Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Lucas Moritz Wiggenhauser; Katharina Kohl; Nadine Dietrich; Hans-Peter Hammes; Jens Kroll

doi:10.3791/56674

JoVE Journal > Medicine

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Tıp

לומד סוכרת דרך העיניים של דג: Microdissection, ויזואליזציה, וניתוח tg(fli:EGFP) למבוגרים להערכת רשתית דג זברה

Published: December 26, 2017

doi:

10.3791/56674

Lucas Moritz Wiggenhauser¹, Katharina Kohl², Nadine Dietrich², Hans-Peter Hammes², Jens Kroll¹

¹Department of Vascular Biology and Tumorangiogenesis, Center for Biomedicine and Medical Technology Mannheim (CBTM), Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University, ²V. Medical Clinic, Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University

Özet

כאן, אנו נדון פרוטוקול השיטה אשר יאפשר ניתוח קל של להערכת רשתית דג זברה למבוגרים tg(fli:EGFP) כמו read-out מהירה בהגדרות של פתולוגיות וסקולרית לטווח ארוך קשורה neoangiogenesis ושינויים מבניים.

Abstract

רטינופתיה סוכרתית הוא הגורם המוביל לעיוורון בקרב מבוגרים בגיל העמידה. השכיחות העולה של סוכרת ברחבי העולם יגרום למניעת סיבוכים microvascular סוכרתית אחד משדות המחקר מפתח של העשורים הבאים. טיפול מיוחדים, ממוקד, תרופות טיפוליות חדישות נדרשים לנהל את מספר גדל והולך של חולים בסיכון של אובדן ראייה. דג זברה היא מודל חיה הוקמה לשאלות מחקר התפתחותי עם הגדלת רלוונטיות עבור מידול תהליכי מחלה מטבולית multifactorial. היתרונות של המין מאפשרים ויזואליזציה אופטימלית וסמים תפוקה גבוהה הקרנת גישות, בשילוב עם יכולת חזקה לדפוק את הגנים של עניין. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול אשר יאפשר ניתוח קל של להערכת רשתית דג זברה למבוגרים tg(fli:EGFP) כמו read-out מהירה בהגדרות של פתולוגיות וסקולרית לטווח ארוך קשורה לנזק neoangiogenesis או כלי קיבול. זו מושגת באמצעות ניתוח של הרשתית דג זברה שלם-הרכבה של הרקמה. ויזואליזציה של כלי חשוף ואז מבוצעת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של הכתב EGFP ירוק לידי ביטוי להערכת ברשתית למבוגרים. הטיפול הנכון של הרקמה יוביל לתוצאות טובות יותר ופחות שבירה כלי פנימי כדי להבטיח את הפריט החזותי של מבנה כלי הדם שההודעה. יכול להיות מנוצל השיטה במודלים דג זברה של הרשתית vasculopathy קשורה לשינויים כלי האדריכלות, כמו גם neoangiogenesis.

Introduction

סוכרת היא מחלה מטבולית שהוגדרו על-ידי היפרגליקמיה הנובע הפרשת האינסולין לקוי או לקוי רקמת תגובה לאינסולין המופרש. העולמי מעריך כי מבוגרים 422 מיליון היו לחיות עם סוכרת 2014¹ , השכיחות של סוכרת ברחבי העולם צפוי לגדול ל 8-10% מהאוכלוסייה עד מלאך², הפיכת סוכרת אחד של השדות המחקר מפתח במשך עשרות שנים. לחיות עם סוכר דם גבוה כרוני מוביל microvascular סיבוכים ארוכי טווח, כולל רטינופתיה סוכרתית, כלייתית פולינוירופתיה. הניהול ואת מניעת סיבוכים אלה קשים; אכן, סוכרת הופך להיות הגורם השכיח ביותר של קצה הבמה מחלת כליות (ESRD), מה שמוביל דיאליזה², וסוכרת היא הגורם המוביל לעיוורון בקרב מבוגרים בגיל העמידה³.

הסיבות הראשונית של נזק microvascular בעין סוכרתית הן היפרגליקמיה כרונית, שינויים מטבוליים, כמו גם גורמי סיכון מסוימים (למשל, יתר לחץ דם, dyslipidemia), המוביל אל תפקוד אנדותל כלי הדם, pericyte הנשירה, ו רגרסיה נימי שתוצאתו שרוולים כלי הדם acellular. איסכמיה ברשתית וכתוצאה מכך הוא הגורם כורוידאלית, חדירות כלי דם מוגברת קידום התפתחות proliferative רטינופתיה סוכרתית (PDR)⁴. רטינופתיה סוכרתית זוהה בדרך כלל 37% של חולי סוכרת, בעוד סכנת הראייה רטינופתיה סוכרתית היה לקביעה 12% ממוסך עוקבה אירופאי לבן המחקר UKADS⁵. הטיפול הנוכחי יכולים רק למנוע סיבוכים, והוא לא מסוגל לשחזר במלואה את הנזק כבר המושרה. Photocoagulation Panretinal, בנוסף הבקרה הגליקמית, הוא הטיפול הסטנדרטי עבור proliferative רטינופתיה סוכרתית (PDR) אבל משפיע גם הרקמה הבריאה סמוכים. אנטי-VEGF התערבויות מראים תוצאות מבטיחות כחלופות לייזר טיפול⁶^,⁷, אבל בסופו של דבר, טיפול מיוחדים, ממוקד, תרופות חדשות יש צורך לנהל את המספר הגדל והולך של חולים בסיכון של אובדן ראייה.

