Méthodes alternatives In Vitro pour la détermination de l’intégrité structurale de la capside virale

Norovirus humain est responsable d’un fardeau considérable de santé publique dans le monde, provoquant des maladies environ 685 millions et 212 000 décès chaque année¹, à un coût en milliards de dollars^2,3. Aujourd’hui, dosage et détection des norovirus implique l’amplification du génome et/ou plates-formes ligand. Le premier est généralement privilégié car il est plus sensible, fournit des renseignements quantitatifs et a généralement moins de risques de faux positifs⁴. Technique la plus courante norovirus détection et la quantification du génome amplification est la réaction en chaîne polymérase quantitative de la transcriptase inverse (RT-qPCR). Parce qu’il vise et amplifie un petit segment du génome humain norovirus, RT-qPCR seul n’est pas capable de distinguer les infectieuses et particules non infectieuses, comme l’ARN génomique gratuit, endommageant capsides contenant les génomes et capsides avec mortellement génomes muté/tronqué peuvent encore être amplifiées par RT-qPCR. Alors que deux nouveaux in vitro des techniques culturales pour norovirus humain^5,,⁶ ont été signalés récemment, tous les deux encore s’appuient sur la RT-qPCR pour la quantification des virus et ne sont pas encore des méthodes de routine clinique/environnement tests pour les norovirus humains. Ainsi, la RT-qPCR demeure l’étalon-or pour les essais cliniques sur l’environnement.

Autres méthodes in vitro ont été développés afin de mieux estimer le statut infectieux des particules de norovirus. Ces méthodes peuvent être généralement classés comme ceux qui portent sur l’intégrité de la capside des norovirus et ceux évaluant l’intégrité du génome. La première approche est plus populaire. Une méthode couramment utilisée est le prétraitement RNase avant l’extraction de l’ARN génomique viral, mais cela ne tient pas compte des particules virales qui restent intactes, mais n’ont pas la capacité de lier les récepteurs/co-facteurs de l’hôte, ainsi que les particules virales qui ont muté mortellement ou ont tronqué ou légèrement endommagé génomes⁷. Intégrité de capside peut également être évaluée basés sur la capacité du virus à se lier aux norovirus humains co-récepteur/co-facteurs, qui est des glucides appelés antigènes de groupe de histo-sang (HBGAs). HBGAs sont présents dans les cellules épithéliales intestinales hôte dans le cadre des glycoprotéines ou glycolipides (parmi de nombreux autres tissus) et peuvent être sécrétées dans les fluides corporels comme la salive. Les bactéries entériques contenant des substances de type HBGA sur leurs surfaces ont également montrés pour lier les norovirus humains^8,9,10, et ces interactions peuvent promouvoir des norovirus infection⁵. Le concept de base de l’utilisation de la liaison de HBGA est que seules des particules virales capables de lier le putatif du récepteur/co-factor serait capables d’infecter les cellules. Plusieurs études suggèrent que la liaison de HBGA axée sur la perle qui précède l’amplification des acides nucléiques est une méthode prometteuse pour l’infectivité discrimination^{11,12,13,14, 15,16}. Un défi majeur au sujet de la HBGAs, c’est qu’aucun type HBGA unique ne peut lier tous les génotypes de norovirus humain. Pour y remédier, mucines gastrique, qui contient HBGAs, a été utilisé à la place des glucides HBGA purifiés dans l’intérêt de la facilité de synthèse, la cohérence et coût réduit.

