Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Lucas Moritz Wiggenhauser; Katharina Kohl; Nadine Dietrich; Hans-Peter Hammes; Jens Kroll

doi:10.3791/56674

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Tıp

Étudier le diabète à travers les yeux d’un poisson : Microdissection, la visualisation et l’analyse de le tg(fli:EGFP) adulte vascularisation rétinienne de poisson-zèbre

Published: December 26, 2017

doi:

10.3791/56674

Lucas Moritz Wiggenhauser¹, Katharina Kohl², Nadine Dietrich², Hans-Peter Hammes², Jens Kroll¹

¹Department of Vascular Biology and Tumorangiogenesis, Center for Biomedicine and Medical Technology Mannheim (CBTM), Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University, ²V. Medical Clinic, Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University

Özet

Ici, nous discutons d’une méthode de protocole qui permettra une analyse simple du système vasculaire rétinienne tg(fli:EGFP) adult poisson zèbre comme une lecture rapide en paramètres de pathologies vasculaires à long terme, liées à la néoangiogenèse et changements structurels.

Abstract

La rétinopathie diabétique est la principale cause de cécité chez les adultes d’âge moyen. L’augmentation de la prévalence du diabète dans le monde entier fera la prévention des complications microvasculaires du diabète l’un des domaines de recherche principaux des prochaines décennies. Traitement ciblé spécialisé et nouveaux médicaments thérapeutiques sont nécessaires pour gérer le nombre croissant de patients à risque de perte de la vision. Le poisson-zèbre est un modèle animal établi pour des questions de développement en recherche avec une augmentation de pertinence pour la modélisation des processus métaboliques maladie multifactorielle. Les avantages de l’espèce permettent une visualisation optimale et drogue à haut débit, dépistage des approches, combinées à la forte capacité d’assommer les gènes d’intérêt. Nous décrivons ici un protocole qui permettra de faciliter l’analyse du système vasculaire rétinienne tg(fli:EGFP) adult poisson zèbre comme une lecture rapide en paramètres de pathologies vasculaires à long terme, liées aux dommages néoangiogenèse ou navire. Ceci est réalisé via la dissection de la rétine de poisson-zèbre et son ensemble-montage du tissu. Visualisation des vaisseaux exposés est alors obtenue par microscopie confocale le reporter EGFP verte exprimée dans la vascularisation rétinienne adulte. Manipulation correcte du tissu mènera à de meilleurs résultats et moins de rupture de cuve interne pour assurer la visualisation de la structure vasculaire intacte. La méthode peut être utilisée dans des modèles de poisson-zèbre de vasculopathies rétiniennes liées à l’évolution de l’architecture du navire ainsi que néoangiogenèse.

Introduction

Le diabète sucré est une maladie métabolique, définie par une hyperglycémie résultant de la sécrétion d’insuline dysfonctionnelle ou réponse tissulaire insuffisante à l’insuline sécrétée. L’OMS estime que 422 millions d’adultes étaient atteintes de diabète sucré en 2014¹ et la prévalence du diabète dans le monde devrait passer de 8 à 10 % de la population jusqu’en 2035², faisant de diabète l’un des domaines de recherche principaux dans le cours des prochaines décennies. Vivre avec hyperglycémie chronique entraîne des complications microvasculaires à long terme, y compris la polyneuropathie, la néphropathie et rétinopathie diabétique. La gestion et la prévention de ces complications sont difficiles ; en effet, diabète devient la cause la plus fréquente d’insuffisance rénale terminale (IRT), qui conduit à la dialyse², et le diabète est la principale cause de cécité chez les adultes d’âge mûr³.

Les causes initiales de dommages microvasculaires dans le œil diabétique sont une hyperglycémie chronique, altération métabolique, ainsi que certains facteurs de risque (p. ex., hypertension, dyslipidémie), conduisant à la dysfonction endothéliale vasculaire, pericyte d’abandon, et régression capillaire qui se traduit par des manchons vasculaires acellulaires. L’ischémie rétinienne qui en résulte est la cause de la néovascularisation et l’augmentation de la perméabilité vasculaire favorisant le développement de la rétinopathie diabétique proliférante (PDR)⁴. Rétinopathie diabétique a été généralement détectée dans 37 % des patients atteints de diabète, tandis que la vue en danger de la rétinopathie diabétique a été constatée chez 12 % de la cohorte européenne blanche filtrée dans l’ étude UKADS⁵. Le traitement actuel peut prévenir seulement d’autres complications et n’est pas en mesure de restaurer pleinement les dégâts déjà provoqués. Photocoagulation panrétinienne, en plus du contrôle de la glycémie, est la thérapie standard pour la rétinopathie diabétique proliférante (PDR) mais affecte les tissus sains adjacents ainsi. Des interventions anti-VEGF montrent des résultats prometteurs comme alternative au laser traitement⁶^,⁷, mais en fin de compte, traitement ciblé spécialisé et les nouveaux médicaments sont nécessaires pour gérer le nombre croissant de patients à risque de perte de la vision.