הדגמים מבוססת מחקר בבעלי חיים של רטינופתיה סוכרתית אופטימיים כל היבט של פתופסיולוגיה אנושי. ניצול של המין הנכון כדי לטפל הדרישות הספציפיות של שאלת המחקר המדעי הוא אחד החלקים הכי משמעותי של ההתקנה ניסיוני. העובר דג זברה (רזבורה rerio) כבר נעשה שימוש נרחב מחקר התפתחותי ומספק את הרקע המעשי אופטימלית של תמונות ציפורים או נוקאאוט גנים ספציפיים באמצעות morpholinos או טכניקה CRISPR/Cas9⁸. ניתן להשתמש בשיטות אלה בקלות דג זברה לחקור גנים, אשר זוהו על ידי מחקרים האגודה ברמת הגנום בקנה מידה גדול (GWAS), יצירת תובנות מנגנון מסוים של התקדמות המחלה, הרגישות⁹. בזמן קצר דורי כמויות גדולות של הצאצאים, קל ו טיפול בעלות נמוכה, גוברת התמיכה assay הגדילו את הרלוונטיות של המודל דג זברה, במיוחד לאור הפוטנציאל הגדול עבור מידול המחלה המטבולית. שימור מנגנונים ביולוגיים דג זברה הוכח כבסיס לפיתוח טיפול תרופתי. לדוגמה, antidiabetic התרופה מטפורמין ו סימבסטטין להורדת כולסטרול הוכחו “לטפל” תנאים במודלים של מחנה/דקסמתזון-induced גבוהה PEPCK כולסטרול וביטוי היפרכולסטרולמיה דיאטה-induced¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹². זו תובנה לקידום מקיף שנשמרת מנגנונים מטבוליים נוספים נתמך על ידי המספר הגדל והולך של מודלים סוכרת דג זברה, באמצעות ניסויים כגון: לסירוגין הדגירה בפתרונות גלוקוז, Streptozotocin-induced אבלציה של תאי הבטא, בתיווך nitroreductase תאי בטא אבלציה באמצעות של מטרונידזול prodrug, סוכרת monogenic מתווכת באמצעות נוקאאוט גנטי pdx1 או נוקאאוט, כמו גם מודלים של עמידות לאינסולין מוגבר בשרירי השלד ¹². אלה כבר הקים פרוטוקולים, הפרטים שהוזכרו לעיל של המין, ומדגימים היכולת לטפל ביעילות את הגנום במספר רב של דוגמאות כל היתרונות דג זברה לימוד המנגנון נהיגה מחלות מורכבות, כמו גם היכולת עבור התערבויות תרופתי מסך.

הבנה כללית של האנטומיה עין דג זברה בסיסי (איור 1) יש צורך בניתוח על מנת לנצל את דג זברה כמודל עבור angiopathy ברשתית. העין דג זברה יש שישה extraocular השרירים rectus ארבע, שני השרירים המלוכסן להוסיף בצד החיצוני של כדור הארץ-sclera¹³. הקרנית רקמה שקופה מכסה העדשה, ממשיך ישירות לתוך בסקלרה, המהווה את המעטפת החיצונית של העין. Sclera שאינם שקופים, יש משטח המשקף האור באופן חלקי, הוא פיגמנט חזק. העדשה עצמה היא יותר בצורת כדור מאשר המקבילה האנושית. הרשתית מורכב משלוש שכבות הגרעין של תאים עצביים בזמן מתן חמצן להערכת ברשתית קשורה קשר הדוק השכבה תא גנגליון הפנימית אבל לא בצורת רשת subretinal. כלי חיבור, לעומת זאת, לשקר sclera ועד רשתית, משויכים ברשתית פיגמנט האפיתל (RPE). רשת הנימים זו מספקת חמצן החלקים החיצוניים של הרשתית¹⁴.

איור 1: תיאור סכמטי של העין דג זברה בוגרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

פשוט ויזואליזציה של להערכת ברשתית יכולה להיות מושגת על ידי ניצול של קו דג זברה מהונדס tg(fli:EGFP)¹⁵. חלבון פלואורסצנטי ירוק, הביע תחת השליטה promotor כאשר שגיא בתאי האנדותל של להערכת הוא הבסיס עבור הפריט החזותי באמצעות מיקרוסקופ בשלבים מאוחר יותר סורק לייזר. זו מושגת באמצעות ניתוח של הרשתית דג זברה שלם-הרכבה של הרקמה. מודל הטרנסגניים זה מספק readout וסקולרית מהר ללא כל יישום של תיוג קרישה תוך-כלית או אימונוהיסטוכימיה כולה-הר. כדי לנתח רטינופתיה סוכרתית, דג זברה, תרגיל הכנה צעד אחר צעד, מתוקננת אמור להיות בשימוש בכל בניתוח.פרוטוקול הכנה הבאים מספק קבוצות מחקר אחרים את האפשרות בקלות להעריך שינויים בכלי הדם בכלי חשוף של העין דג זברה בוגרת ולספק הדרכה להקים ברוטינת לנתיחה ממוטב עבור הרשתית דג זברה.

