Всеобъемлющий протокол выборки и процесс костного мозга для измерения поддающихся оценке остаточной болезни и лейкозных клеток острой миелоидной лейкемией

Протокол следует руководящими принципами Кодекса исследований и Комитет по этике исследований медицинского центра университета VU. 1. костного аспирации и образца подготовка Подготовка пациента и материала Заполните одно или два 10 мл-шприцы с 1% лидокаина, с помощью иглы 16-го калибра. Замените иглу для 21-иглы. Положите две капли 5% ЭДТА на часы стекло. Настройка стеклянных скольжениях (n = 15 с последовательной нумерации пациента и дата) в подготовке мазком. Место пациента в положении боковой пролежни. Найдите улучшенный задний подвздошный позвоночника и Марк с ручкой.Примечание: В общем, задняя превосходной подвздошной кости позвоночника является расположен одной стороны ширина дистальнее подвздошный гребень и одной стороны ширина сбоку от средней линии. В женщин фактическое позвоночника может быть немного более боковые, у некоторых мужчин немного более медиальной. Дезинфекция кожи с хлоргексидином 0,5-1% этанола из области предполагаемого биопсии наружу в кругах. Открыть пакет стерильных перчаток, надел стерильные перчатки и сложить пакет в таблице для создания поля, стерильный. Открыть пакет с аспирационная игла и поместите его на поле стерильным. Проникнуть в кожу и подкожную ткань и, наконец, надкостницы. В надкостнице администрировать лидокаина таким образом, что области 1 см в диаметре был наркозом.Примечание: Надлежащего отправления лидокаина в надкостнице является одним из наиболее важных факторов для комфорта пациента. Тест ли надкостницы был адекватно под наркозом, нажав месте предполагаемого биопсии с введенной иглы и спросить, если пациент чувствует боль. Примечания: дети полностью под наркозом во время всей процедуры. Держите аспирационная игла (15 га x 2.8″) с проксимального конца в ладони и указательный палец против стороны игла металлическая ось недалеко от оконечности; Эта позиция позволяет лучше контролировать. Ввести иглу с вращающимся движением (быстро чередующихся pronating/supinating движения) через кожу к подвздошной кости позвоночника и принесите иглы контакт с задней подвздошной кости позвоночника. Это убедиться, что игла вводится в область наркотизированных надкостницы; пациент должен чувствовать только давление и никакой боли. Если пациент чувствует боль, переместить иглу, либо управлять более лидокаина. Использование давления нежно, но твердо, заранее иглу при вращении в чередуя движения по часовой стрелке счетчик по часовой стрелке. Вход в полость костного мозга обычно обнаруживается снижение сопротивления. Удаление стилет из иглы. Прикрепите пустой шприц 10 мл с иглой. Приложите отрицательное давление, сняв поршень шприца с нежным тянуть. Предупредите пациента, что они могут чувствовать боль и судороги ощущения, когда время наддува костного мозга. Если не хватает костного спикулы выпускаются, другой стремление должны быть выполнены с одной быстрой ничьей. Большинство Спикулы будет в первые 1-2 мл, полученные из первоначального тянуть. Аспирационная только 1-2 мл чтобы избежать разбавления образца.Примечание: Разбавление приведет к гемодилюции и может посрамить MRD результаты). Выньте шприц и замените стилет в стремление иглу. Извлечь часть мозга в часы стекло, а остальные в 8 мл, покрытые гепарина.Примечание: Инвертируйте каждая трубка сразу же после размещения аспирата костного мозга в пробирку образца для обеспечения адекватного антикоагуляционную. Коагуляции костного часто является причиной ненадлежащего материала. Дополнительные костного мозга могут быть атмосферный из того же места, но предпочтительно, игла продвигается 5-10 мм до получения новой аспирата. Желательно не более чем 2 ничьих за уровень вставки должны быть приняты. Убедитесь в том отметить трубы с увеличением числа, представляющий первый, второй и/или последовательных рисует. Это общее правило использовать первый розыгрыш для наиболее актуальных диагностического анализа. Кроме того отказаться от места вставки иглы и вновь ввести его в полость костного мозга в несколько миллиметров от первоначального места вставки и повторите процедуру.