Strukturelle Charakterisierung von Mannan Zellwand Polysaccharide in Anlagen, in denen Tempo

1. Ernte von Pflanzenmaterial Ernte frisches Pflanzenmaterial (~ 20 mg) und sofort in Ethanol 96 % (V/V) Tauchen und bei 70 ° C für 30 min inkubieren; dadurch wird jede Zellwand entwürdigende Enzyme deaktiviert. Für trockenes Material, beginnen Sie mit Schritt 2. Achtung: Ethanol ist brennbar. Hinweis: Ein einzelnes Blatt Stängel oder Rosette bieten genügend Material für die Analyse. Jedoch weniger Fehler auftreten, wenn eine größere Menge an Gewebe zusammengefasst und analysiert, da dies einfacher zu wiegen und zu handhaben ist. Sorgfältig notieren Gewebetyp und Entwicklungsstadium als Polysaccharid Struktur variiert mit den beiden. Zum Beispiel mit Arabidopsis Thaliana (hier verwendet), inszenieren Sie das Gewebe nach den Methoden von Boyes Et al. 15 Hinweis: In diesem Protokoll haben wir die untere Hälfte des Blütenstandes Stammes, wo ist der erste Schote voll länglich aber nicht vergilben verwendet. 2. Vorbereitung der Alkohol unlöslichen Rückstände (Luft) Prepare Luft, nach der Methode von Mortimer Et Al. 9 oder eine andere ähnliche Methode, um ein Pulver fehlen lösliche Zucker wie Saccharose und Stärke zu produzieren. 3. Aliquotierung und Vorbehandlung von AIR Hinweis: die genaue Menge der Luft benötigt für jede Probe (a) die Fülle des Polysaccharids von Interesse an dem Material und (b) die durchschnittliche Größe der Oligosaccharide hängt von veröffentlicht Das GH. Die Methode fügt ein fluoreszierendes Molekül der reduzierenden Ende jedes Oligosaccharid, d. h. die Anzahl der Oligosaccharide die Empfindlichkeit des Experiments bestimmt. Als Richtwert für Glucomannan in Arabidopsis Stamm verdaut mit GH5/GH26 (wie beschrieben), 500 µg empfiehlt 11, während für Xylan in Arabidopsis Stiel mit GH11 verdaut, 100 µg wie Mortimer empfohlen wird ' s Studie 3. Luft (10-15 mg) in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen wiegen und eine Endkonzentration von 2 mg/mL H 2 O hinzufügen. Wirbel um eine sogar Aussetzung zu erreichen. Wenn dies problematisch ist, verwenden Sie eine Glas-Homogenisator, um diesen Prozess zu unterstützen. Aliquoten 500 µg in Microfuge Röhren. Trocknen mit einer Vakuum-Zentrifuge Aliquote (siehe die Tabelle der Materialien) über Nacht bei 30 ° c Vorbehandlung Luft mit 1 M NaOH (20 µL) für 1 h bei Raumtemperatur; das de-acetylates die Polysaccharide und quillt Cellulose-Mikrofibrillen, stören die Biomasse-Struktur und GH Zugriff. Hinweis: Dieser Schritt kann übersprungen werden, für gereinigte Polysaccharide. Vorsicht – starke Säure/Base. Gehören ein Aliquot für eine keine-Enzym AIR Control (gleich behandelt wie alle Proben, mit Ausnahme von Schritt 4.1. ist ausgeschlossen). Fügen Sie 200 µL H 2 O und 20 µL 1 M HCl neutralisieren. Testen Sie, ob der pH-Wert ~ 6-7 ist durch 1 µL entfernen und auf Papier pH-Indikator-Streifen Schmierblutungen. Fügen Sie 50 µL 1 M Ammonium-Acetat-Puffer, pH 6.0 (oder welcher pH-Wert für die GHs in der Studie verwendeten geeignet ist) und H 2 O zu einem Gesamtvolumen von 500 µL. Hinweis: Ammoniumacetat wird verwendet, da es beim Trocknen