Alternative In-vitro- Methoden zur Bestimmung der viralen Kapsid strukturelle Integrität

Menschlichen Norovirus ist verantwortlich für eine beträchtliche öffentliche Gesundheit Belastung weltweit verursacht ca. 685 Millionen Erkrankungen und 212.000 Todesfälle jährlich¹, zu einem Preis in den Milliarden von Dollar^2,3. Heute, beinhaltet Norovirus-Erkennung und Quantifizierung Genom Verstärkung bzw. Liganden-basierten Plattformen. Ersteres wird in der Regel bevorzugt, da es empfindlicher ist, quantitative Informationen liefert und in der Regel geringere Gefahr von falsch-positive Ergebnisse^{4 hat}. Die am häufigsten verwendete Norovirus Erkennung und Quantifizierung Genom Verstärkung Technik ist Reverse Transkriptase quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Denn es richtet sich an und ein kleines Segment des menschlichen Norovirus-Genoms verstärkt, RT-qPCR allein ist nicht in der Lage, die Unterscheidung zwischen dem infektiösen und nicht-infektiöse Partikel als kostenlose genomischen RNA, beschädigt tödlich Capsids mit Genomen und Capsids mit mutiert/abgeschnitten Genome können durch RT-qPCR noch verstärkt werden. Während vor kurzem zwei neue in-vitro- Kultivierung Techniken für menschliche Norovirus^5,6 gemeldet wurden, beide noch verlassen sich auf RT-qPCR Virus Quantifizierung und noch nicht machbar Methoden für die routinemäßige klinische/Umwelt Tests für menschliche Noroviren. RT-qPCR bleibt daher den Goldstandard für klinische/Umwelttests.

Andere in-vitro- Methoden entstanden in dem Bemühen, die Infektiosität Status des Norovirus Partikel besser abschätzen zu können. Diese Methoden können in der Regel als diejenigen, die die Integrität der Norovirus Kapsid ansprechen und die Bewertung von Genom Integrität kategorisiert werden. Das erste Verfahren wird immer beliebter. Eine häufig verwendete Methode ist RNase Vorbehandlung vor der Extraktion der viralen genomischen RNA, aber dies nicht berücksichtigt werden, Viruspartikel, die intakt bleiben, aber nicht über die Fähigkeit, Host-Rezeptoren/co-Faktoren zu binden sowie Viruspartikel, die tödlich mutiert haben oder abgeschnitten oder Genome⁷geringfügig beschädigt haben. Kapsid Integrität kann auch ausgewertet werden, basierend auf die Fähigkeit des Virus binden an menschlichen Norovirus co-receptor/co-Faktoren, die Kohlenhydrate sind bekannt als Histo-Blut Gruppe Antigene (HBGAs). HBGAs sind in intestinalen Epithelzellen Host als Bestandteil von Glykoproteinen oder Glycolipide (unter mehreren anderen Geweben) und in Körperflüssigkeiten wie Speichel abgesondert werden kann. Magensaftresistente Bakterien mit HBGA-ähnlichen Substanzen auf ihrer Oberfläche haben auch gezeigt, dass menschliche Norovirus^8,9,10binden und solche Interaktionen können Norovirus Infektion⁵fördern. Das grundlegende Konzept der Verwendung HBGA Bindung ist, dass nur virale Partikel binden die vermeintliche Rezeptor/co-factor in der Lage wäre, Zellen zu infizieren. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass Wulst-basierte HBGA Bindung vor Nucleinsäureamplifikation eine viel versprechende Methode für Infektiosität Diskriminierung^{11,12,13,14ist, 15,16}. Eine große Herausforderung für HBGAs ist, dass kein einziges HBGA Typ alle menschlichen Norovirus Genotypen binden kann. Um dieses Problem anzugehen, hat Schwein Magen Mucin, die HBGAs enthält, anstelle von gereinigten HBGA Kohlenhydrate im Interesse der einfachen Synthese, Konsistenz und reduzierten Kosten eingesetzt.

