Autoanticorps DFS70 imitent les modèles associés à la maladie d’anticorps antinucléaires communs faisant une interprétation exacte difficile lors de l’utilisation des substrats classiques de HEp-2. Le protocole décrit les avantages du nouveau substrat machiné de HEp-2 sur HEp-2 conventionnel à ANA de dépistage et de distinguer DFS70 modèles avec confiance élevée en monospécifiques et mixtes cas positifs de l’ANA.
Auto-immune systémique du tissu conjonctif est caractérisé en faisant circuler des anticorps antinucléaires (ANA). Bien qu’il existe plusieurs technologies pour ANA dépistage, immunofluorescence indirecte (IFI) en utilisant des substrats de (HEp-2) 2-cellules humaines épithéliales reste la méthode primaire et recommandée en raison de sa sensibilité supérieure. HEp-2 substrats peuvent détecter une multitude de motifs découlant de la consolidation de l’auto-anticorps à divers antigènes de protéines et acides nucléiques répartis dans le noyau et le cytoplasme des cellules. La grande diversité des modèles mixtes résultant de réactions positives sur HEp-2 aussi de monospécifiques et compliquer l’interprétation et la justesse de l’information. Un exemple concret qui a récemment reçu une attention plus grande est la dense fine 70 (DFS70) moucheté résultant des auto-anticorps qui se lient spécifiquement à une protéine appelée facteur de croissance dérivé l’épithélium lentille (LEDGF). Absence de relation claire avec une maladie auto-immune systémique spécifique ainsi qu’une prévalence élevée dans les populations en bonne santé ont fait une interprétation exacte du modèle DFS70 important. Distinction précise du motif de DFS70 partir de motifs associés à la maladie en utilisant des substrats classiques de HEp-2 est un défi. En outre, cooccurrence fréquente du motif DFS70 avec motifs associés à la maladie comme modèles homogènes, mouchetés et mixtes homogène-moucheté compliquer l’interprétation de l’IIF. L’objectif de cet article est de démontrer que l’utilité d’un roman conçu substrat HEp-2 IIF qui conserve tous les avantages du substrat de HEp-2 conventionnel tout en offrant la capacité de distinguer le modèle DFS70 avec une confiance élevée dans les deux monospécifiques et mixtes exemples positifs de l’ANA. Le nouveau substrat est davantage capable de démasquer des ANA associés à la maladie, précédemment masquées par DFS70 modèle.
ANAs sont une caractéristique de de maladies auto-immunes médiation systémique du tissu conjonctif1. Plusieurs méthodes sont employées pour le dépistage et confirmation de l’ANAs. Technique de l’IIF en utilisant les restes de substrat de HEp-2 le plus couramment utilisé et recommandé fréquemment procédé de criblage ANAs1,2. Malgré les progrès réalisés dans les méthodologies de test diagnostique de phase solide comme dosage immunoenzymatique (ELISA), immunoenzymatique (EIA), immuno-essai de chimiluminescence (CLIA) et analyses multiplexes perle, IIF de HEp-2 est la plus répandue projection méthode en raison de son utilité diagnostique et coût efficacité1,2,3. Les technologies de test susmentionné s’appuient sur un ensemble limité de native purifiée ou des antigènes recombinants, considérant que les préparations de monocouche de cellules HEp-2 sur les puits de lame de verre présentent une grande variété d’antigènes sous leur forme naturelle, répartis sur le noyau et le cytoplasme, qui réagissent avec les auto-anticorps du sérum du patient ou des contrôles positifs, ce qui entraîne une multitude de modèles qui sont associées à diverses maladies auto-immunes. Ces modèles sont classés en figures mitotiques, cytoplasmiques et nucléaires basés sur la localisation de l’antigène dans les cellules. Chaque motif et l’antigène/antigènes associés et états pathologiques sont bien caractérisés4. Dans la méthode de l’IIF, sérum de patient et contrôle est incubés sur les puits de lame de verre qui présentent une culture monocouche de cellules HEp-2 convenablement fixés pour préserver une multitude d’auto-antigènes dans leur configuration naturelle. Les autoanticorps dans les sérums de patients ou des contrôles positifs sont autorisés à lier les auto-antigènes présentés par les cellules HEp-2 sur le substrat (lame de verre bien) durant l’incubation. Après incubation, anticorps