Une Identification sur le réseau neuronale d’ovocytes adulte souris développemental compétent ou incompétent
Özet
Nous présentons ici un protocole pour une évaluation non invasive de la compétence du développement ovocytes effectué au cours de leur maturation in vitro de la vésicule germinative au stade métaphase II. Cette méthode combine l’imagerie Time-lapse avec vélocimétrie par image de particules (PIV) et les analyses de réseau neuronal.
Abstract
Cliniques d’infertilité bénéficierait de la possibilité de sélectionner développemental compétente vs les ovocytes incompétent à l’aide de méthodes non effractives, afin d’améliorer le résultat global de la grossesse. Nous avons récemment mis au point une méthode de classification basée sur des observations microscopiques vivantes des ovocytes de souris au cours de leur maturation in vitro de la vésicule germinale (GV) au stade métaphase II, suivie de l’analyse des mouvements cytoplasmiques survenant au cours de cette période Time-lapse. Nous présentons ici des protocoles détaillés de cette procédure. Les ovocytes sont isolés des follicules antraux entièrement cultivés et cultivés pendant 15 h à l’intérieur d’un microscope équipé pour l’analyse de Time-lapse à 37 ° C et 5 % de CO2. Les photos sont prises à intervalles de 8 min. Les images sont analysées à l’aide de la méthode Particle Image Velocimetry (PIV) qui calcule, pour chaque ovocyte, le profil des vitesses de mouvement cytoplasmique (CMV) qui se produisent tout au long de la période de culture. Enfin, la CMV de chaque ovocyte unique est alimentés par un outil de classification mathématique (réseaux de neurones artificiels Feed-forward, FANN), qui prédit la probabilité d’un gamète développemental compétent ou incompétent avec une précision de 91.03 %. Ce protocole, mis en place pour la souris, pourrait maintenant être testé sur d’autres espèces, y compris les humains, les ovocytes.
Introduction
Infertilité féminine est une pathologie qui affecte un nombre croissant de femmes. Selon l’Organisation mondiale de la santé, environ 20 % des couples sont infertiles, avec 40 % à cause de l’infertilité féminine. En outre, un tiers des femmes subissant des traitements contre le cancer (300 000/an et 30 000/an dans les USA ou l’Italie, respectivement) développent une insuffisance ovarienne prématurée.
Une stratégie visant à prévenir l’infertilité chez les patients atteints de cancer est l’isolement et la cryoconservation des follicules ovariens avant le traitement oncologique, suivie de la maturation in vitro (MIV) d’ovocytes GV à l’étape MII (transition GV-à-MII). La disponibilité de marqueurs non-invasifs de compétence développementale d’ovocytes améliorerait la fécondation et processus de développement et le succès de grossesse globale1,2.
Selon leur configuration de chromatine observée après coloration au supravitale fluorochrome Hoechst 33342, mammifères adulte ovocytes sont classés soit comme un nucléole entouré (SN) ou un nucléole pas entouré (RSN)3. En plus de leur organisation de la chromatine différents, ces deux types d’ovocytes affichent plusieurs différences morphologiques et fonctionnelles3,4,5,6,7,8 ,9, y compris leur compétence méiotique et du développement. Lorsque isolée de l’ovaire et portées à maturation in vitro, les deux type d’ovocytes portée la scène MII et après insémination de sperme, se développent à l’étape 2-cell, mais seulement ceux avec une organisation de la chromatine SN peuvent se développer à terme9. Mais bon comme une méthode de classification pour sélectionner compétente vs incompétent ovocytes, le principal inconvénient est l’effet mutagène qui le fluorochrome lui-même et, surtout, la lumière UV utilisé pour sa détection pourraient avoir sur les cellules.
Pour toutes ces raisons, nous avons cherché des autres marqueurs non-invasifs associées à la conformation de la chromatine SN ou DSN qui pourrait remplacer l’utilisation de Hoechst, tout en conservant la même précision de classement élevé. La Time-lapse observation des vitesses de mouvement cytoplasmique (CMV) s’impose comme une caractéristique distinctive de l’état de la cellule. Par exemple, des études récentes ont démontré que l’association entre le CMV enregistré au moment de la fécondation et la capacité des souris et des zygotes humains complet préimplantatoire et nés à terme développement10,11.
Se fondant sur ces études antérieures, nous décrivons ici une plateforme pour la reconnaissance des souris développemental compétent ou incompétent ovocytes adulte5,6,7,8. La plate-forme est basée sur trois étapes principales : 1) ovocytes isolés des follicules antraux sont classés d’abord selon leur configuration de chromatine soit comme un nucléole entouré (SN) ou un nucléole n’est pas entouré (NSN) ; 2) images Time-lapse de CMV survenant lors du passage de GV-à-MII de chaque ovocyte unique sont prélevés et analysés par vélocimétrie par image de particules (PIV) ; et 3) les données obtenues avec PIV sont analysées avec un réseau neuronal artificiel de Feed-forward (FANN) pour aveugles classification12,13. Nous donnons les détails des étapes plus critiques de la procédure destinée à la souris pour le rendre prêt à être testé et utilisé pour les autres espèces de mammifères (p. ex., les bovins, singe et l’homme).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a plusieurs étapes critiques, on s’occupe de tout en effectuant ce protocole avec les ovocytes de souris ainsi qu’avec celles d’autres espèces. Une fois isolés de leurs follicules, ovocytes doivent être immédiatement transférés dans les gouttes de l’enregistrement, comme la séparation d’avec le cumulus compagnon cellules déclenche le début de la transition de GV-à-MII. Une modification éventuelle du présent protocole pourrait être l’ajout de la 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) au milieu de…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été rendu possible grâce au soutien de : l’Université de Pavie RFA 2016 ; Université de Parme FIL 2014, 2016 ; et Kinesis pour alimenter les contenants de plastique nécessaire pour réaliser cette étude. Nous remercions le Dr Shane Windsor (Faculté de génie, Université de Bristol, Royaume-Uni) pour fournir le logiciel Cell_PIV.
Materials
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
Referanslar
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