감사 앤드류 젱 IIF 실험을 수행 하 고 이미지를 수집.

Materials

HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240
ANA positive control	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
DFS70 antibody positive control	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240
Negative control	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan's blue counterstain	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Buffer diluent for serum	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Phosphate buffered saline (PBS)	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Mounting medium	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Coverslips	Trinity Biotech	part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch	Trinity Biotech	part of kit# 1103, 1103-240
Name	Company	Catalog Number	Yorumlar
Materials used in the study but not provided by the kits
Diagnostic fluorescent microscope	Nikon Eclipse 50i		Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1
Incubation chamber	Trinity Biotech		provided for customers (no catalog #)
Coplin jar	n/a		General labware
Paper towels	n/a		General lab supplies
distilled/deionized water	n/a		General lab supplies

Referanslar

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Etiketler

ANA Screening HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate Monospecific DFS70 Pattern Mixed DFS70 Pattern Indirect Immunofluorescence Assay Antinuclear Autoantibodies Homogeneous Speckled Pattern Quality Control Substrate Slide Preparation Sample Incubation Well Cross-contamination Autoimmune Disease

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Bu Makaleden Alıntı Yapın

Malyavantham, K. S., Suresh, L. Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate. J. Vis. Exp. (131), e56722, doi:10.3791/56722 (2018).