non fixés sont lavés au loin et les anticorps de classe IgG sont détectés avec conjugué anti-human IgG réactif de fluorescéine/fluorescéine isothiocyanate (FITC). Déclaré-conjugué non lié est éliminé et les lamelles de verre sont montées au sommet de la glisse à l’aide d’un support de montage qui préserve les réactions et facilite l’observation sous un microscope à fluorescence. Réactions sont observées sous un microscope à fluorescence équipé avec combinaison de filtre d’excitation-émission appropriés configuré selon le journaliste utilisé (pour journaliste FITC, un microscope diagnostic généralement utilise des filtres avec gamme d’excitation de 467 -498 nm et une gamme d’émissions de 513-556 nm). La présence d’ANA est démontrée par une fluorescence verte vif de structures spécifiques dans les cellules. Contrairement aux plateformes de test automatisé, méthodologie de l’IIF se fonde sur le laborieux processus de série diluant les sérums et la visuelle détermination positive de le les colorations qui oblige l’utilisateur importante expertise5,6. Malgré ces limites, IIF de HEp-2 reste le plus largement utilisé et recommandé de méthode pour le dépistage des Ana grâce aux efforts de normalisation vers nomenclature et interprétation du modèle par le consensus International sur ANA Comité de patrons (PICA), augmentation de la disponibilité des solutions d’automatisation pour le traitement des diapositives IIF et résultat interprétation3.
Parmi la multitude de modèles détectées par la méthode IIF HEp-2, autoanticorps ciblant le produit du gène psip1 (également dénommé p75/LEDGF/DFS70), ont acquis des intérêts importants dans ces dernières années pour plusieurs raisons4,5 ,6,7,8,9,10. DFS70 auto-anticorps sont présents dans des titres élevés chez les témoins sains, et études ont jusqu’à présent pas réussi à démontrer une association clinique distincte pour la présence de DFS70 autoanticorps7,8,9 ,10,11,12,13. Les taux de résultats positifs des autoanticorps DFS70 dans divers états pathologiques et les cohortes de santé variées entre études6,8,9,10,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Le modèle monospécifiques DFS70 est bien différencié d’un modèle homogène ou moucheté, mais l’interprétation de modèles mixtes de homogène-moucheté et anticorps anti-DFS70 qui s’avec autres ANAs est difficile même pour les lecteurs experts. La génération actuelle de IIF dépistage des méthodes et des essais de phase solide spécifique DFS70 n’est pas capable de différencier un monospécifiques DFS70 réaction de modèles mixtes (Figure 1 a, jaune ombrée de l’algorithme). Une mauvaise interprétation du modèle DFS70 comme homogène, moucheté, ou modèle mixte ou vice versa, peut-être avoir des répercussions graves sur les soins aux patients. Le protocole actuel couramment utilisé est le suivant : les laboratoires cliniques utilisent un certain nombre de tests de confirmation en phase solide pour ANAs associés à la maladie ou d’une méthode d’immunoadsorption pour DFS70/LEDGF lorsque l’amende dense moucheté (AC-2) modèle est suspectée (Figure 1 a)4,5.
Ce protocole vise à démontrer l’utilité d’un roman conçu substrat IIF HEp-2 (HEp-2 ELITE/DFS70 knockout (KO), sera considérée comme ELITE HEp-2) qui conserve tous les avantages de HEp-2 classiques de dépistage ANAs tandis que simultanément distinguer DFS70 patron avec une confiance élevée en monospécifiques et mixtes ANA cas positifs (Figure 1 b, jaune ombrée de l’algorithme)5. Substrat de HEp-2 ELITE est composé d’un mélange approximatif de non modifiés les cellules HEp-2 et machinés cellules dépourvues de p75/LEDGF/DFS70 antigène dans le ratio de 1:95. La procédure de l’IIF pour ELITE HEp-2 est identique à la méthode conventionnelle de HEp-2. La configuration unique du substrat de HEp-2 ELITE non seulement conserve tous les avantages de HEp2 classiques mais peut différencier les modes de réaction homogène, moucheté et mixtes du modèle DFS70 à l’examen initial ou l’essai d’un échantillon (Figure 1 b )5. Le sérum du patient à faire réagir sur des lames avec substrat IIF HEp-2 doit être dilué 01:40 avec dilution de dépistage ou selon le critère de chaque laboratoire. Une réaction spécifique à 01:40 ou titre supérieur est considéré comme positive.