Примечание: Не аспирационная более чем 1-2 мл на тянуть, чтобы избежать загрязнения значительных крови. Повторяйте так часто, как материал необходим. Когда придыханием достаточного материала для конкретного клинического исследования протокол удалите иглу костного мозга.Примечание: В случае медленного или иначе трудно костного чаяния использование шприцев, которые были предварительно промыть с антикоагулянтами может быть полезным. В случае сухой краном выполните трепаном биопсии, который выходит за рамки этой рукописи. Подготовка мазков для морфологической экспертизы Для оптимального морфологической оценки забрать спикулы (например, используя пластиковый шпатель) от аспирата в часы стекло и разместить их на стеклянное скольжение. Осторожно поместите другой стеклянное скольжение на слайд с костного мозга и аккуратно сдвиньте; Избегайте любого давления.Примечание: Только в случае очень больших костного спикулы незначительные может быть давление, для уменьшения толщины распространения клеток. Преимущества процедуры помощь от помощника, который может обрабатывать трубы образца. Точной маркировки труб с пациентом номер и количество последовательных костного розыгрыша имеет решающее значение. Тщательно высушите слайд, а затем выполните может Гимза Grünwald окрашивание (см. таблицу материалов). Изучения под микроскопом света для морфологии (см. Рисунок 1).Примечание: На рисунке 1A показывает мазков здорового костного мозга, состоящий из различных функциональных типов клеток во время Рисунок 1B AML пациента с преимущественно лейкозных взрывов. Чтобы лучше определить остаточную лейкозных бремя, иммунофенотипирование необходимо выполнить. 2. транспорт материала для дальнейшей обработки Подготовка образцов для транспорта Для того, чтобы убедиться, что материал не будет течь и трубы не сломает, обеспечению правильной упаковки (см. Рисунок 2).Примечание: От нашего и другие опыты жизнеспособность клеток лучше всего сохранилась при костном хранится при комнатной температуре. Для долгосрочной транспорта это лучше всего достигается с помощью комнатной температуре «гель Пак» для помощи в стабильность температуры во время транзита. Ярлык пакеты и добавить правильные формы, чтобы избежать потери пакета, длительное транспорта или переключении пациентов.Примечание: Это по крайней мере должна содержать: данные пациента (форма 1). Это должно включать исследование номер и обычно «Дата рождения». Для правой обработки материала после прибытия в принимающем лаборатории, важно четкое заявление о конкретно запрошенные лабораторный анализ (молекулярной диагностики, иммунофенотипирование, моб и т.д.) в этой форме. (Форма 2) Адрес и номер телефона контактного лица, и, при необходимости, документы для таможни. Чтобы избежать потери пакетов в почте, отправка Лаборатория всегда уведомляет принимающей лаборатории, что образец был отправлен. Рекомендуется использовать «отслеживание и контроль». Получение образцов из других институтов Убедитесь, что подходящие логистики на месте в институте для получения образцов в лаборатории, как только он доставляется в институте.Примечание: Для оптимальной организации материально-технического обеспечения желательно Центральной лаборатории требуется, который получает и собирает все материалы от местной клинике и от внешних больниц. В частности назначение протоколы для распределения и четкие связи с исполнительной лаборатории имеет важное значение. После получения образцов, точно Обратите внимание соответствующей нумерации в печатной формах и защищенной базы данных, содержащей важные поля например MRD идентификационный номер, суд конкретный идентификатор, больница регистрационный номер, отправка институт, Дата рождения, материал тип (периферической крови или костного мозга), белых кровяных телец (Лейкоцитов), Дата костного аспирации, дата измерения образца и любые соответствующие замечания за качество измерения.Примечание: Желательно, эта база данных также оснащен содержат дополнительные данные (или быть связана с другими базами данных) результаты анализа, и далее пациента данных таких последующих данных. 