Metodi alternativi In Vitro per la determinazione dell'integrità strutturale del capside virale

Norovirus umana è responsabile di un onere considerevole sanità pubblica a livello mondiale, causando malattie circa 685 milioni e 212.000 morti annualmente¹, ad un costo di miliardi di dollari^2,3. Oggi, quantificazione e norovirus rilevamento coinvolge amplificazione del genoma e/o piattaforme basate su ligando. Il primo è generalmente preferito quanto è più sensibile, fornisce informazioni quantitative e ha generalmente più a basso rischio di risultati falsi positivi⁴. La tecnica più comune norovirus rilevazione e quantificazione del genoma amplificazione è reazione a catena della polimerasi quantitativa della trascrittasi inversa (RT-qPCR). Perché esso è destinato e amplifica un piccolo segmento del genoma umano norovirus, RT-qPCR da solo non è in grado di discriminare tra infettive e particelle non infettive, come RNA genomico gratis, danneggiato capsidi contenenti genomi e capsidi con fatalmente genomi mutati/troncato possono ancora essere amplificati da RT-qPCR. Mentre due nuove in vitro tecniche colturali per norovirus umano^5,6 sono state segnalate recentemente, entrambi ancora contare su RT-qPCR per quantificazione del virus e non sono ancora metodi fattibile per la routine clinica/ambientale test per i norovirus umani. Così, RT-qPCR rimane il gold standard per test clinici/ambientali.

Nel tentativo di valutare meglio lo stato di infettività delle particelle norovirus sono stati sviluppati altri metodi in vitro . Questi metodi possono essere classificati generalmente come quelli che riguardano l’integrità del capside norovirus e quelli valutando l’integrità genomica. Il primo approccio è più popolare. Un metodo comunemente usato è il pretrattamento di RNAsi prima dell’estrazione di RNA genomico virale, tuttavia questo non tiene conto per le particelle virali che rimangono intatte, ma mancano la capacità di legare i recettori/co-fattori dell’ospite, come pure le particelle virali che fatalmente hanno mutato o hanno troncato o danneggiato marginalmente genomi⁷. L’integrità del capsid possa anche essere valutato basato sulla capacità del virus di legarsi al norovirus umano co-receptor/co-fattori, che sono carboidrati conosciuto come antigeni di gruppo di histo-anima (HBGAs). HBGAs sono presenti in cellule epiteliali intestinali di host come parte di glicoproteine o glicolipidi (tra altri tessuti multipli) e può essere secreto nei fluidi corporei come la saliva. Batteri enterici contenenti sostanze simil-HBGA sulle loro superfici inoltre sono stati indicati per associare norovirus umano^8,9,10, e tali interazioni possono promuovere norovirus infezione⁵. Il concetto di base dell’associazione HBGA di utilizzazione è che solo le particelle virali in grado di legare il putativo recettore/co-factor sarebbe in grado di infettare altre cellule. Gli studi multipli suggeriscono che l’associazione di HBGA basati su perlina precedente amplificazione degli acidi nucleici è un metodo promettente per infettività discriminazione^{11,12,13,14, 15,16}. Una sfida importante per quanto riguarda HBGAs è che nessun singolo tipo HBGA possibile associare tutti i genotipi umani norovirus. Per risolvere questo problema, porcina mucina gastrica, che contiene HBGAs, è stata utilizzata al posto di carboidrati HBGA purificati nell’interesse di facilità di sintesi, coerenza e costi ridotti.