Les modèles de recherche établis sur les animaux de la rétinopathie diabétique ne partagent pas tous les aspects de la physiopathologie humaine. Utilisation de la bonne espèce pour répondre aux besoins précis de la question de la recherche scientifique est une des parties plus importantes de l’installation expérimentale. L’embryon de poisson zèbre (Danio rerio) est déjà largement utilisée en recherche de développement et fournit une expérience pratique optimale à coup de masse ou le knockout gènes spécifiques via les morpholinos ou la technique CRISPR/Cas9⁸. Ces méthodes peuvent facilement être utilisés chez le poisson zèbre pour étudier les gènes qui ont été identifiés par les études d’association pangénomique à grande échelle (GWAS), générant un aperçu des mécanismes particuliers de la progression de la maladie et de la susceptibilité⁹. Peu de temps générationnel, grandes quantités de progéniture, facile et peu coûteux manutention et dosage soutien grandissant ont augmenté la pertinence du modèle poisson-zèbre, surtout compte tenu de son grand potentiel pour la modélisation de maladies métaboliques. Conservation des mécanismes biologiques chez le poisson zèbre a été établie comme base pour le développement de la thérapie pharmacologique. Par exemple, l’antidiabétique metformine et simvastatine anti-cholestérol montrent « traiter » les conditions dans les modèles de cAMP/dexaméthasone-induced haute PEPCK expression et riche en cholestérol hypercholestérolémie induite par l’alimentation¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹². cet avancée aperçu global des mécanismes métaboliques conservés est étayée par le nombre croissant de modèles de diabète du poisson-zèbre, grâce à des expériences telles que : alternance d’incubation dans des solutions de glucose, Streptozotocine ablation des cellules bêta, bêta cellulaire nitroréductase ablation utilisant le métronidazole prodrogue, diabète monogénique médié par l’inactivation du gène pdx1 ou knockout, ainsi que des modèles de résistance à l’insuline accrue dans le muscle squelettique ¹². ces déjà établi les protocoles, les détails mentionnés ci-dessus de l’espèce, et la possibilité de manipuler efficacement le génome dans un grand nombre d’échantillons tous démontrer les avantages du poisson-zèbre pour étudier les mécanismes conduite de processus morbides complexes comme la capacité pour dépister les interventions pharmacologiques.

Une compréhension générale de l’anatomie oculaire de base poisson-zèbre (Figure 1) est nécessaire pour le dissecteur afin d’utiliser le poisson-zèbre comme modèle pour angiopathie rétinienne. Le œil de poisson-zèbre a six muscles extraoculaires, rectus quatre et deux muscles obliques qui insèrent à l’extérieur du globe à la sclère¹³. La cornée est le tissu transparent recouvre la lentille et continue directement dans la sclérotique, qui forme l’enveloppe extérieure de le œil. La sclérotique est opaque, a une surface réfléchissante partiellement léger et est fortement pigmentée. L’objectif lui-même est plus en forme de boule que l’homologue humain. La rétine se compose de trois couches nucléaires des cellules neuronales alors que la vascularisation rétinienne apport d’oxygène est étroitement liée à la couche de cellules de ganglion interne mais ne forme pas un réseau sous-rétinienne. Les vaisseaux choroïdienne, en revanche, se trouvent entre la sclérotique et la rétine et sont associées à l’épithélium pigmenté rétinien (RPE). Ce réseau capillaire fournit l’oxygène pour les parties extérieures de la rétine¹⁴.

Figure 1 : représentation schématique de le œil de poisson-zèbre adulte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Visualisation directe de la vascularisation rétinienne est possible par l’utilisation du poisson-zèbre tg(fli:EGFP) transgénique ligne¹⁵. La protéine fluorescente verte exprimée sous contrôle du promoteur fli dans les cellules endothéliales du système vasculaire est la base pour la visualisation via un laser scanning microscope dans les étapes ultérieures. Ceci est réalisé via la dissection de la rétine de poisson-zèbre et son ensemble-montage du tissu. Ce modèle transgénique fournit une lecture rapide vasculaire sans apport d’étiquetage intravasculaire ou entier-Montez l’immunohistochimie. Pour analyser la rétinopathie diabétique chez le poisson zèbre, une routine de préparation étape par étape et normalisée doit être utilisée par chaque dissecteur.Le protocole de préparation suivant fournit aux autres groupes de recherche la possibilité d’évaluer facilement les modifications vasculaires dans les récipients exposés de le œil de poisson-zèbre adulte et donnera des orientations afin d’établir une routine de dissection optimisée pour le poisson-zèbre de la rétine.