Protocol

בכל ההליכים, לרבות הפעולות הקשורות לנושאים בעלי חיים, אושרו על ידי ועדת האתיקה חיות (Regierungspräsidium קארלסרוהה), עקוב אחר ההנחיות טיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת היידלברג. 1. הכנת מקבע (4% מחברים/PBS) להכין מקבע טריים כל יום כדי להבטיח אופטימלית שימור רקמת היסטולוגית. להמיס 0.2 גר’ נתרן הידרוקסידי (NaOH) 90 מ”ל מים מזוקקים כפול (ddH2O) תוך כדי ערבוב כל הזמן בטמפרטורת החדר. להוסיף 4 g paraformaldehyde (PFA) ומערבבים עד הפתרון ברור לחלוטין למשך לפחות 5-10 דקות כדי להבטיח depolymerization של מקרומולקולות.התראה: PFA רעיל, לטפל. להמיס 0.84 גר’ נתרן dihydrogen פוספט (NaH2PO4) הפתרון ושליטה pH-7.2 באמצעות מדידה. להתאים את עוצמת הקול כדי 100 מ ב- ddH2O ולסנן את הפתרון באמצעות נייר סינון ציון 3. לאחסן 4% מחברים/PBS על קרח. 2. הכנת פתרון המתת חסד הערה: השלבים הבאים נעשו עם זן פראי-סוג דג זברה ABTL בגיל כללי של 6-8 ב’. השתמש 3-aminobenzoate אתיל מתאן סולפונאט, גם בשם “tricaine” או MS-222, ריכוז של 0.31 מ”ג/מ”ל על המתת חסד דג זברה16. לנצל מים ביצה x 1, נהגנו לגדל דג זברה עוברי, כמו ממס עבור הפתרון המתת חסד. באופן כללי, לשלוט העומק הרדמה הנכונה לפני עבודה עם דגים מסומם על ידי הפגנת אובדן שיווי משקל, לגעת התגובה לאובדן. כדי להשיג 1,000 מיליליטר 10 x ביצת מים, להוסיף מלחים אלה 1,000 מ ל מים מזוקקים כפול (ddH2O) תוך כדי ערבוב כל הזמן לפי הסדר הבא: 10 גרם NaCl, 0.3 גרם אשלגן כלורי, 0.4 g CaCl2 *6-אייץ ‘2O, g ב- 1.32 MgSO4 *6-אייץ ‘-2O. 3. קיבוע של רקמות דג זברה להעביר 6 מ ל 4% מחברים/PBS פתרון עבור דגימה הבארות של לוחות שש-ובכן מראש. המתת חסד של דג זברה למבוגרים (בעבר נשמר במחזור רגיל אור-יום, למשל, ח’: 12 12 שעות) 2 h אחרי האורות להפעיל בבוקר, על-ידי הצבתם הפתרון tricaine ולחכות עד שהם הגיעו המתת חסד. בעקבות הפסקת התנועה opercular, אשר יכול לקחת עד 10 דקות. . קח את הדג מהאגף הפתרון המתת חסד tricaine ושם אותם על מגבות נייר טריים. יבש את הדגים ולהשתמש אזמל לחתוך את ראשי מאחורי operculum (ראה איור 2 א). להעביר את ראשי ישירות לתוך הצלחות טוב שיהיו, אשר מכילים את מקבע המוכנים באופן טרי. חנות הלוחיות טוב המכיל את ראשי דגים ב 4 ° C ללילה לפחות 24 שעות להבטיח מקבע את חודר ועליית ברשתית.הערה: ניתן לאחסן ראשי דג זברה לתקופה מקסימלית של 48 שעות 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 4 ° C לפני ההכנה ללא הפסד הרלוונטיים של עוצמת האות זריחה. השהיית מוגבר יכול להוביל לאובדן רקמת מופחתת איכות תמונה ו ולכן יש להימנע. 4. הכנת להערכת רשתית דג זברה למלא צלחת פטרי עד שליש מחוממת 2% agarose, להמתין עד אגר המשרד. מכסים את צלחת אגר עם PBS 1 x כדי ליצור סביבת עבודה כדי לנתח את העיניים.הערה: זה יאפשר הן שימור הכנה פינצטה ולחץ נמוך על הרקמה תוך כדי לנתח, להפחית את הסבירות של הנזק המבני. כל הצעדים הכנה נוספת צריכה להתבצע בסביבת עבודה זו ניצול #5 מלקחיים ישר עם טיפים בסדר תחת מיקרוסקופ ויבתר עם אפי-תאורה נוספים. תוך כדי לנתח, השתמש הגדלה בין 4.0 x ו- 6.0 x כדי לאפשר סקירה וגם הערכת המעייפת של הרקמה. להעביר את הדגימה קבוע הפטרי ו, על ידי החזקת הראש על פני לחתוך עם פינצטה אחת, להוסיף עוד פינצטה מוצמדת-יחד מתחת גלגל העין חלל מסלולית. לאט לאט פתח את פינצטה מתחת לעין אחיזה עצב הראייה, ואז בזהירות לקרוע, לנתק את העיניים (איור 2B). איור 2: הסרה של עין דג זברה בוגרת. מבט צד הקרנית עם העין עדיין בתוך חלל מסלולית של עצב הראייה תקין (א). מבט צד הקרנית בעין מנותק (B). תיאור סכמטי של העין דג זברה בשלב זה (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. להסיר כל אחד את rectus ארבעה ואת שני השרירים extraocular המלוכסן המחוברים עדיין העין, כמו גם שרידי רקמת extraocular מתחבר העין חלל מסלולית (להשוות איור 3 ו- 4 באיור). להשיג זאת על ידי מעכבים את העין באמצעות פינצטה עצומות למחצה, כשתפסת את המבנה עם פינצטה אחרים, ברכות תעתיקו אותו עם תנועה פשעים נגד. מאז מרתק של גלגל העין ישירות שמוביל כלי הפנימיים שבירה, טכניקה זו היא עדינה כראוי כדי לשמר את להערכת. איור 3: עין דג זברה למבוגרים עם שרירים extraocular בפוקוס. נוף רוחבי עם קובץ מצורף של שריר extraocular הטבעת החיצונית הימנית של גלוב עינית בפוקוס (א). עצב הראייה צפה מהצד עם extraocular שרירים סימטרית איגוף עצב הראייה (B). תיאור סכמטי של העין דג זברה בשלב זה (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. השתמש מחט חד פעמית G 27 (0.4 x 19 מ מ) כדי לנקב את הקרנית (איור 4C, חץ אדום) במטווח החיצוני. דרך פתח זה להחזיק את הקרנית עם פינצטה שתי ו מעט תקרע את זה פתוח. לאחר מכן בעיון לפעול כדי ליצור קרע ממורכז. בערך בגודל של התלמיד בהתאמה. איור 4: עין דג זברה בוגרת לאחר ההסרה של כל השרירים extraocular. נוף רוחבי עם השפה החיצונית שנוקה של העינים כדור הארץ גלוי (א).