Özet

Sammlung von Post-Paarung Sperma aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane und Messung von Sperma Verflüssigung bei Mäusen

Published: November 18, 2017
doi:

Özet

Sperma-Verflüssigung ist erforderlich für das Sperma aus dem bahnbrechenden Gel befreit zu werden. Diese Studie liefert die Verfahren für das Sammeln von Samen aus dem weiblichen Genitaltrakt Post-Beischlaf und Sperma Verflüssigung Messzeit.

Abstract

Bei Mäusen lagert sich ejakuliert Sperma in die Gebärmutter. Nach der Ejakulation, ändert sich das Sperma von Gel-artige Konsistenz zu wässrig, einen Prozess namens Verflüssigung. In der vorliegenden Studie zeigen wir, wie das Post-ejakuliert Sperma von der weiblichen Fortpflanzungsorgane in einem Mausmodell zu sammeln. Erste, Erwachsene weibliche Mäuse in der Brunst waren über Nacht in einem männlichen Käfig untergebracht. Am nächsten Morgen bestätigte das Vorhandensein von copulator Stecker an die vaginale Öffnung Kopulation. Weibliche Mäuse mit copulator Stecker wurden eingeschläfert, und jeder Fortpflanzungsorgane wurden als Ganzes (Scheide, Gebärmutter, Eileiter, Eierstöcke), gewährleistet ein geschlossenes System, das Sperma enthalten. Die Fortpflanzungsorgane in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch gelegt wurde, und die Scheide war, lassen Sie das Sperma in das Rohr abgeschnitten. Um maximale Samenvolumen für die Analyse zu gewährleisten, dienten zahnlose Zange, die uterine Hörner vom Eierstock Ende vaginalen Ende wegtreiben restlichen Sperma zu quetschen. Die gesamte Fortpflanzungsorgane wurde dann verworfen. Die Sperma-haltigen Röhre wurde kurz nach unten gesponnen. 25 μL Kapillare Pipette wurde in das Rohr in einem Winkel von 180° (Parallel zur Rohrwand) gelegt. Die Zeit genutzt, um das Kapillarrohr, 25 μL Linie zu füllen wurde aufgezeichnet. Sperma von einem bewährten männlichen Züchter dauert in der Regel ca. 60-180 s, ein 25 μL Kapillarrohr zu füllen. Diese Samen-Kollektion-Technik kann auch in anderen downstream-Anwendungen wie Bildbearbeitung und Motilität Spermiogramm verwendet werden.

Introduction

Die weiblichen Fortpflanzungsorgane besteht aus der oberen und unteren Flächen. Den oberen Genitaltrakt umfasst Eileiter, die Gebärmutter und die Endocervix. Die unteren Genitaltrakt umfasst das Ectocervix und der Vagina. Beim Menschen ist das Sperma ejakuliert an der vorderen Wand der Vagina, angrenzend an das Ectocervix1hinterlegt. Bei Mäusen jedoch wird das Sperma in die Gebärmutter innerhalb von Minuten nach der Paarung2gefegt.

Sperma enthält wegweisende Gel, das ist innerhalb von Sekunden der Ejakulation, verursacht die Spermien zu gefangen werden verfestigt und3immobilisiert. Verflüssigung löst das immobilisierte Sperma indem Sie Sperma aus einem gelartigen in eine wässrige Konsistenz ändern. Dieser Prozess ist unerlässlich für die Beweglichkeit der Spermien und Säugetieren Reproduktion. Kenntnis der Samen Verflüssigung basiert hauptsächlich auf in-vitro- Studien, wo Sperma in der Kulturschale verflüssigt wird. Beim Menschen ist die enzymatische Aktivität der Prostata-spezifisches Antigen oder PSA (auch bekannt als Kallikrein-bezogene Peptidase 3 oder KLK3) den größten Anteil zur Verflüssigung durch Hydrolyse von Semenogelins (Gel-bildende Proteine in der Samenflüssigkeit vorhanden)4 ,5,6. Abbau von Semenogelins befreit die Spermien von der bahnbrechenden Koagulum, zunehmende Mobilität der Spermien. Befreit Spermien schwimmen in Richtung Eileiter auf das Ei zu befruchten. Verflüssigung (oder Samen Viskosität) Tests sind eines der standard ersten Vorführungen für Spermiogramm in Fruchtbarkeitskliniken männliche Ergiebigkeit7bewerten.