3. потока цитометр установки Примечание: Этот раздел основан на Euroflow инструкции. 11 Настройка фотоэлектронный умножитель (ПЛТ) напряжений для флуоресценции каналы и параметров FCS SSC Параметры для FCS SSC вскакивать проточный цитометр и выполнять «цитометр установки и отслеживания (КНТ)» на проточный цитометр КНТ бисером (см. таблицу материалов). Лизируйте клетки крови здоровых доноров (описано в разделе 4.1). Создайте новый эксперимент (в меню: эксперимент, новый эксперимент, выберите пустой эксперимент) с использованием производителя программного обеспечения (см. таблицу материалов) с рассеянием вперед (FSC) против сбоку (SSC) точка точечной настройки параметров FSC и SSC. Назовите этот эксперимент ПЛТ FSC/SCC с датой. Сначала использовать текущие параметры цитометр (щелкните правой кнопкой мыши: «применить текущий КНТ»). Эти параметры были созданы с проверкой производительности КНТ, используя КНТ калибровки бусины (см. таблицу материалов). Отрегулируйте FSC и SSC визуализировать лимфоцитов в «настройках Глобальный эксперимент». Примечание: в нашем проточный цитометр это 285 V и 400 V соответственно. Отметьте «Включить компенсации»: инспектор/инструмент настройки/компенсации. Оценить размер клеток (FSC) и детализации (SSC) старт измерения немеченого лизированы клеток периферической крови функцией «приобретать клетки». Gate лимфоцитов и отрегулировать/тонкий-подстройка FSC и SSC напряжений достичь следующие средние целевые показатели для населения закрытом лимфоцитов: FSC: 100 000 (диапазон 95000-105000); SSC: 15000 (диапазон 13000-17000). Приобретать и записывать данные путем измерения по меньшей мере 10000 событий. Проверьте означает FSC и SSC целевые значения для закрытого лимфоцитов и заново отрегулировать при необходимости. Для настройки целевой флуоресценции каналы ПЛТ напряжений использовать 8-пик Радуга бисера Калибровка частиц (см. таблицу материалов). Создайте новый эксперимент на СУИМ для 7-пиков. Создание листа «Целевой средней интенсивности флуоресценции (MFI)» с все необходимые точки участков (n = 2; FSC по сравнению SSC, FITC против PE), гистограммы (n = 8; одна гистограмма для каждого детектор флуоресценции) и статистические данные, показывающие ссылка пиковые значения (МРИ и коэффициент вариации (CV)) для каждого канала флуоресценции. Подготовьте свежего раствора, содержащего 1 капля (± 60 мкл) Радуга бисера в 1 мл dH2O. нежно вихря смешать бусины в растворе. Используйте параметры ПЛТ FSC/SSC напряжений от выше и начать измерения флуоресценции Радуга бисера, используя функцию «приобрести» (без записи) по курсу «Низкого» потока с порогом, равным 5000. Используйте кнопку «прямоугольная ворота» ворота синглетно бусины населения P1 FSC по сравнению SSC точка сюжет. Ворота 7й пик – P2 населения в FITC против PE точка сюжет. Продолжить на приобретение 7-пики Радуга бисера подвеска и отрегулировать/тонкий-подстройка ПЛТ напряжения во всех каналах флуоресценции для достижения целевых значений МФО согласно аннотированной МФО каналы в соответствии с бисером. Используйте «Запись» для сбора данных около 10000 событий и проверьте МФО для 7й пик бусины. При необходимости исправьте ПЛТ напряжений. Однажды достигли МФО целевого значения для 7й пик, записи/перезаписи файла для окончательного значения ПЛТ. Конечные значения ПЛТ имя и сохраните файл установки ПЛТ с датой, которая будет сохранять в каталоге производителя программного обеспечения. Используйте этот ПЛТ установки для исправления разлива над для каждого Люминесцентная краска. Параметры компенсации флуоресцирования Этикетке трубки для каждого флюрохром конъюгированных антител и безупречная управления (см. таблицу S1 для используемых флуорохромов). Пипетка 100 мкл буфера в каждую пробирку. Вихревой флакон бусины разноцветные компенсации (см. таблицу материалов) тщательно и затем добавить 1 полное падение (± 60 мкл) этих бусин в каждую пробирку.