עצב הראייה צפה מהצד עם עצב הראייה באמצע. בסקלרה משקפים אור לא מכסה את כל האזור סביב העצב (קו מקווקו אדום) (B). תיאור סכמטי של העין דג זברה בשלב זה (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. הפעילו לחץ על הצד הקרנית של הגלובוס עינית (bulbus החוגי) בקצה הקרנית החיצוני מעל הקשתית. זה ליצור שקע קטן ולדחוף את העדשה לגובה של הקרע הקרנית. הפעל את הפינצטה תחת עדשת ולהסיר אותו (איור 5A). איור 5: עין דג זברה בוגרת בתהליך של הסרת העדשה. מבט צד הקרנית עם העדשה דחף דרך דמעה הקרנית (א). מבט צד הקרנית עם העדשה לצד העולם עינית (B). תיאור סכמטי של העין דג זברה בשלב זה (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. הפעל העין הפוך כדי עצב הראייה בפני החוקרת. שימו לב כי sclera קרנית מחוברים ויוצרים את הטוניקה סיביים של הנורה העין כדי להגן על הרשתית בצורת גביע. (איור 6). מעטפת זו, הכוללת הקרנית בסקלרה, נקראת גם “corneosclera” ו ויתירים החוצה האזור סביב עצב הראייה (איור 4B, קו מקווקו אדום). להוסיף מחט זו הפסקה פעם אחת כדי ליצור פתח לבין sclera הרשתית. איור 6: Corneosclera המורכב בסקלרה ו הקרנית, שבו הוא מתנתק הרקמה תוך-עיני הנותרים. מבט צד הקרנית מציג את ההמשך של הקרנית שקופה לתוך sclera פיגמנט (א). נוף רוחבי התמקדו חלק scleral corneosclera (B). תיאור סכמטי של corneosclera הסיר (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. באמצעות גישה זו עם שני פינצטה, בזהירות לקרוע את sclera axially פסים כדי להגדיל את הפתח סביב עצב הראייה. יש להקפיד לשמור את corneosclera שלמות המעבר היקף צד הקרנית (ראה איור 6A). להחזיק את sclera עם פינצטה אחד ו, על ידי גרירה עצב הראייה עם האחר, להתרחק, להסיר את corneosclera מן העין בשלמותו והן תוכנו (איור 6). נסה לנתק קשרים לפני להפריד את corneosclera ואת הרקמה הנותרת תוך-עיני, כמו קובץ מצורף מבנים אחרים תהיה נקודה קריטית; שלב זה יספק מבנה דמוי ספל המורכב uvea של הרשתית המכילות את להערכת ברשתית (איור 7). ליצור קרע בשכבה RPE/חיבור מאת מחזיק מחט 27G הצידה אל הכוס הנותרת תוך כדי גירוד המשטח החיצוני עם השפה של קצה המחט. להשתמש העלתה נקודת גישה תשתלט על השכבה חיבור/RPE ואת לקרוע אותו. עם פינצטה שני פסים, אבל לשמור על החיבור כדי הקשתית ללא פגע. לאחר מכן, הפעל פינצטה אחד תחת הקשתית, להסתובב במעגל מבחוץ תוך יצירת מתח על ידי משיכת בשכבת חיבור/RPE שייצורם הופסק כדי להשיג את הניתוק של מבנה משולב.הערה: הקשתית יש לנתק, כדי לא להפריע את פלורסצנטיות בעודכם מדמיינים את כלי הדם (איור 8 ב’). תופס את הקשתית ישירות כדי להסיר אותו יכול לגרום נזק נרחב כלי, במיוחד בזמן המעגל הפנימי אופטיים (IOC), מאז הקשתית. עדיין מחוברת הרקמה שמסביב. השכבה חיבור ברשתית פיגמנט האפיתל (RPE) ניתן להפריד, לעתים קרובות לשמור על חיבור לאיריס, מה שמאפשר עבור קלה להסרה משני. אם לא ניתן להסיר חלקים של הקשתית, לנצל את נקודת שבירה טבעי שהעין דג זברה בוגרת המוצגים בתוך השכבה קולט אור (PL), באופן דומה לשלב 4.9, כדי להסיר את הקשתית. לגרד מעל החלק החיצוני של הרשתית בצורת גביע הנותרים כדי לגרום discontinuations של השחקן מעל לנקודת השבירה (איור 11C, חץ שחור). השתמש הגישה שנוצר כדי להסיר את החלק העליון של השכבה תוך שמירה על אפשרות לקשר הקשתית ללא פגע. לאחר מכן, הפעל את הפינצטה תחת הקשתית, להסתובב במעגל, כפי שהוזכר קודם לכן כדי לנתק את מבנה משולב.