Eine Alternative Kultur-Methode, um genomische Hypomethylierung von embryonalen Stammzellen der Maus mit MEK-Inhibitor PD0325901 und Vitamin C aufrechtzuerhalten

ES-Zellen stammen vom ICM einer Blastozyste¹. Die Zellen sind in einem Zustand der Pluripotenz und alle somatischen Abstammungen und Germline Zellen²bilden können. Einrichtung von ES-Zellen bietet die Möglichkeit zur Entwicklung zu untersuchen in-vitro- Verfahren und medizinische Relevanz für die regenerative Medizin, basierend auf ihre Pluripotenz³Zellen zu generieren.

Zwei Gruppen seminally der Maus-ES-Zell-Linien im Jahr 1981 gegründet und wenn Zellen aus der frühen Maus-Embryo im fetalen bovine Serum (FBS) kultiviert wurden-mit Medium mit Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) als Feeder Layer^1,4 . MEFs mitotically inaktiviert wurden und wurden bereits in Gerichte vor der Kultivierung Embryonaler Stammzellen angebaut. MEFs bieten Unterstützung für Maus-ES Zellhaftung und produzieren Wachstumsfaktoren zur Förderung der Verbreitung und der Differenzierung⁵, zu unterdrücken, während FBS wesentliche trophische Faktoren und Hormone für die Zellproliferation bietet. Nachfolgende Studien gezeigt, dass LIF von Feeder-Zellen produziert die wichtigen Zytokin für Selbsterneuerung und Aufrechterhaltung der Pluripotenz in ES-Zellen wurde, und die Zugabe von LIF in das Medium Feeder Zellen⁶ersetzen könnte. Derzeit ist die Erhaltung der Maus-ES-Zellen in FBS/LIF Medium Feeder noch die standard-Methode von vielen Forschern angenommen. Ergeben sich jedoch einige Probleme mit diesem Ansatz der klassischen Kultur. Erstens, Feeder-Zellen sezernieren übermäßige und unkontrollierte Faktoren und pathogenen Verunreinigungen⁷verursachen. Zur Vermeidung von dieser Interferenzen, Beschichtung der Oberfläche der Gerichte mit Gelatine und die Zugabe von LIF in Serum-haltigen Medium sind alternative Methoden für die Aufrechterhaltung der Maus-ES-Zellen ohne Feeder-Schicht Zellen. Zusätzlich, zeigen ES-Zellen unter Serum/LIF Bedingungen gewachsen morphologische Heterogenität in Zell-Populationen und sogar in die Expression von Pluripotenz-bezogene Faktoren⁸. Neuere Studien legen nahe, dass Serum/LIF Bedingungen der Pluripotenz-bezogene Kern Transkriptionsfaktoren (einschließlich OCT4, SOX2 und Nanog) der Pluripotenz durch LIF und WNT signalisieren aufrecht erhalten können; Bemerkenswert ist, aktivieren sie jedoch auch ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) Signal an Differenzierung⁸auslösen. Aufgrund der ambivalente duale Wirkung von den Kern-Transkriptionsfaktoren präsentieren ES-Zellen kultiviert im Serum Heterogenität, bestehend aus zwei austauschbare Populationen, eine ähnlich ICM und anderen ähnlich grundiert Epiblast Stand⁸. Darüber hinaus weisen Maus-ES-Zellen im Serum häufig global Hypermethylation⁹, während ICM und PGCs in einem globalen hypomethyliert Zustand sind, die eng mit ihrer Pluripotenz^9,10.

Es gibt eine hohe Nachfrage, neue Methoden zur Kultivierung von Maus-ES-Zellen entwickeln. Einige verbesserte Protokolle wurden seit 2003¹¹ aber weiterhin einige Einschränkungen und Mängel⁷. Seit 2008, die kombinierte Nutzung von zwei kleinen Molekül-Kinase-Inhibitoren, PD0325901 (der Inhibitor der Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) / extrazelluläre Signal-regulierte Kinase (ERK) (MEK)) und CHIR99021 (der Inhibitor der Glykogen-Synthase Kinase 3 (GSK3)), in N₂B₂₇ Medium mit LIF und ohne Serum hat eröffnet neue Perspektiven für Maus-Kultivierung ES¹²Zellen. Dieses neue definierte Medium zeichnet sich durch die Verwendung von zwei Inhibitoren (2i). Maus Embryonische Stammzellen in 2i/LIF Medium kultiviert sind homogener in Zell-Populationen und der Ausdruck der Pluripotenz Faktoren. Darüber hinaus weisen 2i/LIF-kultivierte Maus-ES-Zellen DNA-Hypomethylierung weltweit, welche kommt ICM-wie Zellen^9,13. 2i Kultur hat auch so seine Nachteile. PD0325901 und CHIR99021 sind unlöslich in Wasser und in der Regel aufgelöst in Dimethyl Sulfoxid (DMSO)-basierte Stammlösung in Kulturmedium hinzuzufügen. Studien haben gezeigt, dass langfristige und niedrig dosierte Belastung von Zellen mit DMSO zu Zytotoxizität¹⁴führen kann.

Hier haben wir zwei kleine Molekül-Verbindungen genutzt und eine neue Kultur-Methode von Maus-ES-Zellen entwickelt. Die neue Kultur-Methode kombiniert Vc und MEK-Inhibitor PD0325901 zur Förderung der DNA-Hypomethylierung schnell und effektiv auf ein vergleichbares Niveau der PGC, benannt als Vc/PD0325901 Kultivierung Protokoll. Maus Embryonische Stammzellen in Vc/PD0325901-added Serum-haltigen Medium Homogenität in der Morphologie aufweisen und sind in einem Grundzustand nachhaltig. Im Vergleich zu 2i Kultur, Maus Embryonische Stammzellen unter Vc/PD0325901 Bedingungen kultiviert weisen schnellere Kinetik der DNA Demethylierung und erreichen die Hypomethylierung Ebene von PGC vergleichbar. Darüber hinaus verringert sich die Verwendung einer einzigen Hemmstoff (PD0325901) der eingangsbetrag von DMSO in Medium im Vergleich zu dem in 2i verwendet (PD0325901/CHIR99021) und reduziert den Schaden auf Zellen.