Protocol

Toutes les procédures, y compris des mesures liées aux sujets animaux, ont été approuvés par le Comité d’éthique animaux (Regierungspräsidium de Karlsruhe) et suivent les directives de protection des animaux de l’Université de Heidelberg. 1. préparation du fixateur (4 % PFA/PBS) Préparer le fixateur frais tous les jours afin d’assurer une conservation optimale de l’intégrité des tissus histologiques. Dissoudre 0,2 g d’hydroxyde de sodium (NaOH) dans 90 mL d’eau distillée double (ddH2O) en remuant constamment à la température ambiante. Ajouter paraformaldéhyde 4 g (PFA) et remuer jusqu’à ce que la solution est tout à fait claire pendant au moins 5-10 min pour assurer la dépolymérisation des macromolécules.ATTENTION : PFA est toxique, manipulez-les avec soin. Dissoudre 0,84 g de dihydrogénophosphate de sodium (NaH2PO4) dans la solution et contrôler le pH à 7,2 via des mesures. Régler le volume à 100 mL avec FD2O et filtrer la solution sur papier filtre de grade 3. Magasin 4 % PFA/PBS sur la glace. 2. préparation de la Solution de l’euthanasie Remarque : Les étapes suivantes ont été faites avec la souche sauvage zebrafish ABTL à un âge en général de 6 à 8 lun. Utilisez éthyl 3-aminobenzoate méthane sulfonate, également nommé « tricaïne » ou MS-222, à une concentration de 0,31 mg/mL pour le poisson-zèbre euthanasie16. Utiliser 1 x œuf d’eau, utilisée pour déclencher des embryons de poisson-zèbre, comme solvant pour la solution de l’euthanasie. En règle générale, contrôler la profondeur de l’anesthésie correcte avant de travailler avec les poissons sous sédation en faisant preuve de perte d’équilibre et toucher la perte de réaction. Pour atteindre 1 000 mL de 10 x oeuf eau, ajouter ces sels à eau bidistillée 1 000 mL (ddH2O) en agitant constamment dans l’ordre suivant : 10 g NaCl, 0.3 g de KCl, 0,4 g de CaCl2 *6 H2O, 1,32 g MgSO4 *6 H2O. 3. fixation des tissus de poisson-zèbre Transférer 6 mL de solution de PFA/PBS 4 % par échantillon dans les puits de six plats à l’avance. Euthanasier le poisson-zèbre adult (précédemment entretenu selon un cycle lumière-jour standard, par exemple, 12 h : 12 h) 2 h après les lumières allumer le matin, en les plaçant dans la solution de tricaïne et attendent jusqu’à ce qu’ils ont atteint l’euthanasie. Après la cessation du mouvement operculaire, ce qui peut prendre jusqu’à 10 min. Prenez le poisson hors de la solution de l’euthanasie de tricaïne et mettez-les sur des essuie-tout fraîches. Sécher le poisson et utiliser un scalpel pour couper les têtes derrière l’opercule (voir la Figure 2 a). Transférer les têtes directement dans les plaques bien préparées, qui contiennent le fixateur fraîchement préparé. Magasin les plats contenant les têtes de poisson à 4 ° C la nuit pendant au moins 24 h assurer le fixateur pénètre dans les couches profondes de la rétiniens.Remarque : Les têtes de poisson-zèbre peuvent être stockés pour un maximum de 48 h dans 1 x tamponné phosphate salin (PBS) à 4 ° C avant la préparation sans perte pertinente d’intensité de signal de fluorescence. Latence accrue peut conduire à une perte de l’intégrité des tissus et réduit la qualité de l’image et doit donc être évitée. 4. préparation de la vascularisation rétinienne de poisson-zèbre Remplir une boîte de Pétri jusqu’à un tiers de chauffée 2 % d’agarose et attendre jusqu’à ce que l’agar est ferme. Couvrir le plat d’agar avec 1 x PBS pour créer un espace de travail pour disséquer les yeux.Remarque : Cela permettra aux deux préservation des pincettes de préparation et de basse pression sur le tissu tout en disséquant, réduisant les risques de dommages structurels. Toutes les étapes de préparation supplémentaires doivent être effectuées dans cet espace de travail utilisant #5 pinces droites avec des pointes fines sous un microscope à dissection avec epi-éclairage additionnel. En disséquant, utilisent un grossissement entre 4,0 x et x 6,0 pour permettre fois vue d’ensemble et évaluation minutieux des tissus. Transférer l’échantillon fixe dans la boîte de Pétri et, en tenant la tête dans la surface de coupe avec une pince à épiler, insérer une autre pince épinglé-ensemble sous le globe oculaire à la cavité orbitale. Lentement ouvrir la pince à épiler sous l’oeil et saisir le nerf optique, puis soigneusement déchirer et détacher les yeux (Figure 2 b). Figure 2 : suppression de le œil de poisson-zèbre adulte. Vue de côté cornée à l’oeil encore dans la cavité orbitale et le nerf optique intact (A). Vue de côté cornéen avec œil détaché (B). Représentation schématique de le œil de poisson-zèbre à cette étape (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Supprimer tous les quatre rectus et deux muscles extraoculaires obliques qui sont encore connectés à l’oeil ainsi que le tissu résiduel extra-oculaires reliant le œil à la cavité orbitale (comparer la Figure 3 et Figure 4). Atteindre cet objectif par retient le œil à travers une pince mi-clos et, saisissant la structure avec les autres pinces, doucement arnaquer il avec un mouvement diamétrale. Puisque la préhension du globe oculaire directement conduit à la rupture de la cuve interne, cette technique est bien douce pour préserver la vascularisation. Figure 3 : œil de poisson-zèbre adulte avec des muscles extraoculaires en bref. Vue latérale avec fixation d’un muscles extraoculaires sur le bord externe gauche du globe oculaire en bref (A). Vue latérale de nerf optique avec des muscles extraoculaires