sublimiert und so zum Beispiel nicht zusätzliche Salz hinzugefügt wird. Ein Überschuss an Salz kann zu führen schlechte Band-Form und Auflösung auf dem Tempo-Gel. 4. Hydrolyse von Luft mit Glycosyl Hydrolases (GHs) Hinweis: wie in der Diskussion erwähnt, die Reinheit der GHs ist von entscheidender Bedeutung. Verwenden Sie nur heterologously ausgedrückt, gereinigt Affinität Enzyme. Nach Erhalt der jede Charge des Herstellers, Hydrolyseneigung definierten Aliquote des Substrates (z. B. 500 µg Luft) mit zunehmenden Mengen von GH über Nacht (z. B. 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µL) (3 Einheiten/µL). Wird ein Überschuss von GH, wird der Tempo Fingerabdruck identisch aussehen. Ein Übermaß an Enzym ist erforderlich, um ein reproduzierbares Ergebnis zu liefern, weil es sicher sein muss, dass die Hydrolysereaktion den Endpunkt nähert. Hinzufügen einer vorher festgelegten Betrag (siehe oben) des Mannanases (GH5 und GH26 11) an der Luft Aliquote im Puffer ab Schritt 3.5 sowie eine Positive Kontrolle (30 µg von Konjac Glucomannan) und keine-AIR Negativkontrolle (Enzym-Mix in ein Leerrohr). Wirbel und dann Spin kurz auf das Reaktionsgemisch in den Boden des Röhrchens sammeln. Inkubation über Nacht bei 37 ° C (oder die geeignete Temperatur für die GH Wahl) mit sanften Agitation (~ 100 u/min). Stoppen die Reaktion durch Inkubation bei 95 ° C für 20 min. Hinweis: Cap-Verschlüsse können verwendet werden, um Flip-Top Microfuge Röhren zu versiegeln. Mit einer Sitzbank Top Microfuge mit maximaler Geschwindigkeit für 10 min Zentrifugieren und bewahren Überstandes. Aufschwemmen Pellet in 250 µL H 2 O, Zentrifuge wie oben beschrieben, und behalten überstand. Kombinieren beide Überstände und trocknen in einem Vakuum-Zentrifuge (siehe die Tabelle der Materialien) bei 30 ° C (~ 3 h oder über Nacht ohne Heizung). 5. Vorbereitung der Oligosaccharid-Standards vorbereiten 1 mM Lager Lösungen in H 2 O der Mannose (Mann), Mannobiose (Man 2), Mannotriose (Man 3), Mannotetraose (Mann 4), Mannopentaose (Mensch 5) und Mannohexaose (Mann 6), alle β 1-4 verknüpft. Aliquoten und Store bei-20 ° C bis erforderlich. Bereiten Sie 3 unterschiedliche Konzentrationen eines Mannes 1-6 Mischung durch die Kombination von 1 µL (Standard S1), 2 µL (S2) oder 5 µL (S3) aller sechs. Trocken in einer Vakuum-Zentrifuge (siehe Tabelle der Materialien) bei 30 ° C (~ 1 h). 6. Derivitization der Oligosaccharide vorbereiten eine Stammlösung von 0,2 M Ameisen (8-Aminonaphthalene-1,3,6-Trisulfonic Säure) in H 2 O: Essigsäure 17:3. Warmen Lager auf 60 ° C das Solid vollständig auflösen. Shop bei-20 ° C, lichtgeschützt, für ca. 2-3 Monate. Vorbereitung eine 0,2 M-Stammlösung von 2-Picoline Boran (2-PB) in DMSO. Dies ist extrem hygroskopisch, also sofort alle Pulver nach Erhalt in DMSO aufzuwirbeln. Aliquoten und Store bei-20 ° C für 1-2 Jahre. Auftauen Aliquote als erforderlich (Speicher bei 4 ° C für 2 Wochen und dann verwerfen). Vorbereitung den Derivatisierung Puffer von H 2 O: acetic Acid: DMSO um 17:03:20. , Jede Probe, 5 µL der Ameisen, 5 µL 2-PB und 10 µL Derivatisierung Puffer hinzufügen. Spin kurz, sammelt auf dem Boden des Rohres, Vortex gründlich, und dann wieder kurz schleudern. Abbildung 1 Reaktion Beschreibung finden Sie unter. Proben Inkubation über Nacht bei 37 ° C, vor Licht geschützt werden. Trocken in einer Vakuum-Zentrifuge (siehe Tabelle der Materialien) bei 30 ° C (~ 2 h). Aufschwemmen Proben und Standard in 100 µL 3 M Harnstoff. Shop bei-20 ° C, lichtgeschützt bis erforderlich. 