Einer kürzlich erschienenen Publikation von Moore Et al. ¹⁷ führte eine Reihe von neuen Techniken für die Schätzung der menschlichen Norovirus Kapsid Integrität. Anstelle von HBGAs, Moore Et al. ¹⁷ Bindung eines weitgehend reaktiven Nukleinsäure-Aptamer (M6-2)¹⁸ und im großen und ganzen reaktive monoklonaler Antikörper (NS14)¹⁹ , wärmebehandelte GII.4 Sydney Norovirus Capsids (virusähnliche Partikel oder untersuchten) untersucht und verglichen um die Bindung an synthetischen HBGAs. Nukleinsäure-Aptamere sind kurz (~ 20-80 nt) einzelne gestrandeten Nukleinsäuren (SsDNA oder RNA), die Falten zu einzigartigen dreidimensionalen Strukturen als Folge ihrer Sequenz und ein Ziel zu binden. Weil sie Nukleinsäuren sind, sind sie weniger kostspielig; leicht chemisch synthetisiert, gereinigte und modifiziert; und stabil gegen Hitze. Mehrere Berichte von Aptameren generiert gegen Noroviren gibt, mit einigen von ihnen zeigen breite Reaktivität verschiedener Stämme^18,20,21,22. Zum Beispiel, Moore Et al. ¹⁷ unter Beweis gestellt, dass Aptamer M6-2 verpflichtet, gereinigt, zusammengebauten menschlichen Norovirus Capsids (untersuchten) und verhielt sich ähnlich, HBGA in die Abhängigkeit von der viralen Kapsid zu höherer Ordnung (z. B. sekundäre und tertiäre) Protein-Struktur für verbindliches auftreten. Auf der anderen Seite blieb ein erheblicher Anteil der Norovirus VLP Bindung an Antikörper NS14 nach Capsids völlig denaturiert wurden. Bewertung der Norovirus-Bindung in der Studie von Moore Et al. ¹⁷ erfolgte über eine einfache Platte-basierte Methode ähnlich wie ELISA, mit der Ausnahme, dass Aptamere anstelle von Antikörpern verwendet werden (daher ist die Methode ELASA hieß). Diese experimentellen Hochdurchsatz-Methode wurde zur Bewertung der Auswirkungen verschiedener Therapien auf das Norovirus Kapsid, Arbeit, die für das Verständnis des Mechanismus der viralen Inaktivierung bei Belastung durch physikalische oder chemische Stressoren wertvoll ist. Ein Nachteil dieser Methode ist jedoch die geringere Empfindlichkeit und Mangel an Toleranz für Matrix-assoziierte Kontaminanten auf höheren Ebenen, die unspezifische Bindung von Aptameren verursachen.

Moore Et al. ¹⁷ verwendet eine andere Methode, dynamische Lichtstreuung (DLS), Aggregation der Viruspartikel als Reaktion auf Wärmebehandlung zu überwachen. DLS ist häufig verwendet, um die Größe der Nanopartikel-Suspensionen zu bewerten und auf Proteine^23,24 und Viren^25,26,27erweitert. Die Intensität des Lichts verstreut durch Partikel in Lösung schwankt in Abhängigkeit von der Partikelgröße, so dass für die Berechnung des Diffusionskoeffizienten und dann Partikeldurchmesser mit bewährten Formeln. Die DLS-Technik kann den hydrodynamischen Durchmesser der dispergierten Partikel bis in den Nanobereich unterscheiden, die ermöglicht die Erkennung von verteilten Viren, individuelle Kapsid-Proteine oder Dimere und Virus-Aggregate, die anhand der Größe²⁷. Virus-Aggregation, vertreten durch eine Erhöhung der Partikelgröße, zeugt vom Verlust der Integrität Kapsid. Das Kapsid ist denaturiert und seine Struktur gestört, hydrophoben Überreste ausgesetzt werden und dazu führen, dass die Teilchen zusammenhalten und Aggregate zu bilden. DLS kann verwendet werden, zur Messung der Partikelgröße nach einer bestimmten Behandlung oder die Kinetik der Aggregation in Echtzeit^17,28. Diese Methode erfordert hohe Konzentrationen von gereinigten Kapsid, die möglicherweise nicht ganz repräsentativ für das Virus in seinem natürlichen Zustand aber hat den Vorteil, dass Beobachtung des Verhaltens Kapsid in Lösung.

Die letzte Methode von Moore Et Al. genutzt ¹⁷ Jahre alt war Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM). Obwohl diese Methode Empfindlichkeit fehlt und keine quantitative Daten erzeugt, ermöglicht es für die Visualisierung der Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen auf die virale Kapsid-Struktur. Obwohl nicht noch ideal für klinische/Umgebungseinstellungen, ist der Einsatz dieser Methoden in Kombination wertvolle menschliche Norovirus Inaktivierung zu verstehen. Der Zweck dieses Artikels ist es, detaillierte Protokolle für die Platte basierende Bindung-Assay (ELASA), DLS, bieten und TEM Vorbereitung Methoden untersuchen die Auswirkungen der Wärmebehandlungen auf das Norovirus Kapsid im Zusammenhang mit den Behandlungen Auswirkungen auf Kapsid Integrität im Moore Et Al. vorgestellt ¹⁷.