symétriquement flanquant le nerf optique (B). Représentation schématique de le œil de poisson-zèbre à cette étape (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Utiliser une aiguille jetable 27G (0,4 x 19 mm) pour la perforation de la cornée (Figure 4, flèche rouge) à la plage extérieure. Grâce à cette ouverture Tenez la cornée avec les deux pinces et il déchirer un peu. Par la suite soigneusement travailler pour créer une larme centrée approximativement la taille de la pupille respectif. Figure 4 : œil de poisson-zèbre adulte après le retrait de tous les muscles extraoculaires. Vue latérale avec le bord extérieur dégagé de l’oculaire globe visible (A).Vue latérale de nerf optique avec le nerf optique au milieu. La sclérotique qui reflètent la lumière ne recouvre pas toute la zone autour du nerf (ligne rouge pointillée) (B). Représentation schématique de le œil de poisson-zèbre à cette étape (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Appliquer une pression sur la partie cornée du globe oculaire (bulbus oculi) sur le bord extérieur de cornée au-dessus de l’iris. Ceci créera un petit creux et pousser la lentille à la hauteur de la cassure cornée. Exécutez la pince à épiler sous la lentille et le retirer (Figure 5 a). Figure 5 : œil de poisson-zèbre adulte dans le processus de retrait de la lentille. Vue de côté cornéen avec la lentille fait passer l’ lacrymogènes cornéen (A). Vue de côté cornéen avec l’objectif à côté du globe oculaire (B). Représentation schématique de le œil de poisson-zèbre à cette étape (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Tourner de le œil à l’envers pour le nerf optique vers le chercheur. Notez que la sclérotique et la cornée sont connectées et forment la tunique fibreuse du bulbe oculaire pour protéger la rétine en coupe. (Figure 6). Cette coquille, composé de la cornée et la sclérotique, est aussi appelée « corneosclera » et pièces de rechange, la zone autour du nerf optique (Figure 4 b, ligne rouge en pointillés). Insérer une aiguille à cet arrêt une fois pour créer une ouverture entre la sclérotique et la rétine. Figure 6 : Corneosclera composé de la sclérotique et la cornée, ce qui est bien débranchée le tissu restant intraoculaire. Vue de côté cornéenne montrant la poursuite de la cornée translucide dans la sclérotique pigmentée (A). Vue latérale a porté sur la partie sclérotique de la corneosclera (B). Représentation schématique de la corneosclera supprimé (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Utilisez cet accès avec les deux pinces à épiler, rip soigneusement la sclère axialement en bandes d’augmenter l’ouverture autour du nerf optique. Veillez à conserver le corneosclera intact lors de la transition à la circonférence de la cornée côté (voir la Figure 6 a). Tenez la sclérotique avec une pince et, en saisissant le nerf optique avec l’autre et en tirant loin, totalement supprimer la corneosclera de le œil et jetez-le (Figure 6). Essayez de rompre toute connexion avant que le corneosclera et les tissus intraoculaires restants, comme aux autres structures seront un point critique ; Cette étape fournira une structure en forme de coupe, consistant en l’uvée et la rétine contenant la vascularisation rétinienne (Figure 7). Créer une rupture dans la couche choroïdienne/RPE en organisant une aiguille de 27G sur le côté à la coupe restante tout en grattant la surface extérieure avec la jante de la pointe de l’aiguille. Utilisez la rupture comme un point d’accès pour avoir une emprise sur la couche choroïdienne/RPE et déchirer avec les deux pinces en bandes, mais garder la connexion avec l’iris intact. Ensuite, exécutez une brucelles en vertu de l’iris et circuler dans un circuit de l’extérieur tout en créant des tensions en tirant sur la couche choroïdienne/RPE abandonnée pour atteindre le détachement de la structure combinée.Remarque : L’iris doivent être débranchés, afin de ne pas entraver la fluorescence tout en visualisant les vaisseaux (Figure 8 b). Saisissant l’iris directement pour l’enlever peut conduire à un vaisseau vaste, surtout au cercle optique (CIO), étant donné que l’iris est encore branché sur les tissus environnants. La couche choroïdienne et l’épithélium pigmenté rétinien (RPE) peuvent être séparés et conservent souvent une connexion à l’iris, ce qui permet un retrait facile du secondaire. Si certaines parties de l’iris ne peut pas être supprimés, utiliser un point de rupture naturel, que le œil de poisson-zèbre adulte présente à l’intérieur de la couche des photorécepteurs (PL), de façon similaire à l’étape 4.9, pour enlever l’iris. Gratter sur l’extérieur de la rétine de cupuliforme restante pour induire les abandons dans le PL au-dessus du point de rupture (Figure 11, flèche noire). Utilisez l’accès créé pour enlever la partie supérieure de la couche tout en conservant la connexion possible à l’iris. Ensuite, exécutez la pince à épiler sous l’iris et circuler dans un circuit comme indiqué avant de détacher la structure combinée.NOTE : On doit faire preuve de patience comme l’étape ensemble 4,9 peut être difficile, mais ce soin permettra d’atteindre un meilleur résultat vasculaire que carrément saisissant l’iris au bord de la pupille ou de forcer une ouverture en détruisant les connexions à la choroïde/RPE ou couche de photorécepteur sans leur éloignement respectif. Après cette étape sera ainsi préserver l’intégrité vasculaire rétinienne, mais entraîner des lésions des couches