7. Vorbereitung der PACE Gele Hinweis: Montage von Gel-Gießanlage abhängig von der Marke. Hier, wir uSe eine vertikale Elektrophorese-System (siehe Tabelle der Materialien), ausgestattet mit 18 x 24 cm Glasplatten und 1,5 mm Spacer. Gel Gießanlage pro Hersteller montieren ' Anweisungen s. Machen 10 X Tempo Puffer (1 M Tris-Borat, pH 8,2) wie folgt: ~ 400 mL H 2 O und Mischung auflösen 121,14 g Tris-Base hinzufügen. Passen Sie den pH-Wert auf 8.2 durch Zugabe von soliden Borsäure (ca. 60 g), und dann Volumen bis zu 1 L. Machen eine 10 % (w/V) Ammonium Bleichen (APS) Lager H 2 O. Aliquot bei-20 ° c Auftauen Aliquote einmal speichern, bei 4 ° C lagern und nach 2 Wochen wegwerfen. Machen und gießen Sie die Lösung von Gel. Für die oben genannten Geräte entsprechen 1 Gel 50 mL. Mischen Sie in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen H 2 O (20,2 mL), 5 mL 10 X Tempo Puffer, 24,6 mL 40 % Acrylamid/Bis-Acrylamid (29,1 Acrylamide:Bis). (Vorsicht: giftig). 200 µL APS und 20 µL von N, N, N, n-Tetramethyl-Ethylenediamine (TEMED) hinzufügen. Invert sanft zu mischen (zur Vermeidung von Luftblasen Einführung). Gießen Sie das Gel mit einem serologischen oder andere großvolumigen Pipette, ~ 4 cm unterhalb der Oberkante der Glasplatten. Achten Sie auf die Möglichkeit der Anreise in das Gel eingeschlossenen Luftbläschen. Wenn sie tun, nicht mehr gießen und Tilt/Tap das Gel um sie freizugeben. Gel mit Isopropanol (Vorsicht : entzündlich) oder sorgfältig, mit H 2 O. Allow Gel zu polymerisieren (20-30 min.), dann gießen Sie die oberste Schicht zu überlagern. Wenn Isopropanol verwendet wurde, dann waschen Sie 2 X mit H 2 O. Dry überschüssige Flüssigkeit mit Löschpapier. Machen und gießen Sie das stapelnde Gel. Mischen Sie 6,8 mL H 2 O, 1 mL 10 X Tempo Puffer, 2,8 mL Acrylamid/Bis-Acrylamid (Vorsicht: giftig), 80 µL APS und 8 µL TEMED in ein Zentrifugenröhrchen 15 mL. Kehren Sie um zu mischen und auf polymerisierten Lösung von Gel zu überlagern. Sanft fügen Sie Kämme, Trapping Luftblasen unter den Kamm Zähnen zu vermeiden. Zulassen Gel (20-30 min), polymerisieren in feuchten Gewebe und dann in Plastikfolie wickeln und Lagerung bei 4 ° C bis erforderlich. Geschäft mit den Waben vorhanden. Hinweis: Schritt Gele können gespeichert werden für maximal 2 Wochen (obwohl weniger als 1 Woche ideal ist), wenn sie feucht gehalten werden. 