高スループット シロイヌナズナ種子の殺菌のための標準化された方法

1。 培地、培 (MS) 媒体 x 1 の準備 0.8 L 蒸留水と溶解する攪拌を含むビーカーに 追加 4.31 g MS 基底の塩の混合物、10 g ショ糖と 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic の 0.5 g の酸 (MES)。チェックし、1 M 水酸化カリウム (KOH) を用いた 5.7 に pH を調整します。追加蒸留水 1 l. は、2 つの 1 L ボトル 500 mL にメディアを分割します。それぞれのボトルに寒天 5 g を追加します。蓋が緩い保つ。 121 ° c、15 psi 電磁攪拌棒瓶の中で 20 分間オートクレーブします。 、オートクレーブから出した後低速で攪拌板にボトルを配置し、MS 培地 (ボトルが素手で実施される) まで 45-50 ° C に冷却するを許可します。 この手順から始まって、層流フードの無菌状態ですべての手順を実行します。500 μ l 添加 Gamborg ' s ボトル各ビタミン ソリューションを均等に分散させる MS 培地を攪拌しビタミン ソリューションです。 プレート約奥行きの板の半分をカバーするために十分なメディアを注ぐ。 寒天を固めるように約 1 時間室温で冷却するプレートを許可します 。 注: プレートは、すぐに使用することが、プラスチックでそれらをラップし、4 ° C (冷蔵庫温度) で格納します。カバー プレート、ボックス、または凝固寒天管気密の容器で 4 ° C で数週間のため格納できます。 2。漂白剤とシロイヌナズナ種子の滅菌 プロトコルのセクション 1 に従って準備 MS プレート。オートクレーブの MS メディアとして同時に蒸留水 100 mL。これを使用後に洗浄水と種を中断させてめっきで支援するために. 注: 必要な場合 0.8% 寒天ブレンド (w/v) (例えば phytagar) することができますこの手順でオートクレーブ。寒天のブレンドは、めっき中に蒸留水を置き換えることができます (ステップ 2.5.3。)。寒天のブレンドの余分な粘度やすくプレートや植物の種子をスペース行で必要に応じてします。 準備 50% (v/v) は、種子を殺菌するためのソリューションを漂白剤します。漂白剤を希釈して 100 mL の蒸留水に漂白剤 100 mL を追加します。漂白剤溶液にトゥイーン 20 洗剤の 50 μ L を追加します 。 注: 準備された漂白剤の解決に格納できる限り無菌状態で開くのみ月まで。 1.5 mL 遠心チューブに分注 100 種。 50% の漂白剤溶液を用いた種子を滅菌します。 層流フードの種子を含む遠心チューブに 50% 漂白液 500 μ L を追加。漂白剤溶液で種子を中断するチューブの下端をタップします 。 注: また、回転子またはプラットフォーム シェーカー可能性があります使用する中断された種子を維持する。 チューブから漂白液をリンスします。 10 分後ピペットまたは端にピペット チップ装備アスピレーターを使用して遠心チューブから漂白剤溶液を削除します。 チューブの滅菌蒸留水の追加 500 μ L。チューブを閉じ、ミックスに反転します。管の底に沈殿するための種子を許可します。種子はチューブの底に落ち着いて慎重に一度は、ピペッティングにより漂白剤溶液を削除します。洗浄プロセス 6 回この手順を繰り返します。 種子を中断する管にオートクレーブ蒸留水 1 mL を追加します。 MS プレート滅菌種子をプレートします。 層流フードの銘柄名と現在の日付と MS 板の下部のラベルします。 は、MS プレート遠心チューブから種を注ぐ。滅菌、使い捨ての接種ループまたは滅菌ピペット チップを使用して MS 平板まわりの種を広めるためです 。 注: 行にまかれた種が、先端が 200 μ L ピペットが個別に種子を目的の位置に配置する使用ことができます。種の流れを高めるためには、ピペット チップの終わりははさみを使用して 3 〜 5 mm でトリミングことができます。任意の見当違い種子や種のクラスター、位置を変更することができますまたは滅菌の単回使用接種ループを使用して分離します。 はの後ろで MS プレートを置き、蓋を半分閉めた状態層流フードの。MS プレートから蒸発する水分をできるようにします。 は、MS プレートに蓋を配置します。シール用紙多孔手術でプレートをラップすることにより MS 板テープ (材料の表 を参照してください). 3。塩素ガスによるシロイヌナズナ種子の滅菌 プロトコルのセクション 1 に従って準備 MS プレート。オートクレーブの MS メディアとして同時に蒸留水 100 mLこれは、めっきで支援するために種子を中断する後で使用されます 。 注: 必要な場合 0.8% 寒天ブレンド (w/v) (例えば phytagar) することができますこの手順でオートクレーブ。寒天のブレンドは、めっき中に蒸留水を置き換えることができます (ステップ 3.6.2。)。寒天のブレンドの余分な粘度やすくプレートや植物の種子をスペース行で必要に応じてします。 滅菌を開始、する前に漂白剤と塩酸 (HCl) の塩素ガスを作り出すために必要な金額を計算します。 6.1% Cl 2 滅菌に必要なを生成する必要がある塩酸の量を計算します。 は、次の数式を使用して: 滅菌コンテナーのボリュームとして 7,000 mL と 6.1% Cl 2 として塩酸の量は、3 mL に計算されます 。 注: コンテナーと % の Cl 2 の別のボリュームの計算を実行するようにプログラム スプレッドシートは、補足表 1 として提供されます。 