通过鱼眼研究糖尿病: 成人 tg (fli: EGFP) 斑马鱼视网膜血管的显微解剖、可视化和分析

所有的程序, 包括与动物有关的步骤, 已得到动物伦理委员会 (Regierungspräsidium 卡尔斯鲁厄) 的批准, 并遵循海德堡大学的动物保育指南。 1. 定影剂的制备 (4% 粉煤灰/PBS) 每天准备新鲜的定影液, 以确保组织学组织完整性的最佳保存。 在室温下不断搅拌, 在90毫升的双蒸馏水 (ddH2O) 中溶解0.2 克氢氧化钠 (氢氧化钠)。 加入4克甲醛 (粉煤灰) 和搅拌, 直到解决方案是完全明确的至少5-10 分钟, 以确保降解的大分子。注意: 粉煤灰是有毒的, 小心处理。 在溶液中溶解0.84 克磷酸二氢钠 (NaH2PO4), 并在7.2 通过测量控制 pH 值。 使用 ddH2O 将音量调整为100毫升, 并通过3级滤纸过滤解决方案。 在冰上储存4% 的粉煤灰/PBS。 2. 安乐死解决方案的准备 注: 以下步骤与 ABTL 野生型斑马鱼菌株在一般年龄6-8 周一完成。 使用 3-氨基甲烷磺酸乙酯, 也命名为 “tricaine” 或 MS-222, 在0.31 毫克/毫升浓度为斑马鱼安乐死16。利用1x 的卵水, 用来饲养斑马鱼的胚胎, 作为解决安乐死的溶剂。一般情况下, 在使用镇静鱼之前, 要控制正确的麻醉深度, 表现出平衡损失和接触反应损失。 达到1000毫升的10x 鸡蛋水, 添加这些盐到1000毫升双蒸馏水 (ddH2O), 同时不断搅拌如下顺序:10 克氯化钠, 0.3 克氯化钾, 0.4 g CaCl2 *6H2o, 1.32 g MgSO4 *6H2o。 3. 斑马鱼组织的固定 将每样6毫升4% 的粉煤灰/PBS 溶液转移到六井板的井中。 安乐的成年斑马鱼 (以前保持在一个标准的 light-day 周期,例如, 12 小时:12 h) 2 小时后, 灯打开在早上, 通过放置在 tricaine 的解决方案, 并等待, 直到他们已经达到了安乐死。随着盖运动的停止, 这可能需要10分钟。 把鱼从 tricaine 的安乐死溶液中取出, 放在新鲜的纸巾上。把鱼弄干, 用手术刀把盖的头砍下来 (参见图 2A)。直接将磁头转移到准备好的板上, 其中含有新鲜的定影剂。 将鱼头在4° c 过夜至少24小时贮存好, 以确保定影物穿透更深的视网膜层。注: 斑马鱼头可在4° c 的磷酸缓冲盐水 (PBS) 中以最高 48 h 的浓度储存, 而不需要相应的荧光信号强度损失。延迟的增加会导致组织完整性的丧失和图像质量的降低, 因此应该避免。 4. 斑马鱼视网膜血管的制备 用加热的2% 琼脂糖将培养皿填满三分之一, 然后等到琼脂牢固。用 1x PBS 覆盖琼脂板, 创建一个工作区来解剖眼睛。注意: 这将允许在解剖时保存准备好的镊子和低压力, 减少结构损伤的可能性。所有进一步的准备步骤都应该在这个工作区中使用 #5 在解剖显微镜下的带有细微提示的直钳和额外的 epi 照明。 在解剖时, 使用4.0x 和6.0x 之间的放大倍数, 以允许对组织的概述和细节为导向的评估。 将固定的样品转移到培养皿中, 并在切口表面用一镊子, 在眼窝的眼球下方插入另一个钉在一起的镊子。慢慢打开眼睛下面的镊子, 抓住视神经, 然后小心地撕裂和分离眼睛 (图 2B)。 图 2: 去除成年斑马鱼眼.角膜侧视图与眼睛仍然在眶腔和完整的视神经(A)。角膜侧视图与分离的眼睛(B)。在此步骤(C)中对斑马鱼眼的示意图描述。请单击此处查看此图的较大版本. 移除仍与眼睛相连的四腹直肌和两个斜眼外肌, 以及将眼睛连接到眼眶的残余眼球组织 (比较图 3和图 4)。 通过半镊子的眼睛, 并抓住与其他镊子的结构, 轻轻撕开它与直径运动, 以实现这一点。由于眼球的抓取直接导致内血管破损, 因此该技术是适当的温和保存血管。 图 3: 成年斑马鱼眼中眼球外肌的焦点.