Примечание: Избегайте капель бусины вниз стороне трубки при добавлении их в каждую пробирку. Это может привести к низкой бисера концентрации и может повлиять на результаты компенсации матрицы. Пипетки, соответствующий объем рассчитывается для одного теста достаточно флюрохром конъюгированных антител (который будет достаточно для пятно 106 клеток) в соответствующие трубки и вихревой тщательно. Не добавляйте антитела к трубе неокрашенных управления. Инкубируйте 15-30 мин в темноте при комнатной температуре (RT). Добавить 4 мл буфера мытья (фосфат амортизированное saline (PBS)/0.05% azide-0.1% человеческого сывороточного альбумина (HSA) (см. таблицу материалов)) к каждой трубе. Центрифуга трубы на 300g , 10 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте шарик Пелле путем добавления 0,2 мл буфера мытья к каждой трубе. Вихревой трубы тщательно. Откройте производителя программного обеспечения для анализа (см. таблицу материалов) и создайте новый эксперимент (в меню: эксперимент, новый эксперимент, выберите пустой эксперимента) и переименовать как компенсации файлов с текущей датой. Перейдите в «настройки цитометр» и используйте параметр ПЛТ раздел 3.1. Убедитесь, что порог в FSC 5000 и компенсации значения всех используемых флуорохромов равны нулю. Создайте элементы управления компенсации, включая этикетки конкретных трубки, по мере необходимости. Не забудьте включить элемент неокрашенных. Выберите в меню: эксперимент, компенсация установки, создайте компенсации управления. Загрузить трубки неокрашенных управления и отрегулировать P1 ворот вокруг населения шарик синглетно и убедитесь, что P1 ворота содержит только синглетно бусины. Щелкните правой кнопкой мыши P1 ворота и выберите «Применить для всех компенсации элементов управления». Запись данных для всех один помечены флуоресцентным трубок. Убедитесь, что ворота P2 охватывает положительные население на каждой гистограммы флуоресценции. При необходимости отрегулируйте ворот. Расчет компенсации. Выберите эксперимент, установки компенсации, рассчитать компенсацию. Если расчет компенсации не выполнена, отображается сообщение об ошибке. Внесите необходимые изменения и пересчет. Когда расчет компенсации выполнена успешно, появится диалоговое окно запроса имени для установки компенсации. Введите имя (например, YY-MM-DD 8 цвет настройки) и нажмите, ссылку и сохранить. Установки компенсации будут также сохранены в каталоге установки компенсации.Примечание: Те же параметры могут использоваться для всех экспериментов с использованием же флуорофоров. 4. поток цитометрии оценки (LAIP и LSC) Примечание: Здесь мы описываем основная процедура лизис до окрашивания, которая позволяет пятно предпочтительным концентрацию лейкоцитов. Большинство протоколов MRD использовать этот подход, хотя некоторые успешно использовали другие варианты, например окрашивания перед lysis. Всего костного окрашивания перед лизис минимизирует преференциальных ячейка потерь12, но имеет недостаток концентрации непредсказуемым, слишком низкой сотовый. Основная lysis клетокПримечание: Держите unmanipulated образцы горизонтально на RT, когда приобретение cytrometric потока не может быть выполнена тот же день для того чтобы начать всю процедуру на следующий день. Ресуспензируйте антикоагулянтом образца костного мозга до однородности, инвертирование образец несколько раз. Определить концентрацию клеток костного мозга (белых кровяных телец (Лейкоцитов)) с использованием клеток подсчета камеры с ячейкой, окрашивание Тюрк решение (см. таблицу материалов). Накапайте необходимый объем костного мозга в отдельном 15 мл трубку. Количество клеток зависит количество отдельных окрашивание трубок; для одного окрашивания (одна трубка) используйте примерно 2 х 106 белых клеток крови для LAIP измерений и 8 х 106 белых клеток крови для измерения LSC трубки. Лизировать красных кровяных клеток, добавив лизировать решения (см. таблицу материалов). Необходимый объем лизировать решение должно быть 10 раз превышает объем суспензии клеток. Смешайте нежно, путем инверсии и проинкубируйте втечение 10 мин на RT. Центрифуга для 7 мин 800g в RT. Discard супернатант (например с вакуумный насос или пипетка Пастера). Ресуспензируйте Пелле клеток в фосфат амортизированное saline (PBS)/0.05% azide-0.1% человеческого сывороточного альбумина (HSA) (см. таблицу материалов) на RT. использования максимальной громкости трубки. Центрифуги для 7 мин 800 г на RT. удалить супернатант (например с вакуумный насос или пипетка Пастера). Вновь приостановить Пелле клеток в PBS/0.05% azide-0.1% HSA к концентрации клеток 100 х 106 WBC/мл и разделить на количество предполагаемых трубок. Окрашивание клеток для проточной цитометрии Накапайте моноклональных антител (Моава) коктейль решение смешать в соответствующей ячейке флуоресценции активированный сортировщик (FACS) трубы и проинкубируйте с клетки лизированных костного 15 мин в темноте.