0.5 mL 遠心チューブに分注 100 種。各バイアルのキャップを閉じて、プラスチック ラックにバイアルを配置、脇を設定します 。 注: 種子は適切な条件に格納されている限り、この時点で時間の長時間にわたって格納できます。保管条件は、リベロや同僚 4 プロトコルのセクション 3.3.2 で見つけることが。96 ウェル プレート形式も使用できます。 塩素ガス滅菌に必要な材料を準備します。 漂白剤と塩酸をそれらの格納場所から取得します。 カット手順 3.5.3 で使用する大規模なパラフィンのストリップ映画 (材料の表 を参照してください). 滅菌コンテナーのシールにします。 は、滅菌が発煙のフードの中の場所を取る、ふた付きのプラスチックの容器を置きます。すべての種子のバイアルのキャップを開くし、プラスチック コンテナー内種全体ラックを置きします。 室温で塩素ガス滅菌を行う 。 注意: 漂白剤と酸を分離して使用します。流出のリスクを軽減する上限なしいずれかのボトルを放置しないでください。手袋、白衣など適切な個人用保護具 (PPE) を使用します。漂白剤や酸は、手袋にはね、他の材料を処理する前に手袋を変更します。漂白剤や酸汚染の場合発煙のフードで手袋を必ず取り外してください。 コンテナー内の 250 mL のビーカーを置き漂白剤 100 mL を追加します 。 注: HCl と漂白剤の反応には、漂白剤の少なくとも 22 ボリューム過剰が必要です。反応は、HCl を消費し、副産物として水と塩化ナトリウム (NaCl) の Cl 2 ガスを解放することによって漂白剤します。大過剰の漂白剤を使用すると、追加の HCl d の消費処分のためのソリューションを中和するために必要な時 (NaHCO 3) 炭酸水素ナトリウムの量を減らすガス抜き期間 。 注意: ビーカーは漂白剤 + HCl の総液量の少なくとも 2 倍にする必要があります。これは種子をダメージ、漂白剤衣服や露出した皮膚に書き込む次のステップ中にビーカーをエスケープ水しぶきを防ぐことができます。 は、漂白剤を含むビーカーに塩酸 3 mL を追加します 。 注意: 最初の反応ガス濃度 6.1% 以上で特に気泡が生成されます。長袖の白衣はこの手順が必要です。 滅菌コンテナーを閉じるし、すぐにパラフィン フィルムでそれを封印します。 ガスの蓄積を確実に滅菌時の滅菌コンテナーの監視; 塩素ガスの蓄積はコンテナーの中のかすかな黄色煙霧として表示する必要があります 。 注意: 定期的にチェックの中の圧力が蓋を落選しないように滅菌コンテナーまたはパラフィン フィルム。蓋が空いている来ているパラフィン フィルムが緩んでいる場合、蓋を閉めるし、慎重にパラフィン フィルムのレイヤーが追加されたコンテナーをラップします。 後の 1 h 滅菌はパラフィン フィルムを取り外して、1 つのコーナーのカバーを開く期間、コンテナーを開きます。反応を完了させるし、塩素ガスを排除するため 3 時間を発散するコンテナーを許可します。 シード ラックですべての遠心チューブのキャップを閉じます 。 注: 滅菌種子は乾燥した状態で格納されている限り、めっき時間まで格納できます。 シード ラックを削除し、層流フード。 は塩素ガス反応 追加 1.5 g NaHCO 3 粉末漂白剤/塩酸溶液を含むビーカーにゆっくりを中和し、ソリューションに NaHCO 3 を分解するガラス棒でかき混ぜます。二酸化炭素 (CO 2) 気泡が形成を停止するまで NaHCO 3 の追加を続行します 。 注意: 追加の飛散を防ぐためにゆっくりと。手袋、白衣など適切な PPE を使用します。 テストの pH ストリップまたは pH メーターを使用して、ソリューションの pH。溶液の pH まで必要がニュートラルの場合追加 NaHCO 3 を追加 (pH 7.0)。ソリューションがヒューム フードから削除され、すべての該当する処分ガイドラインに従って処分この時点 。 警告: 処理中に任意のにおいを気づいた場合、ソリューション必要がありますすぐに返されヒューム フード。 MS プレート滅菌種子をプレートします。 層流フードの銘柄名と現在の日付と MS 板の下部のラベルします。 種子を中断する各微量遠心チューブの滅菌蒸留水の追加 500 μ L。MS のプレート上に種子を注ぎ、滅菌、使い捨ての接種ループまたは滅菌ピペット チップを使用してプレート全体に均一に種子を広げ。 はの後ろで MS プレートを置き、蓋を半分閉めた状態層流フードの。MS プレートから蒸発する水分をできるようにします。 は、MS プレートに蓋を配置します。多孔質紙サージカル テープでプレートをラップすることにより MS プレートをシールします。 4。MS 板でシロイヌナズナの成長 は 4 ° C、湿度で 3 日間の上ふた付きプレートを配置します 。 注: このプロセスは階層と呼ばれる、個々 の種子の発芽を同期するを提供しています。 プレートを生育環境に転送します。 23 ° C で維持温度および光 120-150 µmol/m 2 s 16 h 光/暗い 8 h で日長。培地に根が育つので、上部のふたの育てる環境にフラット プレートを配置します。 プレートの苗は、8 日間の成長させ 。 メモ: 8 日間成長は遅く発芽する種子の発芽できます。すべての種子が発芽した場合 8 日より早くプレートを獲得することができます。 発芽率をスコアします。 レコード発芽して、芽が種子の数。発芽率を計算する種子の発芽数を割る皿の上の種の合計数で 。 メモ: 発芽幼根が種皮外投影は、2 個の子葉が表示されるときに数えられます。 も種子滅菌条件の有効性を判断する型によって影響を受けるの数をカウントします。