外侧视野与眼外肌附着在眼球的左外缘在焦点(A)中。视神经侧视与眼球外肌对称侧翼视神经(B)。在此步骤(C)中对斑马鱼眼的示意图描述。请单击此处查看此图的较大版本. 使用一个 27G (0.4 x 19 毫米) 一次性针头刺穿角膜 (图 4C, 红色箭头) 在外面的范围。通过这个开头举行角膜用镊子和轻微地撕毁它打开。之后仔细地工作创造一个中心的泪花近似地各自学生的大小。 图 4: 成年斑马鱼眼球切除后的所有眼外肌.侧视野与被清除的外在外缘眼睛地球可见(A)。视神经侧视神经在中部。反光巩膜不覆盖整个区域周围的神经 (红色虚线) (B)。在此步骤(C)中对斑马鱼眼的示意图描述。请单击此处查看此图的较大版本. 在虹膜上方的外角膜边缘上按压眼球 (薤) 的角膜侧。这将创造一个小凹痕, 并推动镜头到高度的角膜撕裂。运行在镜头下的镊子, 并删除它 (图 5A)。 图 5: 在去除晶状体的过程中, 成年斑马鱼眼.角膜侧视图与透镜推挤通过角膜泪花(A)。角膜侧视图与透镜在眼睛旁边地球(B)。在此步骤(C)中对斑马鱼眼的示意图描述。请单击此处查看此图的较大版本. 将眼睛倒置到面对研究者的视神经。注意, 巩膜和角膜是相连的, 形成了眼睛的纤维状鳞茎, 以保护杯状的视网膜。(图 6)。 这壳, 由角膜和巩膜组成, 也被称为 “加” 和备件周围的视神经 (图 4B, 红色虚线) 的区域。在这个停止处插入一根针, 在巩膜和视网膜之间创建一个开口。 图 6: 由巩膜和角膜组成的加, 与其余的眼内组织断开连接.角膜侧视图显示半透明角膜进入色素性巩膜(A)。侧视图集中在加(B)的巩膜部分。已移除加(C)的示意图描述。请单击此处查看此图的较大版本. 使用这两个镊子的访问, 小心地撕裂的巩膜轴向条纹, 以增加周围的视觉神经的开放。在向角膜侧圆周过渡时要注意保持加完好 (请参见图 6A)。 用一个镊子抓住巩膜, 然后用另一根抓住视神经, 然后拔掉, 完全从眼睛中取出加并丢弃它 (图 6)。在分离加和其余的人工组织之前, 尝试切断任何连接, 因为对其他结构的附着将是一个关键点;这一步将提供一个杯状结构组成的膜和视网膜包含视网膜血管 (图 7)。 在脉络膜/RPE 层中创建一个破裂, 将27G 针侧向剩余的杯子, 同时用针尖的边缘刮去外表面。使用破裂作为一个接入点, 以获得对脉络膜/RPE 层的控制, 并撕裂它与两个镊子成条纹, 但保持连接到虹膜完整。 之后, 运行一个镊子下的虹膜和周围的电路从外部, 而创造紧张通过拉在停止的脉络膜/RPE 层, 以实现脱离的组合结构。注意: 虹膜必须断开, 以便在可视化容器时不妨碍荧光 (图 8B)。由于虹膜仍然与周围的组织相连, 所以直接抓取虹膜以去除它会导致广泛的血管损伤, 特别是在内视圈 (IOC)。脉络膜层和视网膜色素上皮 (RPE) 可以分离, 并经常保留与虹膜的连接, 这使得容易的二次切除。 如果虹膜的某些部分不能被移除, 使用一个自然的断裂点成人斑马鱼眼睛展品在感光层 (PL), 以类似的方式4.9 步, 以消除虹膜。 在剩余的杯状视网膜的外侧刮过, 使停在破裂点上方的 PL (图 11C, 黑色箭头)。使用创建的 access 删除图层的上部, 同时保持与虹膜的可能连接完好无损。然后, 运行在虹膜下的镊子, 并在电路中绕去, 在前面提到的分离的组合结构。注: 一个人应该锻炼耐心, 因为整个步骤4.9 可能是困难的, 但这种护理将取得更好的血管结果比直接抓住虹膜在边缘的瞳孔或强迫开放通过破坏连接到脉络膜/RPE 或感光层没有各自的去除。因此, 这一步骤将保护视网膜血管的完整性, 但会导致视网膜外层的损伤。 图 7: 成年斑马鱼眼切除后的加.侧视图显示残存的眼内组织与完整的虹膜和视神经(A)。焦点(B)中带有虹膜的角膜侧视图。在此步骤(C)中对斑马鱼眼的示意图描述。请单击此处查看此图的较大版本. 使用一个切割2.5 毫米直切边缘的显微切割弹簧剪刀, 以尽可能接近视网膜切断视神经;这将允许一个更好的扁平安装的组织。 