Ein kürzlich erschienenen Artikel zeigt, dass die Analyse der Samenflüssigkeit gesammelt aus der Maus weiblichen Genitaltrakt Post-Verpaarung verwendet werden, um einen Mangel an Verflüssigung zu illustrieren, die anschließend Fruchtbarkeit Defekte8verursachen können. Defekte Verflüssigung wie Sperma Hyperviskosität trägt zur 11,8-32,3 % der unfruchtbaren Fälle Männer9, darauf hindeutet, dass normale Verflüssigung für Säugetier-Wiedergabe unabdingbar ist. Jedoch haben Studien und Behandlung der Verflüssigung Mängel ausschließlich auf die männlichen7konzentriert. Die Möglichkeit, dass die weiblichen Fortpflanzungsorgane eine Rolle bei der Verflüssigung des Samens spielt ist nicht untersucht worden. Daher werden die Methoden zur Samengewinnung und Verflüssigung Messzeit Forscherinnen eine neuartige Diagnose-Tool um festzustellen, ob Verflüssigung eine der Ursachen der Unfruchtbarkeit bei Modellorganismus von Interesse sein könnte.

Protocol

Alle Tiere und Verfahren, die in dieser Studie wurden nach Washington State University (WSU) Animal Care und Use Committee Richtlinien und unter Einhaltung der WSU zugelassene tierische Protokolle #4702 “und” #4735 bearbeitet. (1) Mäuse Verwenden Sie standard C57BL/6J erwachsenen männlichen Mäusen oder anderen Stämmen von Interesse. Tiere unter einer kontrollierter Temperatur und feuchte Umgebung, mit Ad Libitum Zugang von Wasser und Nahrung zu erhalten.</strong…

Representative Results

Sperma wurde von Strg und KO Weibchen ca. 8 h gesammelt, nach der Paarung mit fruchtbaren Strg-Männchen. Verflüssigung (oder Samen Viskosität) wird durch den Zeitaufwand für die 25 μL Kapillarrohr mit Sperma füllen quantifiziert. Samen gesammelt von Strg Uteri 2.06 ±0.12 min nahm (mean±S.E.M, n = 5), das Kapillarrohr (Abbildung 1) zu füllen. Die Samen gesammelt von KO Uteri dauerte jedoch länger als 60 min (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) experimentelle Zeit. Dies…

Discussion

Sammeln von Samen von Maus Uteri bieten Vorteile gegenüber Samen Analyse in Vitro wie die ehemaligen die physiologischen Wechselwirkungen zwischen den Samen und das Sekret aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane. zeigen können In dieser Studie vorgestellten Techniken erlauben Forschern, Qualität des Spermas sowie Spermien Rentabilität und Motilität in physiologischen Voraussetzungen zu bestimmen. Darüber hinaus gibt es verschiedene nachgelagerte Auswertungen, die mit den Samen gesammelt aus den Ut…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird unterstützt vom Anschubfonds College of Veterinary Medicine (WSU), WW. Die Autoren danken Sierra Olsen (WSU) für kritische Lektüre des Manuskripts.

Materials

Toothpick Diamond 750-Flat Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended
Dissecting scissors Fisher 08-940
Spring scissors Roboz RS-5600
Fine forceps Roboz RS-5045
25-μL glass capillary tube VWR 53432-761
Leibovitz’s L-15 media Life Technologies 11415064 Supplement with 1% FBS
Fetal bovine serum (FBS) Gemini Bio-Products 100-106
1.5-mL microcentrifuge tube Axygen MCT-150-C
2-mL microcentrifuge tube Axygen MCT-200-A
Digital dry block heater VWR 13259-052 For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection
Minicentrifuge Corning LSE 6765
35-mm culture dish VWR 10861-656
15-mL polypropylene centrifuge tube VWR 10025-686
Waterbath Precision TSGP05
Heated stage stereomicroscope Leica Microsystems MZ10F To keep the tissue warm prior to semen collection
Brightfield microscope Leica Microsystems DMi8 Optional. For video imaging of the sperm motility
Camera Leica Microsystems DMC2900 Optional. For video imaging of the sperm motility
Glass slides Fisher 12-552-3 Optional. For video imaging of the sperm motility
Coverslip VWR 48393-059 Optional. For video imaging of the sperm motility
Bleach Dilute in dH2O to 10% concentration

Referanslar

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