rétiniennes extérieures. Figure 7 : œil de poisson-zèbre adulte après le retrait de la corneosclera. Vue latérale montre les tissus intraoculaires restants avec intact de l’iris et du nerf optique (A). Vue de côté cornéen avec iris mise au point (B). Représentation schématique de le œil de poisson-zèbre à cette étape (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Utiliser des ciseaux microdissection printemps avec un tranchant droit 2,5 mm pour couper le nerf optique aussi près que possible de la rétine ; Cela permettra un meilleur plat-montage du tissu. Figure 8 : œil de poisson zèbre adulte après enlèvement des RPE/choroïde et tronquée de nerf optique. Vue de côté de nerf optique montre la rétine avec un nerf tronquée de l’optique (A). Vue de côté cornéen avec un regard direct sur la couche la plus interne de la rétine (B). Représentation schématique de le œil de poisson-zèbre à cette étape (C).S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 5. montage de la vascularisation rétinienne Laver la rétine disséquée deux fois pendant 5 minutes dans du PBS 1 x. Pour transférer la rétine après troncature du nerf optique, utiliser une spatule de laboratoire avec une extrémité en micro cuillère pour éviter la manipulation directe du tissu exposé. Déposez une goutte de PBS sur une lame de verre et transvaser la rétine dans la goutte. Utilisez une pince pour maintenir le tissu en place lors de la coupe de la structure en forme de coupe avec un scalpel pour créer une forme plate pétales quatre ou cinq pétales selon la taille de la rétine (voir Figure 9). Aspirer les restes PBS avec un beau morceau de papier. Veillez à ne pas toucher la rétine. Enduire la rétine plat monté dans les supports de montage et recouvrir d’un lamelle couvre-objet. Être attentif ne pas à créer la mousse, comme les bulles d’air peuvent fausser la visualisation des vaisseaux rétiniens. Minimiser le mouvement de la lamelle et sceller le couvercle avec le vernis à ongles transparent. 6. visualisation de la vascularisation rétinienne Tenir à l’écart de temps entre la préparation et la visualisation aussi courte que possible pour réduire la perte de détails d’image par le biais de perte de signal de fluorescence. Stocker les supports préparés vascularisation rétinienne à 4 ° C pour réduire les pertes de signal, si la visualisation directe ne peut être atteint, comme la dégradation de la qualité de l’image devient lentement visible 48 h après la préparation. Visualiser les montures de la vascularisation rétinienne par microscopie de fluorescence ou microscopie confocale à balayage au laser.NOTE : Visualisation de navire par microscopie de fluorescence a été atteint à un grossissement x 2,5 avec un temps de pose de 2,0 s, gain de 6,0 x et gamma paramètres de 1,67. Pour la microscopie confocal, un Ar-laser (488 nm/20 mW) à 20 % de puissance a été utilisé en combinaison avec un filtre d’excitation TD 488/543/633, un 20 x / 0,7 objectif à multi-immersion NA avec FD2O comme média de l’immersion et paramètres de filtre d’émission de 505-560 nm. Photos confocale sont composés d’images de singulier 4×4, 4 x 5 ou 5 x 5 combinés par un balayage de carreaux selon la taille de la rétine. 7. HE Sections de la rétine de poisson-zèbre Remarque : Pour les sections de HE de la rétine de poisson-zèbre, préparer le tissu comme décrit dans le protocole jusqu’à l’étape 4.5 et ensuite passez directement à l’étape 7.1. Laver les yeux énucléés (après l’étape 4.5) deux fois pendant 5 minutes dans du PBS 1 x. Ensuite, transvaser le tissu dans 70 % d’éthanol (EtOH). À ce stade, yeux préparés peut être stockés à 4 ° C jusqu’à ce que l’enrobage de paraffine. Laver le tissu comme suit il déshydrater avant enrobage de paraffine : 2 x 15 min dans l’éthanol à 80 %, 2 x 15 min à 90 % d’éthanol, 3 x 15 min dans l’éthanol à 96 %, 3 x 15 min dans l’éthanol à 99 %, 2 x 15 min dans de l’éthanol de acetone/99% (1:2), 3 x 15 min dans de l’acétone. Garder le tissu à la paraffine à 62 ° C durant la nuit. Chauffe paraffine fraîche à 62 ° C et versez-la dans l’incorporation des moules. Transférer le tissu dans les moules directement et, à un rythme rapide, contrôle l’orientation correcte des yeux pour la section désirée. Ensuite, appliquer une cassette d’encastrement à la moule et le recouvrir avec de la paraffine chauffée supplémentaire. Retirer les moules encastrement après que des blocs de paraffine ont refroidi. Couper les blocs de paraffine à un microtome en 10 sections µm et flotter les sortir sur un bain d’eau de 45 ° C sur la surface de l’eau assez longtemps pour qu’ils s’aplatissent complètement. Attraper les sections sur une lame de verre et les égoutter verticalement pour enlever l’excès d’eau avant de sécher pendant la nuit dans un four à 45 ° C. Processus les sections plus loin avec le calendrier suivant pour Déparaffiner et tache de HE : 4 x 1 min dans du xylol, 1 x 1 min dans l’éthanol à 99 %, 1 x 1 min dans l’éthanol à 96 %, 1 x 1 min à 80 % d’éthanol, 1 x 1 min dans l’éthanol à 70 %, 1 x 1 min à FD2O, 1 x 4 min à l’hématoxyline de Mayer , 1 x 10 min à FD2O, 1x2min à 0,5 % éosine, 1 x 30 s FD2O, 1 x 30 s dans l’éthanol à 80 %, 2 x 30 s dans l’éthanol à 96 %, 3 x 1 min dans l’éthanol à 99 % et 1 x 1 min dans du xylol. Prenez la lame de verre sur le xylol et rapidement couvrir le tissu avec support de montage. Éviter de laisser le tissu sécher complètement, puis placez une lamelle sur le dessus et sceller le tissu taché.

