정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드

해리 신경 설치류 두뇌의 지역에서의 기본 문화 연구자에 의해 병 적 응답을 관찰 하는 데 사용 하는 중요 한 도구 연루 자극 이다. 그러나, 이러한 연구 결과 뉴런만 2d에서 고 glial 지원 시스템 없이 보는 단점이 있다. 또한, 그것에 매우 높은 밀도 (640 뉴런/m m² 또는 표면적의 약 16%)의 조건 하에서 성장 하지 않는 한 불가능 하다 hippocampal 세포 몸, 짧은 거리 보다 더 모 수석 또는 축 삭의 무작위 결과 따라 신경 생존 4 주 이상¹을 제한 연령 관련 pathologies의 확장된 연구에 대 한 천연된 문화를 사용 하 여 크게 떨어진다. 쥐 두뇌에서 준비 하는 조각의 경작 주 또는 몇 개월에 대 한 조직된 세포 건축과 생존 능력을 유지 하 여 이러한 한계를 극복 하는 매력적인 옵션 이다. 조각 문화에 설치류 두뇌의 많은 다른 영역을 유지 하기 위한 조건 설명된²되었습니다.

두 가지 주요 방법을 뇌 조각의 장기적인 문화 위해 널리 이용 된다: 공기-액체 인터페이스³ 막에 경작 또는 밀봉 된 튜브에 coverslips에 경작 폭⁴를 제공 하는 롤러 인큐베이터에서 회전 수. 세포 막에 경작 하는 조각 직 립 현미경과 물 집중 목표⁵를 사용 하 여 고해상도 형광 현미경으로 직접 몇 군데 될 수 있습니다. 또는, 조각 세포 막에 교양 있다 유리 하단 요리는 거꾸로 한 현미경⁶을 사용 하 여 모 수석 등뼈의 좋은 해상도 달성 하기 위해 양도 되었습니다. 그러나, 두 방법 모두 세포 막에 성장 조각 이미징의 중간 변화를 필요로 하 고 자주를 방지 하거나 줄이기 위해 오염^5,6antifungal 항생제 사용할 오픈 시스템 있습니다. 공기-매체 인터페이스에서 막에 조각 우수한 형태 및 생존, 유지 하지만 실험만 작은 셀 그룹에 다음과 같은 하지 않으면 높은 확대에 반복적인 이미징 동안 정확한 위치에 반환 하는 것은 매우 어려운 형광 성 감 적 표현. 세포 막에 성장 조각 transgenes^5,6의 바이러스 중재 식이 사용 되었습니다, 비록 biosafety 프로토콜 동봉된 문화 시스템에 사용 되는 특정 바이러스 성 벡터에 대 한 고용 수 필요할 수 있습니다. 단백질 및 세포 생리학의 기자 태그 붙일 표현. 또한, 침수 목표 문화⁵에 따라 샘플 사이 오염 제거를 해야 합니다. 막 인터페이스 문화의 주요 응용 프로그램 시간 포인트⁷에서 생리학과 고해상도 이미징을 결합 이다.

플라스틱 튜브 안에 coverslips와 롤러 튜브 메서드는 coverslip 제거 하지 않고 어떤 전기 생리학 또는 고해상도 이미징 허용 하지 않습니다. 따라서,이 메서드는 장기 연구는 후 고정 관찰 한⁸에 가장 자주 적용 되었다. 여기에 설명 된 롤러 튜브 문화 기술을 활용 하지만 만큼 문화에 대 한 반복적으로 몇 군데 수 coverslips에 조각으로 교 련된 아웃 튜브에 유지 되는 방법이입니다. 동봉 된 시스템 이미징에 대 한 중간 변화를 요구 하 고 높은 확대, 일 또는 주 후에 정확한 필드 이전 몇 군데 이미징 수 있도록 하는 표준 마크를 제공 하는 photoetched coverslips를 활용 하 여.

우리 쥐 해 마 메모리 및 학습에 관련 된 주요 뇌 영역에에서 변화를 검사 하려면이 메서드를 적용 합니다. 쥐 해 마 종종 병 적인 또는 연령과 관련 된 변화 인지 장애⁹, 광고에서 발생 하는 개발 하는 동안 관찰 모델으로 공부 된다. 우리의 방법은 AD⁸의 특징은 Aβ 펩 티 드, 증가 등 환경 변화에 대 한 응답에서 시간이 지남에 단일 슬라이스 내에서 개발 하는 병리학 변화를 공부 하는 특히 적합 합니다. 한 병리학 인간과 설치류 광고 뇌와 관련 된 cofilin 걸의 존재 이며 봉, 필 라 멘 트 cofilin와 말라의 후자 포함 번들은 1:1 어 금 니 비율^{10,11, 12}. 봉 고정 조각 cofilin GFP hypoxia⁸, 대상이 표현 라이브 설치류 뇌 조각 내에서 뿐만 아니라 쥐 해 마 Aβ 치료 따르는의 관찰 되었습니다 그리고 그들은 광고에서 본 시 냅 스 기능 장애에 기여할 수 그리고 선입니다. 여기 우리는 시간 코스와 다른 바이러스에 의해 도입 된 표현된 exogenous 공상 형광 단백질의 조각 내에서 분산을 관찰 하는 것이 새로운 자란 메서드를 사용 합니다. 우리는 다음 cofilin 막대 및 수용 성 Aβ 올리고 (Aβ_o)와 치료에 대 한 응답에서 hippocampal 조각에 집계 병리학의 발전에 따라 cofilin 기자 구문의 신경 특정 식을 이용 한다.