Примечание: Это очень важно, когда тандем красители используются. Например увидите смеси панели, стандартно используемые в нашей лаборатории (таблица S1). Вымыть клетки с 3 мл PBS/0.05% azide-0.1% имеет. Центрифуга клетки для 5 мин на 400g. Отбросить супернатант (например с вакуумный насос или пипетка Пастера) и Ресуспензируйте Пелле клеток в 300 мкл PBS/0.05% azide-0.1%HSA. Для измерения LSC: Ресуспензируйте Пелле клеток в 400 мкл PBS/0.05% azide-0.1% HSA и 4 мкл пустых бусины (например Spherotech, см. таблицу материалов) для использования в качестве отрицательного контроля населения в анализе. Откройте моб или LSC эксперимент планировка на СУИМ (см. таблицу материалов) и меру для моб по крайней мере 100.000 WBC закрытого события для измерения ПФТ пациентов образцов на диагноз и 1 X 106 WBC ПФТ образцов в последующей деятельности. Для LSC эксперименты измерения по меньшей мере 4 х 106 WBC в диагностики и последующей деятельности для получения надежного результата LSC. Сохраните данные с помощью стандартизированных соответствующий имя файла для анализа результатов. Составить перечень различных измеряемых маркеров на клетки бод и ПФТ стволовые клетки (положительный, отрицательный, над/под выражение) и хранить эти данные в лаборатории журнала. В случае, если есть мера не диагноз LAIP доступны, все 4 трубы на последующих мер для обеспечения того, чтобы любые возможные измеримые LAIP могут быть определены разные от нормальный подход. Выбрать наиболее надежным LAIP(s)13 на диагноз и получить как много событий как можно скорее, но > минимального числа определены. 5. выявление иммуно-фенотипы связанные лейкемия (LAIP): анализ различных клеточных популяций Примечание: ФТС файлы могут быть проанализированы с несколькими программного обеспечения для оптимальной визуализации различных клеточных популяций (см. таблицу материалов). Белые клетки крови населения Ворота CD45 позитивные клетки и жизнеспособной появляясь клетки, оставляя низкой FSC (нежизнеспособных клеток, эритроидных клеток) в пределах участка FSC/СЮЮ; они содержат ТПН (Рисунок 3Ая). Показать WBC и использовать один из примитивных маркеров (например, CD34; Рисунок 3Aii) чтобы помочь выяснить окончательную позицию взрывов в районе де CD45dim (Рисунок 3Аiii). Ворота CD45dim клеток и обратно строба клетки в сюжет FSC/SSC (рисунок 3Bя). Удаление CD34 ворота (Рисунок 3Bii) сообщая % клеток в эти ворота как % взрывов в дереве населения в программе. Показать взрывы в SSC/CD34 сюжет и строба CD34 позитивные клетки (Figure3Biii). Лимфоциты Используйте лимфоцитов как внутренний контроль: миелоидного населения как отрицательный контроль и лимфоидных населения как позитивный элемент управления. Начать от населения белых кровяных клеток (рис. 4A). Ворота лимфоцитов какCD45 /SSCнизкой численности населения (рис. 4В). Убедитесь, что есть нет миелоидных клеток в ворота, используя CD34, CD117, CD13 или CD33 и ворота для CD13 негатив/CD33 отрицательные клетки (рис. 4C-E). Вызовите это население «лимфоцитов» в дереве населения (Рисунок 4F). LAIP в диагностике Ворота взрывов и впоследствии CD34 позитивные клетки SSC/CD34 сюжет и вызывать эти «примитивных маркер» в дереве населения. Участок примитивные клетки, в этом случае CD34 положительными и лимфоцитов в новый участок с лимфоидных маркер (CD7) против миелоидного маркер (CD33). Ворота аберрантных населения (см. для указания дополнительного файла 1) и называть их «LAIP положительным» в дереве населения.