Representative Results

Nous démontrons ici deux exemples morphologiques typiques de la vascularisation rétinienne chez le poisson zèbre adulte tg(fli:EGFP) : une fois visualisé avec un microscope à fluorescence (Figure 9 a) et une fois avec un confocal laser scanning microscope (Figure 9 b). La structure rétinienne révélée montre un patron très organisés. Forte autofluorescence est vu dans la rétine de poisson-zèbre, quand visualisé à l’aide d’un microscope à fluorescence. Ainsi, une visualisation des que la couche vasculaire par un balayage confocal est conseillée de réduire la fluorescence de fond et augmenter le contraste. Pour le plus rapide d’acquisition de photo ou de situations où les données qualitatives sont assez, le microscope à fluorescence est une alternative intéressante. Figure 9 : photos représentatives du système vasculaire rétinien tg(fli:EGFP) adultes zebrafish. Deux exemples morphologiques typiques de la vascularisation rétinienne figurent : l’artère centrale optique se propage dans les vaisseaux principaux 5-7, qui ensuite créer de branchement dans une succession d’arcades. Tous les autres navires déversent dans la veine circonférentielle (CV) limitant la partie extérieure de chaque pétale. Visualisation par microscopie de fluorescence à 2,5 x grossissement (A). Visualisation de la vascularisation rétinienne par laser confocale, microscopie par un balayage combinée de la tuile du seule image 5 x 5 (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. L’artère optique pénètre la rétine à la tête du nerf optique et, dans la plupart des échantillons, se répand dans les 5-7 navires principaux (Figure 10 a). Les principaux navires puis créer de branchement dans une succession d’arcades et de se connecter à optique cercle intérieur (IOC), aussi appelé la veine circonférentielle (CV), encerclant le disque optique dans la périphérie de la rétine montée plate (voir Figure 10 b). Le CIO est le veineux drainant le sang artériel vers le bord interne du globe oculaire (bulbus oculi). La vascularisation rétinienne de poisson-zèbre montre également les secteurs de forte activité vasculaire avec le branchement des capillaires et angiogéniques germination (Figure 10). Cette activité vasculaire est principalement située dans la proximité proche au CIO. Il est important de noter que l’oeil même peut démontrer les deux activités hautes et basses vasculaires dans différentes régions de la rétine (comparer la Figure 10 b et Figure 10). En général, le système vasculaire rétinien du poisson-zèbre montre plus d’espace avasculaire et moins capillaires entre les branches principales par rapport à, par exemple, la rétine de souris17. Les deux yeux de chaque échantillon devrait être analysés car les vaisseaux peuvent varier entre les deux et inspection du singulier peut conduire à la partialité. Figure 10 : magnifiée des zones de visualisation de vascularisation rétinienne poisson zèbre adulte tg(fli:EGFP). L’artère optique ramification dans les vaisseaux principaux (A). Capillaires rétiniens dans une zone de faible activité vasculaire connectez à cercle optique (CIO) dans le bas de l’image (B). Capillaires rétiniens dans une zone de forte activité vasculaire se connecter à l’ IOC (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Une architecture hautement conservée de couches neuronales est déjà présente chez le poisson zèbre d’environ 72 h après la fécondation (hpf) partir18. La rétine de poisson-zèbre adulte montre les couches suivantes de l’intérieur vers l’extérieur (Figure 11) : couche de cellules de ganglion (GCL), couche plexiforme interne (IPL), la couche nucléaire interne (INL), la couche plexiforme externe (OPL), couche nucléaire externe (ONL), couche de photorécepteur (PL), et l’épithélium pigmenté rétinien (RPE). L’estimation des paramètres vasculaires de visualisation du système vasculaire rétinien est illustrée à la Figure 12. La vascularisation rétinienne interne se trouve sur la couche de cellules de ganglion (GCL) (Figure 13 b, boîte blanche) alors que la choroïde capillaires seraient associés à l’épithélium pigmenté rétinien (RPE). Figure 11 : il a une coloration de le œil de poisson-zèbre adulte. Vue d’ensemble de coupe transversale de l’oeil entier après le retrait de la lentille (A). 19 (B)les yeux des couches rétiniennes du poisson-zèbre adult. Indication (flèche noire) du point de rupture naturelle au PL (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les modèles de néoangiogenèse rétinienne induite par l’hypoxie montrent un nombre accru de bifurcations, angiogéniques choux, superficie vasculaire et une diminution d’intercapillary distance en poisson-zèbre,²⁰. Ces résultats confortent l’idée que le poisson-zèbre est sensible aux complications microvasculaires du diabète²¹, comme les principales constatations de la rétinopathie diabétique plus tard incluent néoangiogenèse induite par l’hypoxie, ce qui est fortement liée à l’expression du VEGF. Les changements induits par l’hyperglycémie dans la rétine de poisson-zèbre conduisent à l’augmentation de l’épaisseur des navires mais maintiennent l’ensemble²²le patterning. Alternant une immersion dans des solutions de glucose pendant 30 jours diminue également l’épaisseur de l’ IPL et INL²³. L’influence directe des métabolites de la glycémie chez le poisson zèbre comme promoteurs métaboliques de la vasculopathie a également déjà été démontré. Hyperbranching vasculaire supplémentaire a été observée dans le système vasculaire du tronc des embryons de poisson-zèbre après incubation avec méthylglyoxal²⁴. Pour l’instant, il n’y a pas de modèle animal qui offre tous les critères clés de la rétinopathie diabétique. Premiers changements sont trouvent souvent, mais la progression de la rétinopathie diabétique proliférative manque²⁵. Le poisson-zèbre tombe également dans cette définition, comme nous avons vu seulement la néoangiogenèse induite par l’hypoxie ou les changements induits par l’hyperglycémie jusqu’à présent. Les résultats actuels confirment l’idée que le poisson-zèbre est sensible aux changements vasculaires induite par l’hyperglycémie et comme modèle animal peut-être potentiellement montrent une progression de la rétinopathie diabétique proliférante. Selon la force et l’exposition à l’effet médié par l’hyperglycémie, le modèle expérimental de droite pourrait entraîner une ischémie dans certaines zones de la rétine de poisson-zèbre et promouvoir la néoangiogenèse comme les critères clés de la rétinopathie diabétique proliférative. Cependant, comme le poisson-zèbre est un acteur relativement nouveau dans le domaine de la modélisation de pathologies microvasculaires à long terme, des modèles de diabète à venir chez le poisson zèbre fournissent des informations supplémentaires et clarifier son importance par rapport aux autres modèles et leurs pathologies. Par exemple, une en-croix de tg(gata1a:DsRed) poisson-zèbre avec marqué au rouge des érythrocytes dans la ligne de tg(fli:EGFP) pourrait servir à visualiser simultanément hémorragies intraoculaires potentielles à l’avenir zebrafish modèles montrant des microanévrismes comme un facteur prédictif de progression de PDR.