הערה: כדאי לאמן סבלנות כמו השלב כל 4.9 יכול להיות קשה, אבל הטיפול הזה תוכלו להשיג תוצאה כלי הדם טוב יותר מאשר אבר המין הגברי תופס את הקשתית השפה של התלמיד או אילוץ פתיחה על ידי השמדת חיבורים חיבור/RPE או שכבת קולט אור ללא הסרת המתאימים שלהם. בעקבות צעד זה לכן לשמור על תקינות כלי הדם ברשתית, אלא להוביל לנזק של השכבות החיצוניות ברשתית. איור 7: עין דג זברה בוגרת לאחר הסרת corneosclera. נוף רוחבי של מראה הרקמה תוך-עיני הנותרים עם איריס, עצב הראייה תקין (א). מבט צד הקרנית עם איריס בפוקוס (B). תיאור סכמטי של העין דג זברה בשלב זה (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. השימוש microdissection מעיין מספריים עם קצה חיתוך ישר 2.5 מ”מ לחתוך את עצב הראייה קרוב ככל האפשר אל הרשתית; זה יאפשר יותר שטוח-הרכבה של הרקמה. איור 8: עין דג זברה בוגרת לאחר הסרת RPE/דמית העין ואת עצב הראייה קטום. מבט צד עצב הראייה מראה הרשתית עם עצב הראייה קטום (א). מבט צד הקרנית עם מבט ישיר אל השכבה הפנימית ביותר של הרשתית (B). תיאור סכמטי של העין דג זברה בשלב זה (C).אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 5. הרכבה של להערכת רשתית רחץ הרשתית גזור פעמיים במשך 5 דקות ב- 1 x PBS. כדי להעביר הרשתית לאחר חיתוך של עצב הראייה, לנצל את מרית מעבדה עם קצה הכפית מיקרו כדי למנוע טיפול ישיר של הרקמה חשופה. מקום טיפה של PBS על זכוכית ולהעביר הרשתית לתוך ה-droplet. השתמש פינצטה כדי לשמור את הרקמה במקום בזמן שקצץ את מבנה דמוי ספל עם איזמל ליצירת צורה במול פטאל-ארבע או חמש-כותרת בהתאם לגודל ברשתית (ראה איור 9). לספוג את שאריות מגניב עם חתיכת נייר. יש להיזהר לא לגעת הרשתית. מעיל הרשתית רכוב שטוח הרכבה מדיה, לכסות עם coverslip. להיות קשוב לא ליצירת קצף, בועות אוויר יכולה לעוות ויזואליזציה של כלי ברשתית. למזער את תנועת coverslip, לסגור את המכסה עם לק ברורה. 6. ויזואליזציה של להערכת רשתית לשמור על הפער בזמן בין הכנה קצר ככל האפשר להפחית את אובדן פירוט התמונה באמצעות קרינה פלואורסצנטית אובדן אות חזותי. חנות שנותן מוכנים להערכת רשתית ב 4 ° C כדי להפחית את אובדן אות, אם לא ניתן להשיג פריט חזותי ישיר, השפלה של איכות תמונה לאט לאט הופך גלוי 48 שעות לאחר ההכנה. דמיינו שנותן להערכת ברשתית באמצעות מיקרוסקופ זריחה או לייזר קונפוקלית סריקה.הערה: כלי ויזואליזציה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ הושג ב 2.5 x הגדלה עם זמן של חשיפה של 2.0 s, רווח של 6.0 x וגמא הגדרות של 1.67. עבור, מיקרוסקופיה קונפוקלית Ar-לייזר (488 ננומטר/20 mW) בעוצמה 20% היה מנוצל בשילוב עם מסנן עירור TD 488/543/633, 20 x / 0.7 נה המטרה טבילה מרובה עם ddH2O טבילה מדיה, וכן הגדרות מסנן פליטה של 505-560 ננומטר. תמונות קונאפוקלית מורכבים של 4 x 4, 4 x 5 או 5 x 5 תמונות יחיד משולב באמצעות סריקת אריח בהתאם לגודל ברשתית. 7. הוא מקטעים של הרשתית דג זברה הערה: עבור מקטעים הוא של הרשתית דג זברה, להכין את הרקמות כמפורט בפרוטוקול עד שלב 4.5, לאחר מכן לדלג ישירות אל שלב 7.1. לשטוף את העיניים enucleated (לאחר שלב 4.5) שתי פעמים למשך 5 דקות ב- 1 x PBS. לאחר מכן, להעביר את הרקמה לתוך 70% אתנול (EtOH). בשלב זה, ניתן לאחסן העיניים מוכן ב 4 ° C עד פרפין הטבעה. לשטוף את הרקמה בדרך הבאה מייבשים אותו לפני פרפין הטבעה: 2 x 15 min ב- 80% אתנול, 2 x 15 min ב- 90% אתנול, 3, פרק 15 min ב- 96% אתנול, 3, פרק 15 min ב- 99% אתנול, 2 x 15 דקות acetone/99% אתנול (1:2), 3, פרק 15 min באצטון. שמור את הרקמה פרפין ב 62 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לחמם פרפין טריים עד 62 ° C ויוצקים אותו לתוך תבניות הטבעה. להעביר את הרקמה לתוך התבניות ישירות, בקצב, בקרת הכיוון הנכון של העיניים מסחרר עבור המקטע הרצוי. לאחר מכן, החלים על קלטת ההטבעה על עובש לכסות עם פרפין נוספים מחוממת. הסרת התבניות ההטבעה לאחר פרפין בלוקים קיררה.. חותכים את הפרפין ב מיקרוטום למקטעים 10 מיקרומטר ולממן אותם החוצה על אמבט מים 45 ° C על פני המים די זמן לשטח לחלוטין. לתפוס את הסעיפים על משטח זכוכית ולנקז אותם אנכית כדי להסיר את המים העודפים לפני ייבוש אותם בן לילה בתנור ב 45 º C. תהליך הסעיפים נוספת עם לוח הזמנים הבאים כדי deparaffinize, הכתם הוא: 4 x 1 דקות ב- xylol, 1 x 1 דקות ב- 99% אתנול, 1 x 1 דקות ב- 96% אתנול, 1 x 1 דקות ב- 80% אתנול, 1 x 1 דקות ב- 70% אתנול, 1 x 1 דקות ב- ddH2O, 1 x 4 דקות ב hematoxylin של מאייר , עונה 1 פרק 10 min ב- ddH2O, 1x2min ב eosin 0.5%, 1 x 30 s ב- ddH2O, 1 x 30 s ב- 80% אתנול, s ב- 96% אתנול 2 x 30, 3 x 1 דקות ב- 99% אתנול, ו 1 x 1 דקות ב- xylol. קח את שקופית מזכוכית שלא xylol ולכסות במהירות את הרקמה עם טעינת מדיה. להימנע לתת את הרקמה להתייבש לחלוטין, ואז במקום של coverslip על העליונה, לאטום את הרקמה מוכתם.

