Özet

Bir Neural ağ tabanlı kimlik gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz fare köklerin yumurta

Published: March 03, 2018
doi:

Özet

Burada, non-invaziv oosit gelişimsel yetkinlik metafaz II sahneye germinal vezikül–dan onların vitro olgunlaşma sırasında gerçekleştirilen değerlendirilmesi için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem zaman hata görüntüleme partikül imaj velosimetri (PIV) ve neural ağ analizleri ile birleştirir.

Abstract

Kısırlık klinikler beceriksiz yumurta gelişim yetkili vs böylece genel gebelik sonucu artırmak non-invaziv yordamları kullanarak seçmek için yeteneğinden yararlanırlar. Biz son zamanlarda geliştirilen sitoplazmik hareketleri analiz tarafından takip metafaz II sahneye germinal vezikül (GV)–dan onların vitro olgunlaşma sırasında fare yumurtalar, mikroskobik canlı gözlem dayalı bir sınıflama yöntemi hızlandırılmış bu dönemde meydana gelen. Burada, bu yordamın ayrıntılı protokolleri mevcut. Yumurtalar köklerin antral folikül izole ve 37 ° C ve % 5 CO2hızlandırılmış analiz için donatılmış bir mikroskop içinde 15 h için kültürlü. Resimler 8 dk aralıklarla alınır. Görüntüleri hesaplar, her yumurta için sitoplazmik hareket hızları (CMVs) kültür süresince meydana gelen profil partikül imaj velosimetri (PIV) yöntemi kullanılarak analiz edilir. Son olarak, her tek yumurta CMVs gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz %91.03 bir hassasiyetle olmak bir gamet olasılığını öngörür bir matematiksel sınıflandırma aracı (Feed-ileri yapay sinir ağı, FANN), üzerinden beslenir. Bu iletişim kuralı için fare, kurmak, şimdi insanlar da dahil olmak üzere diğer türlerin yumurta üzerinde test olabilir.

Introduction

Kadın kısırlığı kadınlar giderek artan sayıda etkiler bir patoloji olduğunu. Dünya Sağlık Örgütü göre çiftlerin % 20 civarında infertil kadın infertilite nedeniyle % 40 ile. Buna ek olarak, kanser tedavisi gören kadınların üçte biri (300.000/yıl ve 30.000/yıl ABD yada İtalya, sırasıyla) erken yumurtalık yetmezliği geliştirmek.

Kanser hastalarında infertilite önlemek için bir strateji yalıtım ve dondurma vitro olgunlaşma (IVM) tarafından takip Onkolojik tedavi öncesi yumurtalık köklerinin GV yumurta MII sahneye (GV MII geçiş) olmuştur. Non-invaziv işaretleri oosit gelişimsel yetki durumu gübreleme ve gelişim süreçleri ve genel gebelik başarı1,2artıracak.

Supravital fluorochrome Höchst 33342, ile boyama sonra gözlenen onların Kromatin yapılandırmasına göre memeli köklerin yumurtalar bir çevrili çekirdekçik (SN) veya değil çevrili çekirdekçik (NSN)3olarak sınıflandırılır. Onların farklı Kromatin organizasyon yanı sıra yumurta bu iki tür pek çok morfolojik ve fonksiyonel farklılıklar3,4,5,6,7,8 görüntülemek. ,9onların segregasyonun ve gelişimsel yeterlilik dahil olmak üzere,. Yumurtalıktan izole ve olgunlaştı vitro, her ikisi de yumurta eriþiminden MII sahne yazın ve sonra sperm tohumlama, 2-hücre Sahne Alanı’na geliştirmek, ama sadece bu SN Kromatin kuruluş ile dönem9‘ a gelişebilir. İyi olmamakla birlikte yetkili vs beceriksiz yumurta seçmek için bir sınıflama yöntemi, en büyük dezavantajı fluorochrome kendisi ve her şeyden önce onun algılama için kullanılan UV ışık hücreleri üzerinde olabilir mutajenik etkisi olduğunu.

Tüm bu nedenlerden dolayı aynı yüksek sınıflandırma doğruluğu korurken Höchst kullanımı yerine olabilir SN veya NSN Kromatin uyum ile ilişkili diğer non-invaziv işaretçileri için aradık. Sitoplazmik hareket hızları (CMVs) hızlandırılmış gözlem bir özellik olarak hücre durumu farklı çıkmaktadır. Örneğin, son yıllarda yapılan çalışmalarda zamanda gübreleme ve fare ve insan zigotları kapasitesi tam Preimplantasyon ve tam dönemlik geliştirme10,11CMVs arasındaki ilişkiyi kaydedilen gösterdi.