8. Mit einem Tempo Gel einen permanenten-Marker zu verwenden, um die gut Positionen auf dem Glas, beschriften, die dabei die Ladereihenfolge Überblick zu behalten helfen werden, und bei der Ermittlung von wo die Brunnen sind einmal der Kamm entfernt wird. Entfernen Sie den Kamm. Brunnen mit 1 X Tempo Puffer füllen. Verwenden eine 10 µL Microsyringe 2 µL Standards und Proben in den Brunnen zu laden. Vermeiden Sie die Verwendung der äußersten Bahnen, die neigen zu Proben laufen schlecht. Montage die obere Kammer des Apparates Gel-Ausführung und legen Sie das Gel in einem gekühlten (~ 10 ° C) laufenden Tank (10 ° C), 1 X Tempo Puffer enthält. Die obere Kammer mit 1 X Tempo Puffer füllen. Schalten Sie die macht, und führen Sie das Gel bei 200 V (konstante V) für 30 Minuten und dann Erhöhung der Spannung bis 1000 V für 1 h 40 Minuten. Schützen Gele aus Licht (z. B. durch das Einwickeln von Panzern in schwarzen Mülltüten). Hinweis: Aktivieren Sie die Gele ~ 5 min nach dem Einschalten der Spannung, und dann noch 5 Minuten nach Erhöhung der Spannung bis 1000 V. Wenn das Power Pack nicht in der Lage ist, die Spannung aufrecht zu erhalten, dann gibt es wahrscheinlich ein Puffer-Leck. Nehmen Sie das Gel aus dem Becken. Montieren Sie die obere Kammer, sorgfältiger Kontrolle Platzierung aller Dichtungen. Ein großer Chip am oberen Rand der Glasplatte kann die Platte bilden eine gute Abdichtung mit der Dichtung verhindern. Dies kann in der Regel vorübergehend behoben werden, indem ein Rückgang von 5 % (w/V) flüssige Agarose zu den abgebrochenen Teil des Glases, vor dem Hinzufügen der oberen Kammer. 9. Visualisierung einer Tempo-Gels Hinweis: verwenden Sie eine Gel imaging-System ausgestattet mit langwelligem UV-Strahler in den Transilluminator und eine Emission Filter für die Kamera, die für das Fluorophor, hier 530 nm geeignet ist. Alternativ ein Laserscanner kann auch verwendet werden, wie unter Goubet 2. Sicherzustellen, dass das Gel imaging-System staubfrei durch Abwischen mit einem feuchten fusselfreien Tuch. Das Gel aus dem Tempo-Becken nehmen und kurz angezeigt werden, solange das Gel nach wie vor in die Glasplatten ist (< 80 ms) um festzustellen, ob die Farbstoff-Front noch auf das Gel ist. Das Gel mit einem Keil-Tool zu öffnen, und zwar Gel noch auf einer Glasplatte, ein Pizzaschneider verwenden, um sowohl das Stapeln Gel entfernen und, wenn die Farbstoff-Front noch auf das Gel, der Unterseite des Gels ist. ~ 5 mL H 2 O auf der Oberfläche der Transilluminator und übertragen Sie dann das Gel direkt auf die Transilluminator. Setzen Sie den Filter UV-605, und schalten Sie die langwelligen UV-Transilluminator (siehe Tabelle der Materialien) mit Hilfe der Software. Hinweis: Die Ameisen Fluorophor verwendet hier hat eine Anregung/Emission von 353/520 nm. Nehmen Sie mehrere Bilder bei verschiedenen Belichtungszeiten (z. B. 100 ms bis 10 s). Stellen Sie sicher, dass das UV-Licht zwischen Bilder durch Klicken auf das UV-Licht-Taste (um das Gerät auszuschalten) um zu vermeiden, die Fluoreszenz erniedrigende ausgeschaltet ist. Sicherzustellen, dass mindestens 2 der Bilder keine gesättigten Bands haben (das Gel imaging-Software zeigt dies). Gespeicherte Dateien als Bilder hoch-resolution.tif. Hinweis: Bilder können mit der Software zur Verfügung gestellt mit dem Gel imaging-System oder durch die Verwendung von frei verfügbaren Bildanalyse-Software, wie z. B. ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) analysiert werden. Siehe Abschnitt Ergebnisse für eine Diskussion der Quantifizierung.