Representative Results

כאן נדגים שתי דוגמאות להערכת רשתית בדג זברה tg(fli:EGFP) למבוגרים מורפולוגי טיפוסי: פעם דמיינו עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (איור 9 א) ופעם אחת עם לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (איור 9B). מבנה הרשתית חשף מציג תבנית מאורגן. Autofluorescence חזק נתפסת ברשתית דג זברה, כאשר visualized עם מיקרוסקופ זריחה. לפיכך, ויזואליזציה של רק את שכבת כלי הדם באמצעות סריקת קונאפוקלית מומלץ להפחית קרינה פלואורסצנטית רקע ולהגדיל את הניגודיות. עבור רכישת התמונות מהר יותר או מצבים נתונים איכותי איפה מספיק, הוא המיקרוסקופ פלורסצנטיות חלופה אטרקטיבית. איור 9: תמונות נציג של tg(fli:EGFP) למבוגרים דג זברה להערכת ברשתית. שתי דוגמאות להערכת ברשתית מורפולוגי טיפוסי מוצגים: העורק המרכזי מתפשט לתוך כלי ראשי 5-7, אשר הסניף ואז לתוך רצף של אולמות. כל כלי נוסף לנקז לתוך הווריד במבניו (CV) מגביל את החלק החיצוני של כל עלה כותרת. הדמיה באמצעות מיקרוסקופ זריחה ב- 2.5 x הגדלה (א). ויזואליזציה של להערכת הרשתית על ידי לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ דרך בשילוב 5 x 5 תמונה בודדת אריח סריקה (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. העורק חודר הרשתית בראש עצב הראייה, רוב דגימות, מתפשט לתוך כלי ראשי 5-7 (איור 10A). כלי ראשי אז הסניף לתוך רצף של אולמות ולהתחבר למעגל הפנימי אופטיים (IOC), המכונה גם את הווריד במבניו (CV), המקיפות את הדיסק אופטיים בפריפריה של הרשתית הנטען שטוח (ראה איור 10 ב’). הוועד האולימפי הוא הכלי ורידים זה מנקז דם עורקי על השפה הפנימית של כדור הארץ עינית (bulbus החוגי). להערכת רשתית דג זברה מציגה גם תחומי פעילות כלי הדם גבוהה עם הסתעפות של נימים, האנגיוגנזה הלבלוב (איור 10C). זו פעילות כלי הדם בעיקר ממוקם בסמיכות ליד הוועד האולימפי. חשוב לשים לב כי אותה העין יכולים להדגים שתי פעילויות גבוה ונמוך כלי הדם באזורים שונים של הרשתית (השווה איור 10 ב’ ואת דמות 10C). באופן כללי, להערכת רשתית של דג זברה מראה יותר מקום avascular נימים פחות בין הענפים העיקריים אם בהשוואה, לדוגמה, הרשתית של עכברים17. צריך להיות מנותח בשתי העיניים של כל מדגם כי להערכת עשויים להשתנות בין פיקוח יחיד יכול להוביל הטיה. איור 10: יוגדל תחומי tg(fli:EGFP) למבוגרים דג זברה להערכת ברשתית ויזואליזציה. העורק הסתעפות לתוך כלי הראשי (א). נימים הרשתית באזור של פעילות כלי הדם נמוך חיבור למעגל אופטיים הפנימי (IOC) בחלק התחתון של התמונה (B). נימים הרשתית באזור של פעילות כלי הדם גבוהה מתחבר הוועד האולימפי (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. ארכיטקטורת והתפאורה מאוד של שכבות עצביים כבר נמצא דג זברה מ כ 72 h פוסט הפריה (hpf)18ואילך. הרשתית דג זברה בוגרת מציג את השכבות הבאות מבפנים החוצה (איור 11): שכבת תאים גנגליון (שזכתה), השכבה הפנימית plexiform (IPL), השכבה הפנימית גרעינית (להיכנס), השכבה החיצונית plexiform (OPL), השכבה החיצונית גרעינית (גרת), שכבה קולט אור (PL), רשתית פיגמנט האפיתל (RPE). הערכת פרמטרים כלי הדם של הרשתית להערכת ויזואליזציה מוצג באיור12. להערכת ברשתית הפנימי ממוקם על הרובד תא גנגליון (שזכתה) (איור 13 ב’, לבנה) בעת חיבור נימים יהיה משוייך ברשתית פיגמנט האפיתל (RPE). איור 11: הוא מכתים של העין דג זברה בוגרת. סקירה כללית של חתך הרוחב של העין כל לאחר הסרת העדשה (א). שכבות הרשתית של דג זברה למבוגרים העין19 (B). חיווי (חץ שחור) נקודת השבירה טבעי ב- PL (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

מודלים של היפוקסיה-induced neoangiogenesis ברשתית הצג מספר רב יותר של נקודות הסתעפות, האנגיוגנזה נבטים, השטח הכולל כלי דם וירידה מרחק intercapillary דג זברה²⁰. ממצאים אלה תומכים לרעיון כי דג זברה היא חשופה סיבוכים microvascular סוכרתית²¹, הממצאים העיקריים של רטינופתיה סוכרתית מאוחר יותר לכלול בתיווך היפוקסיה neoangiogenesis, חריפה המקושר לביטוי VEGF. היפרגליקמיה-induced שינויים ברשתית דג זברה להוביל עובי מוגברת של כלי אבל לשמור על הכולל תכנים²². לסירוגין טבילה גלוקוז פתרונות עבור 30 ימים גם מקטין את העובי של IPL ו להיכנס²³. השפעת ישירה של מטבוליטים גלוקוז בדג זברה כמו מטבולית חסידי vasculopathy גם כבר הוצגה. Hyperbranching כלי דם נוספות נצפתה ב להערכת תא המטען של דג זברה העוברים לאחר דגירה עם methylglyoxal²⁴. כרגע, יש אין במודל חיה אשר מספקת את כל הקריטריונים המרכזיים של רטינופתיה סוכרתית. שינויים מוקדם נמצאים לעתים קרובות, אך סדר רטינופתיה סוכרתית proliferative חסרה²⁵. דג זברה נופל גם הגדרה זו, כאמור רק בתיווך היפוקסיה neoangiogenesis או היפרגליקמיה-induced שינויים עד עכשיו. הממצאים הנוכחיים תתמכו כי דג זברה רגישים לשינויים בכלי הדם בתיווך היפרגליקמיה, כמו במודל חיה פוטנציאלי עלול להציג התקדמות כדי proliferative רטינופתיה סוכרתית. בהתאם כוח חשיפה האפקט בתיווך היפרגליקמיה, שהמודל הניסויי נכון יכול להוביל איסכמיה באזורים מסוימים של הרשתית דג זברה ולקדם neoangiogenesis כמו הקריטריונים המרכזיים של רטינופתיה סוכרתית המקדימות. עם זאת, כמו דג זברה הוא שחקן חדש וזהובה בתחום מידול פתולוגיות microvascular לטווח ארוך, סוכרת הקרובה במודלים דג זברה לספק מידע נוסף, להבהיר את החשיבות שלו בכל הנוגע דגמים אחרים, שלהם פתולוגיות. לדוגמה, בצלב של דג זברה tg(gata1a:DsRed) עם אריתרוציטים מתויג אדום לתוך הקו tg(fli:EGFP) יכול לשמש בו זמנית להמחיש לפרקים תוך-עיני פוטנציאלי בעתיד מודלים דג זברה מציג microaneurysms כמו מנבא של סדר PDR.