Dans cette étude, les sérums positifs pour centromère homogène, moucheté, nucléole, cytoplasme réticulaire/AMA et motifs DFS70 qui produit un signal positif de support (par rapport à la contrôle négatif et le positif ANA contrôle fourni par le kit) lors du dépistage dilution de 01:40 ont été sélectionnés pour simuler les modèles mono spécifiques et mixtes sur des substrats de HEp-2 (classiques et ELITE HEp-2). Le 01:40 dilué DFS70 sérums positifs ont été mélangés à 01:40 de dilutions d’individuelles associés à la maladie ANA mires de contrôles (homogène, moucheté, centromère, nucléole, ou cytoplasmique réticulaire-AMA) dans différents ratios (contrôle : DFS70 à 100 : 0, 80/20, 50/50, 20 : 80 et 0 : 100) et évaluées sur conventionnel et substrats de HEp-2 ELITE suite à procédure IIF standard décrite ci-dessous.
Les anticorps antigènes nucléaires et cytoplasmiques sont très répandues dans les maladies auto-immunes systémiques. Bien qu’aucun test unique ne fournit le meilleure possible sensibilité et la spécificité, IIF de HEp-2 est considéré comme une méthode de dépistage très sensible et très rentable pour les maladies auto-immunes systémiques2,3,4 . Malgré la prévalence du protocole IIF depuis plus de 50 ans, précision du dosage de l’IIF est fortement tributaire de la compétence du technicien, exécution minutieuse des différentes étapes du protocole et interprétation exacte des résultats à l’aide d’un bien entretenu microscope à fluorescence. Diagnostic d’une maladie auto-immune systémique ne devrait pas reposer sur les résultats d’un seul test sérologique par exemple IIF de HEp-2.
Reconstitution des réactifs à l’aide de haute qualité de l’eau (distillée), l’utilisation de composants normalisés (diapositives avec monocouches de cellules HEp-2, de diluant, contrôles positifs et négatifs, préalablement dilué conjugué FITC optimisée et milieu de montage) avoir un impact positif sur les résultats. L’ajout de contrôles ou échantillons à sauter sur les puits peut encourager les fausses interprétations négatives. L’évaporation de diapositives à tout moment après que l’ajout de l’échantillon ou contrôle peut provoquer des réactions faussement positives artéfactuelle et/ou inappropriés patterns. Trop tampon de lavage à gauche de la diapositive ou séchage des puits de la diapositive avant la dispensation du milieu de montage peut entraîner des artefacts. Ajout d’une quantité insuffisante du support de montage ou en générant des bulles sur la surface avant de placer une lamelle peut entraîner des réactions qui semblent floues ou floue lorsque observé au microscope. Diapositives montées doivent être conservés entre 2 et 8 ° C et analysés dans la fenêtre recommandée de temps à minimiser les résultats faussement négatifs ou artéfactuelle.
En utilisant un microscope épi-fluorescence bien entretenu qui abrite une source lumineuse de LED/Hg/Xenon appropriée et nettoyer optiques composants y compris les filtres d’excitation et d’émission qui ne sont pas endommagés est essentielle pour obtenir des résultats exacts de IIF. Formation pour discriminant des intensités de réaction positive/négative et l’interprétation des modèles de l’utilisateur final est critique. Les dosages de IIF HEp-2 sont vulnérables au manque de normalisation dans les procédures, de configuration de microscope et de formation pour l’utilisateur final ou de compétences. Les modes de nomenclature et de représentant de consensus et les exemples d’images obtenues à l’aide de divers fabricants sont mis à disposition par le PICA () pour des fins éducatives,4. Un arbre de classification de modèle cellulaire de HEp-2 fourni par ICAP pour divers modèles nucléaires et cytoplasmiques mitotiques est une précieuse ressource pour apprendre les différences subtiles entre les différents modèles qui peuvent ressembler aux yeux inexpérimentés4. Parmi les principaux exemples d’un modèle stimulant est le DFS70 qui manque également une liaison distincte avec une affection auto-immune, et tel que discuté dans les sections précédentes ce modèle est très répandu dans des populations saines de5.