Une publication récente de Moore et al. ¹⁷ a présenté un ensemble de nouvelles techniques d’estimation des norovirus humains intégrité de capside. À la place de HBGAs, Moore et al. ¹⁷ a étudié la liaison d’a globalement réactif acide nucléique aptamère (M6-2)¹⁸ et globalement réactif anticorps monoclonal (NS14)¹⁹ au traité thermiquement capsides de norovirus GII.4 Sydney (Pseudo-particules virales ou PPV) et comparait cette pour la liaison à HBGAs synthétiques. Aptamères nucléotidiques sont courtes (~ 20-80 nt) unique échoués des acides nucléiques (ADN simple brin ou ARN) qui incorporer des structures tridimensionnelles uniques en raison de leur séquence et lier une cible. Parce qu’ils sont des acides nucléiques, ils sont moins coûteux ; facilement chimiquement synthétisés, purifiée et modifiée ; et à la chaleur. Plusieurs rapports d’aptamères générés contre le norovirus existent, avec certains d’entre eux montrant large réactivité à une variété de souches^18,20,21,22. A titre d’exemple, Moore et al. ¹⁷ a démontré qu’aptamère M6-2 lié à norovirus humains purifiés, assemblé capsides (VLP) et se sont comportés de la même façon à HBGA dans le recours à la capside virale pour maintenir la structure de la protéine ordre (p. ex., secondaire et tertiaire) plus élevée pour liaison de se produire. En revanche, une proportion significative de liaison VLP norovirus à anticorps NS14 resta après que capsides ont été complètement dénaturés. Évaluation de la liaison de norovirus dans l’étude de Moore et al. ¹⁷ a été réalisée selon une méthode simple, axée sur la plaque similaire à ELISA, à l’exception que les aptamères sont utilisés à la place de l’anticorps (d’où la méthode a été appelée ELASA). Cette méthode expérimentale à haut débit a été utilisée pour évaluer les effets des différents traitements sur la capside des norovirus, travail qui est utile pour comprendre le mécanisme d’inactivation virale lors de l’exposition aux facteurs de stress physiques ou chimiques. Cependant, un inconvénient de cette méthode est la plus faible sensibilité et manque de tolérance pour les contaminants associés à matrice à des niveaux supérieurs qui causent les liaisons non spécifiques par aptamères.

Moore et al. ¹⁷ a utilisé une autre méthode, diffusion de lumière dynamique (DLS), pour surveiller l’agrégation des particules virales en réponse à un traitement thermique. DLS est couramment utilisée pour évaluer la taille des nanoparticules suspensions et a été étendue aux protéines^23,virus et^{24 25,26,27}. L’intensité de la lumière diffusée par les particules en solution fluctue en fonction de la taille des particules, permettant le calcul du coefficient de diffusion, puis diamètre des particules à l’aide de formules bien établies. La technique DLS peut distinguer le diamètre hydrodynamique des particules dispersées à l’échelle nanométrique, qui permet de détecter des virus dispersées, protéines de la capside individuels ou dimères et agrégats de virus basés sur la taille²⁷. Agrégation de virus, représentée par une augmentation de la taille des particules, est révélateur de la perte d’intégrité de la capside. La capside est dénaturée et perturbée de sa structure, résidus hydrophobes deviennent exposées et entraîner les particules à se serrer les coudes et forment des agrégats. Listes de distribution peut être utilisé pour mesurer la taille des particules après un traitement précis ou la cinétique d’agrégation en temps réel^17,28. Cette méthode a l’avantage de permettre l’observation du comportement de la capside en solution mais requiert des concentrations élevées de capside purifiée, qui n’est peut-être pas tout à fait représentatives du virus dans son état naturel.

La dernière méthode utilisée par Moore et al. ¹⁷ a : microscopie électronique à transmission (TEM). Bien que cette méthode manque de sensibilité et ne produit pas de données quantitatives, il permet la visualisation des effets des différents traitements sur la structure de la capside virale. Bien que pas encore idéal pour les paramètres cliniques et environnementales, l’utilisation de ces méthodes en combinaison est utile dans la compréhension de l’inactivation des norovirus humain. Le but de cet article est de fournir des protocoles approfondies pour l’analyse de la liaison basée sur un plaque (ELASA), DLS, et les méthodes de préparation de TEM utilisées pour étudier les effets des traitements thermiques sur la capside des norovirus dans le contexte des effets des traitements sur la capside intégrité, tel que présenté dans Moore et al. ¹⁷.