מאז להערכת ברשתית מתקדמת לתוך רצף של אולמות, הערכת המרחק intervascular, מספר נקודות הסתעפות ואת שטח כלי הדם קשורים המרחק מ העורק המרכזי. כדי למנוע הטיה בפרמטרים של כלי הדם המוערך, נדרשת נקודת אוריינטציה. הוועד האולימפי הוא מבנה כזה והוא רלוונטי מאז תחומי פעילות כלי דם משקרת בסמיכות המרחבית ישירה. להערכת עקבית, הסריקה הרשתית צריך להיות מחולק מספר מקטעים תמונה מלבנית עם מרחק עקבי כדי הוועד האולימפי. הרשתית כולו צריך להיות מנותח ומופץ תמונות מספרית באופן סימטרי. הרשתית דג זברה מציגה אזורים עם צפיפות נימי גבוה ונמוך, שוויונית של התמונה מקטעים יכול להוביל הטיה נוספים.

איור 12: מצגת דוגמה של פרמטרים וסקולרית readout להדמיות להערכת ברשתית. מדידה של המרחק intervascular (חץ כפול אדום) ליד הראייה הפנימית להקיף בעיגול (IOC) (א). שלוש נקודות הסתעפות (עיגולים אדומים) ליד של הוועד האולימפי הבינלאומי (B). ויזואליזציה של דג זברה להערכת ברשתית עם שטח מוגדלת (התיבה האדומה) מציג כלי נבטי (C). קוטר הכלי מודדים מרחק מסויים (חץ כפול הלבן) של עורק מרכזי (צלב לבן) (D). צפיפות כלי הוא האחוז של אזור ברשתית שנכבשו על ידי בשכבת-על כלי (קווים אדומים אלכסוני) (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כדי למדוד את המרחק intervascular, אחד צריך מוגדר מרחק מסויים הוועד האולימפי כסטנדרט (איור 12A, חץ כפול הלבן), צייר קו אופקי דמיוני (איור 12A, קו לבן אופקי) מקביל הוועד האולימפי. המרחק בין כלי בקו זה הוסיף את, arithmetically בממוצע שווה למרחק intervascular. נקודות הסתעפות נספרים בתוך כל תמונה בכל פעם קיבול מפצלת ולהמשיך לומן כלי דם אחד או יותר מתוך נקודת המוצא. זה כולל גם חיבורים אופקי בין נימים. חשוב להישאר עקבי עם ניתוח ולהחליט אילו נקודות הסתעפות לספור ולשמור על כללים אלה לאורך כל הניסוי כולו כדי להפחית וריאציה מיותרת. לבלוב וסקולרית, כפי שמתואר ב- 12C איור, הינו פרמטר נוסף שאפשר לסמוך על כל תמונה כדי להעריך את ההשפעה על להערכת ברשתית. נבטים אנגיוגנזה לא בצע כמו ארקייד הירושה בין עורק מרכזי, הוועד האולימפי הבינלאומי ונוחות ליד החלקים החיצוניים של הרשתית. כדי להעריך קטרים כלי מסוים, נקודת כיוון שתמיד צריך ממנו מרחק קבוע מסמן את המדידה ספוט. המקור של העורק המרכזי בתוך הרשתית מספק כזה הדרכה עבור כלי גזע הראשי (איור 12D, לבן צלב). האזור שנכבש על ידי כלי (איור 12E, קווים אדומים אלכסוני) כאחוז של האזור ברשתית כל צפיפות כלי הדם, בעקיפין המתייחס לאזור avascular.

צריך להיות מורכבת קונאפוקלית סריקה מלאה של דוגמא אחת מהתמונות גבוהה לפרטים מרובים כדי לאפשר ויזואליזציה של hypersprouting נימי קטן. כדי למטב את זמן ומשאבים על שלב זה, יש להשתמש בהליך tilling אוטומטי עם עומק הסריקה כללי עבור כל אריח. הרכבה לא אחידה של הרשתית ניתן להגדיל באופן משמעותי את הזמן כדי לסרוק את להערכת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. בגישה אופטימלי אחד רוצה לסרוק רק את שכבת כלי הדם (איור 13 ב’, לבנה), אבל חלקית הכללת שזכתה יש לעיתים קרובות צורך.עוזבים את אורך עודף של עצב הראייה אחרי חיתוך, כמו גם את הקיצוצים כדי להשיג את שטוח-הר נמוך מדי, יכול להוביל הרכבה לא אחידה.

איור 13: השוואה של הוא מכתים autofluorescence ברשתית דג זברה בוגרת. להערכת ברשתית בפוקוס מעל שזכתה (א). להערכת ברשתית (לבנה) מראה ירוק אות EGFP, רשתית שכבות המציגות ביריד חזקה autofluorescence (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הכנת להערכת רשתית דג זברה תקין צריך הכשרה מוקדמת, גודל מדגם קטן עם dissectors מיומנת ותוצאות הכנה חריפה משתנות הם מגבלה הראשי של הטכניקה. בזמן הכנת tg(fli:EGFP) דג זברה העיניים מעניק תובנה מדינת להערכת מהר, הטכניקה עדיין משתמשת בסביבות 20 דקות של זמן עבודה לכל הרשתית עבור חוקר מנוסה. כל השלבים האלה הכנה עבור להערכת ברשתית חייב להתבצע תחת מיקרוסקופ ויבתר, dissectors הצורך להישאר מרוכז כל הזמן כמו צעד זהיר פוטנציאלי יכול לגרום לכלי שבירה. בניתוח צריך להתאמן באופן קבוע כמו העדרות ממושכת מן הכנה מפחיתה את הסבירות של בניתוח שמירה על תקינות כלי השיט.

יתר על כן, הבדיקה נוספים באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא עדיין מוגבלת, שכן רק מספר קטן של נוגדנים על רקמת מכרסמים ואנושי עובדים עם דג זברה. ניסויים מעוניין IHC מומלץ לחפש נוגדנים ספציפיים דג זברה, במיוחד כאשר עובדים עם מטרות חדשות. לחילופין, מומלץ להשתמש קווי כתב דג זברה נוספים אשר שימושיים ללמוד תאי מעבר להערכת בעיניים. אסטרטגיה זו, אולם, הוא זמן רב, כמו זה לוקח כמה חודשים כדי ליצור קווים דג זברה בוגרת הנושאות כתבים הטרנסגניים מרובים.