Selon l’étude, la prévalence des anticorps anti-DFS70 varient entre les cohortes sains, ANA dépistage des populations et des individus positifs ANA sans aucun signe de maladie auto-immune systémique9,16,20 ,30,31. Autoanticorps DFS70 ont été signalés à se produire dans l’isolement, ainsi qu’avec d’autres modèles de ANA associés à la maladie. Isolées ou monospécifique DFS70 modèle est signalée dans 2-22 % des sujets sains, mais en moins de 1 % des cas avec la maladie rhumatismale auto-immune32. Basé sur ces tendances, modèle mono-positifs DFS70 a été proposé comme critère d’exclure dans les maladies auto-immunes rhumatismales par ICAP Comité3,31,32. Le Comité du PICA, établi pour promouvoir l’harmonisation de la nomenclature de test auto-anticorps et interprétation des résultats de l’IIF HEp-2, recommande DFS70 positivité de déclaration tout en relevant de l’ANA dépistage résultats4.
Avant d’exclure une maladie auto-immune systémique basée sur DFS70 mono-positivité, il est essentiel d’examiner l’état des méthodes actuelles de dépistage et de confirmation (en particulier ceux spécifique pour DFS70). Accord entre la positivité de l’IIF HEp-2 et des essais de confirmation de phase solide à savoir ELISA DFS70, CLIA et ligne immuno-essai/dot blot méthodes) varie entre diverses études13,22,25,33 . Interprétation de l’IIF et essai confirmatoire paramètres qui contribuent à ce désaccord ont été discuté précédemment5,13,,34. Une approche d’immunoadsorption récemment proposée pour la confirmation des anticorps anti-DFS70 aborde certaines des lacunes des tests actuels en phase solide (pour DFS70), mais oblige les laboratoires à effectuer une étape supplémentaire dans la procédure de l’IIF sur des échantillons suspects, qui augmente le temps de coût et délai d’exécution pour avoir signalé les résultats13. Cette étape supplémentaire n’est pas requise lorsque les cellules HEp-2 ELITE/DFS70 KO sont utilisés pour le dépistage de routine ANA. Cela réduit le coût global et plus il n’y a aucun incidence sur le délai d’exécution que DFS70 modèle est perçu dans la présélection n’étape27. Un inconvénient supplémentaire d’à l’aide de la méthode conventionnelle de IIF HEp-2 est qu’il est incapable de distinguer le modèle DFS70 qui s’avec d’autres ANA patrons à l’étape de la présélection. Toutefois, cet inconvénient est surmonté par l’utilisation de cellules HEp-2 ELITE/DFS70 KO27.
Évaluation comparative des classiques HEp-2 et la nouvelle ingénierie HEp-2 (HEp-2 ELITE/DFS70 KO) à l’aide de témoins positifs ANA et leurs combinaisons avec un contrôle de DFS70 mono-positif, démontrent l’utilité de la capacité du nouveau substrat à simultanément dépister les ANAs et confirmer le motif DFS70 (Figure 1). Le protocole de l’IIF pour le nouveau substrat est identique à la méthode conventionnelle de IIF HEp-2. Schéma d’interprétation pour tous les associés à la maladie des ANA est identique à l’exception du modèle DFS70 (tableau 1). Interprétation des modèles DFS70 mono-positif et mixtes a été relativement facile à l’aide de la méthode nouvelle et elle ne garantit pas des essais supplémentaires (Figure 1 b). Mise en œuvre de cette nouvelle méthode en laboratoire clinique simplifie le défi associé à l’interprétation du modèle DFS70 et améliore la précision globale de l’ANA, dépistage en révélant davantage associés à la maladie, ANA modèles précédemment masquées par DFS70 (mélangé d’habitudes).
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Andrew Zenger pour effectuer les expériences de l’IIF et de collectionner des images.
HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240 | |
ANA positive control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
DFS70 antibody positive control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240 | |
Negative control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan's blue counterstain | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Buffer diluent for serum | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Mounting medium | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Coverslips | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch | Trinity Biotech | part of kit# 1103, 1103-240 | |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Materials used in the study but not provided by the kits | |||
Diagnostic fluorescent microscope | Nikon Eclipse 50i | Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1 | |
Incubation chamber | Trinity Biotech | provided for customers (no catalog #) | |
Coplin jar | n/a | General labware | |
Paper towels | n/a | General lab supplies | |
distilled/deionized water | n/a | General lab supplies |