Étant donné que la vascularisation rétinienne progresse en une succession d’arcades, évaluation de la distance de perforations et nombre de bifurcations de la superficie totale de vasculaire sont liés à la distance de l’artère centrale de l’optique. Pour éviter les biais dans les paramètres vasculaires mises en recouvrement, un point d’orientation est nécessaire. Le CIO est une telle structure et est très pertinent, étant donné que les domaines d’activité vasculaire se trouvent à proximité spatiale. Pour l’évaluation uniforme, le scan rétinien devrait être divisé en plusieurs sections image rectangulaire avec une distance conforme au CIO. La rétine entière doit être analysée et images numériquement symétriquement distribués. La rétine de poisson-zèbre montre des zones à densité capillaire haute et basse et une répartition inégale des sections de l’image peut conduire à un biais supplémentaire.

Figure 12 : présentation d’exemple des paramètres vasculaires comme l’affichage de la visualisation de la vascularisation rétinienne. Mesure de la distance de perforations (double flèche rouge) près de l’optique interne cercle (IOC) (A). Trois bifurcations (cercles rouges) près de l’ IOC (B). Visualisation du système vasculaire rétinien de poisson-zèbre avec un espace élargi (boîte rouge) montrant un navire de germination (C). Le diamètre du vaisseau mesurée sur une certaine distance (double flèche blanche) de l’artère centrale (croix blanche) (D). Densité de navire est le pourcentage de zone rétinienne occupée en superposant des navires (diagonales rouges) (E). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Pour mesurer la distance de perforations, il faut définir une certaine distance au CIO en standard (Figure 12 a, flèche double blanche) et dessiner une ligne horizontale imaginaire (Figure 12 a, une ligne blanche horizontale) parallèle au CIO. La distance entre les navires sur cette ligne additionnés et la moyenne arithmétique est égale à la distance de perforations. Bifurcations sont comptées à l’intérieur de chaque image, chaque fois qu’un navire se divise et plus d’un lumen vasculaire continue du point d’origine. Cela inclut également des liens horizontaux entre les capillaires. Il est important de rester cohérent avec l’analyse et de décider quels points de ramifications de compter et de garder ces règles tout au long de l’expérience ensemble pour réduire les variations inutiles. Bourgeonnement vasculaire, comme illustré dans la Figure 12, est un autre paramètre qui peut être compté dans chaque image pour évaluer l’influence sur la vascularisation rétinienne. Angiogénique germes ne suivent pas la succession de type arcade entre artère centrale et CIO et mise au point près de la partie externe de la rétine. Afin d’évaluer certains diamètres de navire, il faut toujours un point d’orientation d’où une distance définie marque la mesure spot. Origine de l’artère centrale à l’intérieur de la rétine fournit ces indications pour les vaisseaux de la tige principale (Figure 12D, blanc Croix). La superficie occupée par les navires (Figure 12F, diagonales rouges) comme un pourcentage de la surface rétinienne ensemble est la densité vasculaire et indirectement correspond à la zone avasculaire.