בכל זאת, דג זברה מהווה מערך ייחודי של יתרונות. הם קטנים יחסית, לשחזר בקלות. הם יכולים לגדול בשלבים למבוגרים במהירות, העוברים שלהם אופטימלי והתרופות הקרנה. השדה ברצון גדל והופך להיות ספרות יותר נגיש. עם היכולת ליצור הסתרה ג’ין-מהירות מהירה, שפע של transgene קרינה פלואורסצנטית כתב שורות, הבחירה עבור דג זברה רק מרוסנת על ידי שאלת המחקר שבחרת.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות Katrin בנביץ, מרלן האוזנר עבור גידול דג זברה וסיוע טכני. המחברים להכיר את התמיכה של הליבה מתקן לחיות תא הדמיה מנהיים במרכז וההתערבות, טכנולוגיה רפואית מנהיים (DFG מוסד 91027/9-1). מחקר זה נתמך על ידי פתוח (הבינלאומי למחקר הדרכה קבוצתית 1874/1 “DIAMICOM”, פרויקט SP5 ו- SP9; SFB1118 מרכז מחקר שיתופי, פרויקט B1 ופרויקט מחקר מרכז שיתופי SFB/TR23 Z5).

Materials

NaOH	Roth	6771.3
KCl	Merck	1.04936
CaCl_2*6H₂0	Roth	5239.2
MgSO_4*7H₂0	Merck	1.05886.0500
Paraformaldehyd	Roth	0335.3
Sodium dihydrogen phosphate	Roth	2370.1
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine)	Sigma	A5040
PBS	Roth	9143.1
Agarose	Roth	2267.3
Fluoromount-G	Thermo-Fischer	00-4958-02
Petri dish	Greiner Bio one	633180
Six-well plate	StarLab	CC7682-7506
Needle	MSG Praxisbedarf	BD 300900
Micro Tweezer	World Precision Instruments	14095
Microdissection Scissor	World Precision Instruments	501778
Glass slide	Carl Roth	H872.1
Coverslip 22mmx22mm	neoLab	103512222
Scalpel	MSG Praxisbedarf	FEA111
Epi-Illumination	Leica	10446389
Fluorescence stereomicroscope MZ10 F	Leica	NA
Confocal laser-scanning microscope SP5 DS	Leica	NA
Stereomicroscope M80	Leica	NA
Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype	NA	NA	see Reference 15
Mayer’s hematoxylin	Dr. K. Hollborn & Söhne	0088663
0.5% eosin	Dr. K. Hollborn & Söhne	NA
99,9% ethanol	Roth	9065.2
Paraffin	Merck	1,071,501,000
Xylol	Roth	4436.2
Acetone	Emsure	606-001-00-8
Microtome RM 2165	Leica	NA

Referanslar

WHO. . Global report on diabetes. , 88 (2016).
Lim, A. Diabetic nephropathy – complications and treatment. Int J Nephrol Renovasc Dis. 7, 361-381 (2014).
Yau, J. W., et al. Global prevalence and major risk factors of diabetic retinopathy. Diabetes Care. 35 (3), 556-564 (2012).
Cheung, N., Mitchell, P., Wong, T. Y. Diabetic retinopathy. The Lancet. 376 (9735), 124-136 (2010).
Raymond, N. T., et al. Higher prevalence of retinopathy in diabetic patients of South Asian ethnicity compared with white Europeans in the community: a cross-sectional study. Diabetes Care. 32 (3), 410-415 (2009).
Heng, L. Z., et al. Diabetic retinopathy: pathogenesis, clinical grading, management and future developments. Diabet Med. 30 (6), 640-650 (2013).
Writing Committee for the Diabetic Retinopathy Clinical Research, N., et al. Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 314 (20), 2137-2146 (2015).
Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
Sharma, K. R., et al. ELMO1 protects renal structure and ultrafiltration in kidney development and under diabetic conditions. Sci Rep. 6, 37172 (2016).
Baek, J. S., Fang, L., Li, A. C., Miller, Y. I. Ezetimibe and simvastatin reduce cholesterol levels in zebrafish larvae fed a high-cholesterol diet. Cholesterol. , 564705 (2012).
Elo, B., Villano, C. M., Govorko, D., White, L. A. Larval zebrafish as a model for glucose metabolism: expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase as a marker for exposure to anti-diabetic compounds. J Mol Endocrinol. 38 (4), 433-440 (2007).
Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease. Physiol Rev. 97 (3), 889-938 (2017).
Kasprick, D. S., et al. Microanatomy of adult zebrafish extraocular muscles. PLoS One. 6 (11), e27095 (2011).
Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Dev Neurobiol. 72 (3), 302-327 (2012).
Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
Avanesov, A., Malicki, J. Analysis of the retina in the zebrafish model. Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).
Gramage, E., Li, J., Hitchcock, P. The expression and function of midkine in the vertebrate retina. Br J Pharmacol. 171 (4), 913-923 (2014).
Cao, R., Jensen, L. D., Soll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), e2748 (2008).
Jorgens, K., Hillebrands, J. L., Hammes, H. P., Kroll, J. Zebrafish: a model for understanding diabetic complications. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 120 (4), 186-187 (2012).
Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycaemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Dis Model Mech. 3 (3-4), 236-245 (2010).
Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetol. 44 (3), 157-163 (2007).
Jorgens, K., et al. High tissue glucose alters intersomitic blood vessels in zebrafish via methylglyoxal targeting the VEGF receptor signaling cascade. Diabetes. 64 (1), 213-225 (2015).
Lai, A. K., Lo, A. C. Animal models of diabetic retinopathy: summary and comparison. J Diabetes Res. 2013, 106594 (2013).

Etiketler

Tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature Microdissection Visualization Analysis Diabetic Retinopathy Microvascular Complications Fluorescence Microscopy Confocal Microscopy PFA Fixation Agarose Embedding Eye Dissection Corneal Puncture Lens Extraction

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Wiggenhauser, L. M., Kohl, K., Dietrich, N., Hammes, H., Kroll, J. Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature. J. Vis. Exp. (130), e56674, doi:10.3791/56674 (2017).