Collecte de sperme provenant de l’appareil reproducteur féminin et la mesure de la liquéfaction du sperme chez les souris après l’accouplement
Özet
Liquéfaction du sperme est nécessaire pour les spermatozoïdes de se libérer du gel séminal. Cette étude fournit les procédures de collecte de sperme du coït postérieure de l’appareil reproducteur féminin et mesurer le temps de liquéfaction de sperme.
Abstract
Chez la souris, le sperme éjaculé est déposé dans l’utérus. Après l’éjaculation, le sperme varie de consistance gélifiée aqueuse, un processus appelé liquéfaction. Dans cette étude, nous montrons comment recueillir le sperme éjaculé après de l’appareil reproducteur féminin dans un modèle murin. Tout d’abord, adultes femelles dans la phase d’oestrus étaient logés dans la cage du mâle pendant la nuit. Le lendemain matin, la copulation a été confirmée par la présence du bouchon copulatoire lors de l’ouverture vaginale. Les souris femelles à des bouchons copulateurs ont été euthanasiés, et chaque appareil reproducteur a été recueilli dans son ensemble (vagin, utérus, ovaires, oviductes), assurant un système fermé pour contenir le sperme. L’appareil génital a été placé dans un tube de microtubes de 1,5 mL, et le vagin a été coupé pour libérer le sperme dans le tube. Pour assurer le volume de sperme maximum pour analyse, pinces édentés servaient à serrer les cornes utérines de fin ovarienne à extrémité vaginale expulser le sperme restant. L’ensemble génital a été défaussée. Le tube contenant du sperme a été brièvement tourné vers le bas. Une pipette capillaire 25 μL a été placée dans le tube à un angle de 180° (parallèle à la paroi du tube). L’intervalle de temps utilisé pour remplir le tube capillaire à la ligne 25 de μL a été enregistré. Sperme d’un éleveur mâle éprouvé prend habituellement environ 60-180 s à remplir un tube capillaire 25 μL. Cette technique de collecte de sperme peut aussi être utilisée dans d’autres applications en aval telles que l’analyse d’imagerie et de la motilité du sperme.
Introduction
L’appareil reproducteur féminin est constitué des voies supérieures et inférieures. Les voies génitales supérieures comprennent des trompes de Fallope, l’utérus et l’endocol. L’appareil génital inférieur comprend l’exocol et le vagin. Chez l’homme, le sperme éjaculé est déposé à la paroi antérieure du vagin, adjacent à l’ exocol1. Chez les souris, cependant, le sperme est balayé dans l’utérus quelques minutes après l’accouplement2.
Le sperme contient gel séminal qui est solidifié dans les secondes après l’éjaculation, causant le sperme être pris au piège et immobilisée3. Liquéfaction libère les spermatozoïdes immobilisés en changeant de sperme d’un gélatineuse à une consistance aqueuse. Ce processus est essentiel pour la motilité des spermatozoïdes et de la reproduction chez les mammifères. Connaissance de la liquéfaction du sperme repose principalement sur des études in vitro où le sperme devient liquéfié dans une boîte de Petri. Chez l’homme, l’activité enzymatique de l’antigène spécifique de la prostate ou PSA (également connu sous le nom axés sur la kallikréine peptidase 3 ou KLK3) est le principal contributeur pour la liquéfaction par hydrolyse du semenogelins (formation de gel de protéines présentes dans le sperme)4 ,5,6. Dégradation de semenogelins libère le sperme prélevé le coagulum séminal, accroissement de la mobilité des spermatozoïdes. Libéré des spermatozoïdes nager vers la trompe de Fallope pour féconder l’ovule. Liquéfaction (ou la viscosité du sperme) tests sont parmi les projections initiales standards pour l’analyse de sperme dans les cliniques de fertilité afin d’évaluer la fertilité mâle7.
Un article publié récemment montre que l’analyse du liquide séminal provenant d’appareil reproducteur l’de souris femelle après accouplement peut servir à illustrer une carence en liquéfaction qui peut causer par la suite de défauts de fertilité8. Liquéfaction défectueuse comme sperme hyperviscosité contribue à 11,8-32,3 % des cas peu fertile en hommes9, ce qui suggère que la liquéfaction normale est indispensable pour la reproduction chez les mammifères. Cependant, les études et le traitement des défauts de liquéfaction ont porté exclusivement sur le mâle7. La possibilité que l’appareil reproducteur féminin joue un rôle dans la liquéfaction du sperme n’a pas été explorée. Par conséquent, les méthodes de collecte de sperme et de mesurer le temps de liquéfaction seront aux chercheurs un nouvel outil de diagnostic pour déterminer si la liquéfaction pourrait être une des causes de stérilité chez l’organisme modèle d’intérêt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Collecte de sperme de l’utérus de souris peut fournir des avantages par rapport aux sperme analyse in vitro que l’ancien peut illustrer les interactions physiologiques entre le sperme et les sécrétions de l’appareil reproducteur féminin. Les techniques présentées dans cette étude permettent aux chercheurs de déterminer la qualité du sperme ainsi que la viabilité de sperme et la motilité dans des conditions physiologiques idéales. En outre, il existe diverses analyses en aval qui peuven…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par le Fonds de lancement du Collège de médecine vétérinaire (UWS) à WW. Les auteurs remercient Sierra Olsen (UWS) pour une lecture critique de ce manuscrit.
Materials
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
Referanslar
- Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
- Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
- Lilja, H. Cell biology of semenogelin. Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).
- Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
- Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
- Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
- Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
- Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).
- Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , (2017).
- Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
- Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).