Bu daha önceki çalışmalar üzerinde bağlı olarak, biz burada gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz fare köklerin yumurta5,6,7,8tanınması için bir platform tanımlamak. Platform üzerinde üç ana adım dayanmaktadır: 1) antral folikül izole yumurta ilk olarak çevrili çekirdekçik (SN) ya da değil-çevrili çekirdekçik (NSN); onların Kromatin yapılandırmasına ya göre sınıflandırılır 2) her tek yumurta GV MII geçişi sırasında meydana gelen CMVs hızlandırılmış görüntülerini alınır ve analiz partikül imaj velosimetri (PIV); ve 3) PIV ile elde edilen veriler ile bir besleme ileri yapay sinir ağı (FANN) kör sınıflandırma12,13analiz edilir. Fareyi test ve diğer memeli türler için (Örneğin, sığır, maymun ve insanlar) kullanılan mevcut hazır yapmak için tasarlanmış yordam en kritik adımları ayrıntılarını ver.

Protocol

Tüm yordamları hayvanları içeren kurumsal hayvan bakım ve kullanım ve Pavia Üniversitesi, etik Komiteler tarafından kabul edildi. Hayvanlar 22 ° C, % 60’ı hava nemi ve 12:12 saat ışık/karanlık döngüsünü koşullar altında muhafaza. 1. yumurtalık yalıtım İntraperitoneally 2 dört onbir haftalık CD1 dişi fareler 10 U folikül uyarıcı hormon bir steril 1 mL insülin şırınga ile enjekte. 46-48 h bekleyin. Fare tartmak ve 50 mg/kg Zoletil (…

Representative Results

Şekil 2 bir temsilcisi gelişimsel olarak yetkili ve beceriksiz oosit sırasıyla (GV) başında ve sonundaki (MII) IVM yordamı gösterir. Köklerin fare yumurta IVM 15 h kültür sırasında oluşur. Hızlandırılmış gözlem mayoz ilerleme kaydeder ve GVBD ve Ekstrüzyon ilk kutup vücudun da dahil olmak üzere önemli segregasyonun olayları algılar. Analiz ve daha–dan iki – yüz beceriksiz…

Discussion

Bir fare yumurta yanı sıra bu diğer türler ile bu iletişim kuralı yaparken dikkat çekmek birkaç kritik adım vardır. Arkadaşı kümülüs ayrılması Tetikleyicileri hücreleri gibi bir zamanlar onların köklerinin yumurtalar hemen kayıt damla aktarılması gerektiğini GV MII geçişin başlangıcını. Olası bir değişiklik mevcut iletişim kuralına COCs yalıtımı için kullanılan M2 orta 3-İzobütil-1-methylxanthine (IBMX) ek olabilir. IBMX hemen GV MII geçiş tetikleyen engeller ve yumurtalar tama…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser tarafından destek sayesinde mümkün yapıldı: Pavia Üniversitesi FRG 2016; Parma Üniversitesi FIL 2014, 2016; ve bu çalışma taşımak için gerekli plasticware temini için Kinesis. Dr. Shane Windsor (Mühendislik Fakültesi, University of Bristol, İngiltere) Cell_PIV yazılım sağlamak için teşekkür ederiz.

Materials

Folligon Intervet A201A02 Hormonal treatment
Hoechst 33342  Sigma-Aldrich B2261 For oocyte heterochromatin staining
Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm  Corning  430165 For COCs isolation
EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red Merck-Millipore MR-015-D For COCs isolation
MEM Alpha medium (1X) + Glutamax  Sigma-Aldrich M4526 For oocyte in vitro maturation
Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom  WillCo  GWSt-3522 For imaging experiments
BioStation IM-LM  Nikon MFA91001 Live cell screening system 
Pasteur pipette Delchimica Scientific Glassware 6709230 For follicles manipulation
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410 To prevent contamination and medium evaporation
Penicillin / Streptomycin Life Technologies 15070063 To prevent medium contamination 
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich ML16141079 For making up αMEM medium 
L-Glutamine  Life Technologies 25030 For making up αMEM medium 
Taurine Sigma-Aldrich T0625 For making up αMEM medium 
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3310 For making up αMEM media
Sodium pyruvate  Sigma-Aldrich  P4562 For making up αMEM media
Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) Virbac Srl QN01AX9 For mice anesthesia
Cell_PIV sofware  Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK                 -                 -
MATLAB The MathWorks, Natick, MA                  - For multi-paradigm numerical computing

Referanslar

  1. Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
  2. Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
  3. Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
  4. Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
  5. Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
  6. Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
  7. Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
  8. Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?. Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
  9. Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
  10. Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
  11. Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
  12. Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
  13. Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Cavalera, F., Zanoni, M., Merico, V., Bui, T. T. H., Belli, M., Fassina, L., Garagna, S., Zuccotti, M. A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes. J. Vis. Exp. (133), e56668, doi:10.3791/56668 (2018).

View Video