Un balayage confocal complète d’un échantillon devrait être composé de plusieurs images de détails élevés pour permettre la visualisation des petite hypersprouting capillaire. Pour optimiser les temps et les ressources consacrées à cette étape, une procédure automatisée de labourage doit être utilisée avec une profondeur d’analyse générale pour chaque tuile. Montage inégale de la rétine peut augmenter considérablement le temps passé pour balayer le système vasculaire avec un microscope confocal. Dans une approche optimale on voudrait analyser uniquement la couche vasculaire (Figure 13 b, boîte blanche), mais l’inclusion partielle de la GCL est souvent nécessaire.Laissant une longueur excessive du nerf optique après troncature, ainsi que les coupes à réaliser le montage plat étant trop court, peut conduire à montage inégale.

Figure 13 : Comparaison de HE coloration autofluorescence dans la rétine de poisson-zèbre adulte. Système vasculaire rétinien en bref dessus GCL (A). Système vasculaire rétinien (boîte blanche) montrant vert un signal EGFP et couches rétiniennes présentant de fort autofluorescence (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Comme la bonne préparation de la vascularisation rétinienne de poisson-zèbre a besoin d’une formation préalable, un petit échantillon avec dissecteurs non formés et des résultats de préparation fortement variables sont une principale limite de la technique. Alors que la préparation des yeux de poisson-zèbre de tg(fli:EGFP) donne un aperçu rapide de l’état du système vasculaire, la technique utilise toujours environ 20 min de temps de travail par la rétine pour un chercheur expérimenté. Toutes ces étapes de préparation pour la vascularisation rétinienne doivent être effectuée sous un microscope à dissection et dissecteurs il fallait rester concentré tout le temps comme une étape imprudente peut induire potentiellement bris de navire. Le dissecteur doit pratiquer régulièrement car une absence prolongée de préparation réduit la probabilité d’un dissecteur de maintenir l’intégrité du navire.

En outre, l’affichage supplémentaire par immunohistochimie (IHC) est encore limitée, que seul un petit nombre d’anticorps validés sur les tissus humains et les rongeurs travaillent avec le poisson-zèbre. Expérimentateurs intéressés par IHC sont invités à rechercher des anticorps spécifiques à poisson-zèbre, surtout lorsque vous travaillez avec nouveaux objectifs. Par ailleurs, il est recommandé d’utiliser les lignes de journaliste zebrafish supplémentaires qui sont utiles pour étudier les cellules au-delà de la vascularisation dans les yeux. Cette stratégie, cependant, est beaucoup de temps, car il faut quelques mois pour produire des lignées de poisson-zèbre adulte qui transportent plusieurs reporters transgéniques.

Néanmoins, le poisson-zèbre pose une gamme unique d’avantages. Ils sont relativement petits et se reproduisent facilement. Ils peuvent se développer rapidement au stade adulte et leurs embryons sont optimales pour le dépistage des drogues. Le champ croît rapidement et plus la littérature devient accessible. Avec la capacité de générer des débouchures de gène à une vitesse rapide et une abondance de lignes de journaliste de fluorescence transgène, le choix pour le poisson-zèbre est seulement retenu par la question de recherche choisie.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiens à remercier Katrin Bennewitz et Marlene Hausner pour l’élevage de poisson-zèbre et l’assistance technique. Les auteurs reconnaissent l’appui de la Core Facility Live Cell Imaging Mannheim au Centre de biomédecine et Mannheim de technologie médicale (DFG INST 91027/9-1). Cette étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (International Research Training Group 1874/1 « DIAMICOM », du projet SP5 et SP9 ; Collaborative Research Centre SFB1118, Centre de recherche Collaborative SFB/TR23 projet Z5 et projet B1).

Materials

NaOH	Roth	6771.3
KCl	Merck	1.04936
CaCl_2*6H₂0	Roth	5239.2
MgSO_4*7H₂0	Merck	1.05886.0500
Paraformaldehyd	Roth	0335.3
Sodium dihydrogen phosphate	Roth	2370.1
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine)	Sigma	A5040
PBS	Roth	9143.1
Agarose	Roth	2267.3
Fluoromount-G	Thermo-Fischer	00-4958-02
Petri dish	Greiner Bio one	633180
Six-well plate	StarLab	CC7682-7506
Needle	MSG Praxisbedarf	BD 300900
Micro Tweezer	World Precision Instruments	14095
Microdissection Scissor	World Precision Instruments	501778
Glass slide	Carl Roth	H872.1
Coverslip 22mmx22mm	neoLab	103512222
Scalpel	MSG Praxisbedarf	FEA111
Epi-Illumination	Leica	10446389
Fluorescence stereomicroscope MZ10 F	Leica	NA
Confocal laser-scanning microscope SP5 DS	Leica	NA
Stereomicroscope M80	Leica	NA
Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype	NA	NA	see Reference 15
Mayer’s hematoxylin	Dr. K. Hollborn & Söhne	0088663
0.5% eosin	Dr. K. Hollborn & Söhne	NA
99,9% ethanol	Roth	9065.2
Paraffin	Merck	1,071,501,000
Xylol	Roth	4436.2
Acetone	Emsure	606-001-00-8
Microtome RM 2165	Leica	NA

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Tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature Microdissection Visualization Analysis Diabetic Retinopathy Microvascular Complications Fluorescence Microscopy Confocal Microscopy PFA Fixation Agarose Embedding Eye Dissection Corneal Puncture Lens Extraction

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Wiggenhauser, L. M., Kohl, K., Dietrich, N., Hammes, H., Kroll, J. Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature. J. Vis. Exp. (130), e56674, doi:10.3791/56674 (2017).