Примечание: Финал, выбрали LAIP сообщается как % LAIP на население взрыва. Чувствительность, специфичность и стабильность LAIPs может устанавливаться только законным персонала с большим опытом в MRD измерения. В общей сложности этих параметров определяет качество LAIP. В рисунке 5 A-Dприводятся примеры оценок четырех различных LAIP в диагностике. Определить выражение LAIPs (% от взрывов) и сохранять эти данные в базу данных или файл excel. Сделайте сообщения о анализ СУИМ и ноты LAIPs, которые должны использоваться при измерениях моб.Примечание: Определение LAIPs разрешается в команде экспертов, поскольку он является важным элементом для точных измерений MRD на последующие вверх. MRD на последующие Ворота взрывов, как описано в разделе 5.1, но в зависимости от времени точки после терапии; Правильная оценка этих ворот может быть сложным. Фокус на LAIP фенотип, которая была учреждена на диагноз и ворота незрелыми населения. Как описано в разделе 5.1. найти правильный взрыва ворота на основе определенных aberrancy и быть осведомлены о регенерации костного мозга и нормальной выражения для того, чтобы их ворота Повторите то же самое стробирования стратегии на всех последующих пунктов и определить MRD как процент LAIP клеток в населенности всего белых кровяных клеток. Смотрите примеры Рисунок 6A и 6B. Доклад MRD позитивности, когда % MRD ≥ 0,1% белых кровяных клеток. Печать анализируемых данных в стандартном формате обсудить каждую неделю с командой моб. Регистрировать результаты после того, как будет достигнут консенсус. Пусть результаты санкционироваться руководителем до ознакомления с результатами клиницисты. 6. анализ стволовых клеток MRD (LSC однотрубные)14 Анализ LSC в диагностике и последующая деятельность Ворота взрыва клетки, как описано в разделе 5.1. Как потенциальные негативные управления CD38-ворота эритроцитов фракция (т.е. оставшиеся эритроцитов после лизиса, характеризуется как SSCнизкой/FSCнизкой и CD45негативных). При необходимости, мертвые клетки и фрагменты клеток могут быть исключены дополнительных ворота в этот участок. Определите в ворота лейкозных взрыва субпопуляция с выражением CD34. Выберите в этой популяции CD34+ CD38– клетки (использовать как отсечения: Верхняя граница пустой калибровки Бусины для определения порога (см. таблицу материалов), красный фракция или использования 103 как пороговой). Вызовите это население «CD38низкой прародителями» (Рисунок 7).Примечание: Увидеть дополнительный файл 1 для получения более подробной информации о параметре CD38-отрезными вне уровней. Определить в рамках этой CD38малочисленностью населения истинный CD34 + CD38очень низкой стволовых клеток населения, используя медиану Красной фракции, Нижняя граница пустой калибровки бусины или выбрать 102 как пороговой (Рисунок 7 ). Просмотреть дополнительные файл 1 для получения более подробной информации о настройке CD38-отрезными вне уровней. В рамках обеих групп населения, ворота лейкозных стволовые клетки против нормальной гемопоэтических стволовых клеток (LSC против HSC), анализируя каждый лейкозных маркер в панели (т.е. CD45RA, комби-6 (CLEC12A, Тим-3, CD7, CD11b, CD22 и CD56 все в PE), CD123, CD33 и CD44). Участок стволовых клеток маркер интерес по сравнению с другими стволовых клеток маркер Сравнение позитивности негативности с позитивности негативности других маркеров и корректировать LSC против HSC частоты. Отчет процент незрелых взрывов, лимфоцитов, CD34 + клеток. Для всех отдельных маркеров список общее количество CD38низкой и CD38verylow и количество CD38низкой и CD38verylow , маркер позитивные (и таким образом опухолевой). Выберите для маркера, лучше всего отличает нормальные гемопоэтические стволовые клетки против лейкозных стволовых клеток для дальнейшего анализа. Рассчитайте процент LSC и HSC как процент от общей WBC.Примечание: Доля LSC ≥ 0,004% сообщается как LSC положительный диагноз, а отключения-0,0001% на последующие. Аберрантное стволовые клетки, стробирование в последующих пробах похож на анализ как диагноз, однако, число клеток в популяции стволовых клеток может быть очень небольшим. Отсюда необходимость приобретения достаточно события.