Una recente pubblicazione di Moore et al. ¹⁷ ha introdotto una serie di nuove tecniche per la stima dell’integrità umana norovirus capside. Al posto di HBGAs, Moore et al. ¹⁷ studiato il legame di un largamente reattivo dell’acido nucleico aptamero (M6-2)¹⁸ e largamente reattivo anticorpo monoclonale (NS14)¹⁹ al trattato termicamente capsidi di norovirus GII.4 Sydney (particelle virus-like o VLP) e rispetto a questo per l’associazione HBGAs sintetico. Acido nucleico aptameri sono breve (~ 20-80 nt) singolo incagliato acidi nucleici (RNA o ssDNA) che piegare in strutture tridimensionali uniche in conseguenza della loro sequenza e una destinazione. Perché sono gli acidi nucleici, sono meno costosi; facilmente chimicamente sintetizzati, purificati e modificati; e stabile al calore. Esistono parecchi rapporti di aptameri generati contro i norovirus, con alcuni di loro mostrando ampia reattività ad una varietà di ceppi^18,20,21,22. A titolo di esempio, Moore et al. ¹⁷ hanno dimostrato quel aptamero M6-2 associato a capsidi norovirus umano purificato, assemblati (VLPs) e si sono comportati allo stesso modo di HBGA nell’affidamento sulle proteine del capside virale per mantenere la struttura della proteina di più alto ordine (ad es., secondaria e terziaria) per si verifichi l’associazione. D’altra parte, una percentuale significativa di legame norovirus VLP anticorpo NS14 rimase dopo capsidi erano completamente denaturati. Valutazione di norovirus associazione nello studio di Moore et al. ¹⁷ è stato fatto utilizzando un metodo semplice, basato su piastra, simile a ELISA, con l’eccezione che aptameri sono usati al posto di anticorpi (quindi il metodo è stato chiamato ELASA). Questo metodo sperimentale di throughput elevato è stato utilizzato per valutare gli effetti dei diversi trattamenti sul capside di norovirus, lavoro che è prezioso per la comprensione del meccanismo di inattivazione virale sull’esposizione a fattori di stress fisici o chimici. Tuttavia, uno svantaggio di questo metodo è la sensibilità e la mancanza di tolleranza per matrix-collegata di contaminanti a livelli più alti che causano il legame non specifico di aptameri inferiore.

Moore et al. ¹⁷ utilizzato un altro metodo, diffusione dinamica della luce (DLS), per monitorare l’aggregazione delle particelle virali in risposta ad un trattamento termico. DLS è comunemente usato per valutare la dimensione delle sospensioni di nanoparticella ed è stato esteso a proteine^23,24 e virus^25,26,27. L’intensità della luce diffusa dalle particelle in soluzione varia in funzione della dimensione delle particelle, consentendo per il calcolo del coefficiente di diffusione e quindi diametro della particella mediante formule ben consolidate. La tecnica di liste di distribuzione in grado di distinguere il diametro idrodinamico delle particelle disperse nanometriche, che permette la rilevazione di virus dispersi, proteine del capside individuali o dimeri e aggregati di virus basati su dimensioni²⁷. Aggregazione di virus, rappresentato da un aumento della dimensione delle particelle, è indicativo di perdita di integrità del capside. Mentre le proteine del capside è denaturato e sua struttura interrotti, residui idrofobici diventano esposti e causano le particelle stare insieme e formare aggregati. Liste di distribuzione può essere utilizzato per misurare la dimensione delle particelle dopo un trattamento specificato o la cinetica di aggregazione in tempo reale^17,28. Questo metodo ha il vantaggio di permettere l’osservazione del comportamento del capsid in soluzione ma richiede alte concentrazioni del capside purificata, che non può essere interamente rappresentativa del virus nel suo stato naturale.

L’ultimo metodo utilizzato da Moore et al. ¹⁷ era microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Sebbene questo metodo manca di sensibilità e non produce dati quantitativi, consente per la visualizzazione degli effetti di diversi trattamenti sulla struttura del capside virale. Anche se non è ancora ideale per impostazioni cliniche/ambientale, l’uso di questi metodi in combinazione è utile nella comprensione umana norovirus inattivazione. Lo scopo di questo articolo è quello di fornire approfondite protocolli per l’analisi di associazione basata su piastra (ELASA), DLS, e TEM preparazione metodi utilizzati per studiare gli effetti dei trattamenti termici sul capside di norovirus nel contesto degli effetti dei trattamenti sul capside integrità come presentato in Moore et al. ¹⁷.