图 8: 成年斑马鱼眼球切除后视网膜色素上皮/脉络膜和截光神经.视神经侧视图显示视网膜与截断视神经(a)。角膜侧视图, 直接查看到视网膜的最内层(B)。在此步骤(C)中对斑马鱼眼的示意图描述。请点击这里查看更大版本的这个数字。 5. 视网膜血管的安装 在 1x PBS 中冲洗两次解剖的视网膜5分钟。为了在视神经被截断后转移视网膜, 请使用一个带有微勺末端的实验室刮刀, 以避免直接处理暴露的组织。 把一滴 PBS 放在玻璃滑梯上, 然后将视网膜转移到水滴中。使用镊子来保持组织的地方, 而切割杯状结构与手术刀创建一个平坦的四花瓣或五花瓣形状取决于视网膜的大小 (请参见图 9)。 用一张精美的纸把剩下的 PBS 吸干。注意不要触摸视网膜。 在安装介质上涂上平坦的视网膜, 用片覆盖。注意不要制造泡沫, 因为气泡会扭曲视网膜血管的可视化。 尽量减少片的运动, 用清晰的指甲油密封盖子。 6. 视网膜血管的可视化 尽量缩短准备和可视化之间的时间间隔, 通过荧光信号损耗降低图像细节损耗。存储准备好的视网膜血管在4° c, 以减少信号丢失, 如果直接可视化无法实现, 因为图像质量的退化在准备以后慢慢地变得可看见 48 h。 可视化视网膜血管支架通过荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜。注: 通过荧光显微镜进行血管可视化, 达到2.5x 放大倍数, 曝光时间为2.0 秒, 增益为 6.0x, 伽玛设置为1.67。对于共焦显微镜, Ar 激光器 (488 nm/20 兆瓦) 在20% 的功率是使用与 TD 488/543/633 励磁过滤器, 20 x/0.7 NA multi-immersion 目标与 ddH2O 作为浸入介质, 和排放过滤器设置 505-560 nm。共焦的图片是由 4×4, 4×5, 或5×5 的奇异图像组合, 通过瓷砖扫描, 根据视网膜的大小。 7. 斑马鱼视网膜的他部分 注意: 对于斑马鱼视网膜的切片, 按照协议中的描述准备组织, 直到步骤 4.5, 然后直接跳到步骤7.1。 在 1x PBS 中, 洗核眼睛 (4.5 步后) 两次5分钟。然后, 将组织转化为70% 乙醇 (乙醇)。此时, 准备好的眼睛可以储存在4° c, 直到石蜡嵌入。 在石蜡包埋前, 用以下方法冲洗组织: 2×15 最小在80% 乙醇, 2×15 分钟在90% 乙醇, 3×15 min 在96% 乙醇, 3×15 分钟在99% 乙醇, 2×15 分钟在 acetone/99%ethanol (1:2), 3×15 分钟丙酮。将组织石蜡在62° c 过夜。 将新鲜的石蜡加热至62° c, 并将其倒入嵌入模具中。直接将组织转移到模具中, 并以快速的速度控制眼睛的正确方向。然后, 将嵌入的盒式纸盒应用到模具上, 然后用额外的加热石蜡盖住。 在石蜡块冷却后取下嵌入模具。将切片的石蜡块切成10µm 段, 在水面上45° c 的水浴中将其浮在水面上, 使其完全平整。 在45° c 的烤箱中, 在一夜之间把玻璃片上的部分吸干, 然后垂直排水, 除去多余的水分。 进一步处理部分与以下日程表对 deparaffinize 和他污点: 4×1 min 在二甲苯, 1×1 min 在99% 乙醇, 1×1 min 在96% 乙醇, 1×1 min 在80% 乙醇, 1×1 min 在70% 乙醇, 1×1 min 在 ddH2O, 1×4 min 在迈尔的苏木精, 1×10 分钟在 ddH2o, 1x2min 在0.5% 曙红, 1×30 s 在 ddH2o, 1×30 在80% 乙醇, 2×30 s 在96% 乙醇, 3×1 min 在99% 乙醇, 1×1 min 在二甲苯。 把玻璃滑出的二甲苯, 并迅速覆盖的组织与安装媒体。避免让组织完全干燥, 然后在上面放置一个片, 并密封染色组织。