Purificação de DNA Viral para a identificação de proteínas Viral e celulares associadas
Özet
O objetivo do presente protocolo é especificamente tag e seletivamente isolar o DNA viral de células infectadas para caracterização de proteínas do genoma viral associada.
Abstract
O objetivo do presente protocolo é de isolar o vírus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1) de DNA de células infectadas para a identificação de associado viral e proteínas celulares por espectrometria de massa. Apesar de proteínas que interagem com genomas virais desempenham papéis importantes na determinação do resultado da infecção, uma análise abrangente das proteínas do genoma viral associado não foi anteriormente possível. Aqui vamos demonstrar um método que permite a purificação direta do HSV-1 genomas de células infectadas. Replicação de DNA viral seletivamente é rotulado com nucleotídeos modificados que contêm um grupo funcional de alquino. Rotulado de DNA é então especificamente e irreversivelmente com a tag através a ligação covalente de azida de biotina, através de um de cobre (I)-catalisada reação de cicloadição ou clique azida-alquino. Biotina-tag DNA purified em grânulos streptavidin-revestido e proteínas associadas são eluídas e identificadas por espectrometria de massa. Este método permite a seleção de alvos e isolamento de forquilhas de replicação do HSV-1 ou toda genomas de ambientes biológicos complexos. Além disso, a adaptação desta abordagem permitirá para a investigação de vários aspectos da infecção herpética, bem como o exame dos genomas de outros vírus de DNA.
Introduction
Vírus têm uma capacidade limitada para realizar funções essenciais e, portanto, dependem de fatores do hospedeiro para facilitar os aspectos críticos da infecção, incluindo transporte, replicação, reparo, recombinação e expressão gênica viral. As atividades desses fatores do hospedeiro são, muitas vezes acentuadas por proteínas virally codificadas. Além disso, o vírus devem evitar deteção e interferência por respostas celulares à infecção viral. Portanto, interações hospedeiro de vírus ditam o resultado da infecção. De suma importância é entender como vírus alteram o ambiente celular para adaptar-se a maquinaria celular para facilitar processos virais. De particular interesse é identificar quais fatores e processos atuam sobre genomas virais durante todo o ciclo infeccioso.
Vírus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1) é que uma dupla encalhado DNA vírus que infecta uma parte substancial da população humana. Dentro da primeira hora de infecção, o genoma viral entra no núcleo, onde uma cascata ordenada da expressão dos genes virais resulta em coordenação com viral de replicação de DNA (vDNA)1. No núcleo, genomas estão sujeitos a regulamento epigenético, passam por reparo e recombinação, em são empacotados em capsids, tal que o primeiros virions descendentes são produzidos dentro de menos de seis horas. A avaliação abrangente das proteínas do genoma viral associada ao longo do curso da infecção vai estabelecer as bases para investigar os detalhes moleculares de processos que agem sobre genomas virais e irão fornecer insights sobre quais fatores virais e celulares estão envolvidas em vários estágios de infecção.
Métodos anteriores para a investigação de fatores do hospedeiro envolvidos na infecção viral incluem purificação da afinidade das proteínas virais para a análise de proteínas celulares associados2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. estes ensaios têm sido fundamentais para a identificação de fatores celulares envolvidos em respostas antiviral de acolhimento, bem como a modificação de cromatina viral, expressão gênica, e reparo do DNA. No entanto, é difícil verificar se interações dependem da associação com vDNA e proteomics apenas fornecer insights sobre as interações que ocorrem em função de um fator viral específico. Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) tem sido utilizada para identificar onde as proteínas virais e celulares específicas bind para genomas virais10,11,12,13,14 , 15 e hibridização fluorescente in situ (FISH) combinado com imunocitoquímica permitiu a visualização de fatores celulares que colocalize com vDNA16,17,18, 19 , 20. estes ensaios permitem análise espacial e temporal. No entanto, as limitações incluem a necessidade de anticorpos altamente específicos, sensibilidade limitada e a necessidade de anterior insight interações hospedeiro de vírus. Portanto, desenvolvemos um método baseado na iPOND (isolamento de proteínas DNA nascente)21 e aniPOND (iPOND nativo acelerada)22 para seletivamente rotular e purificar vDNA de infectados células para a imparcial identificação do genoma viral proteínas associadas por espectrometria de massa. iPOND tem sido fundamental para a investigação da dinâmica do garfo de replicação celular.
Para a purificação seletiva de genomas virais de células infectadas, replicar vDNA é rotulado com nucleosídeos ethynyl modificado, 5-ethynyl-2´-desoxiuridina (EdU) ou 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (Figura 1), seguido por ligações covalentes conjugação de azida de biotina, através do clique em química para facilitar a purificação de única etapa de genomas virais e proteínas associadas em grânulos streptavidin-revestido (Figura 2B). Importante, infecções são realizadas em células estacionárias, que não estão envolvidas na replicação do DNA celular para permitir a rotulagem específica de vDNA. Além disso, a infecção HSV-1 faz com que a detenção do ciclo celular e inibe de23,de replicação de DNA celular24. Vírus podem ser prelabeled antes da infecção para a análise de proteínas associadas com entrada genomas virais (figura 1A) ou rotulado durante a replicação do DNA para a análise de proteínas associadas com vDNA recém sintetizado (figura 1B) 25. Além disso, a análise de perseguição do pulso pode ser usado para investigar a natureza das proteínas associadas com replicação viral garfos (Figura 1)26. Além disso, ethynyl-modificado vDNA pode ser covalentemente conjugado com um fluoróforo para investigação espacial da dinâmica da proteína (Figura 2A e Figura 3). Imagem permite a visualização directa de vDNA é uma abordagem complementar para a validação das interações da proteína-vDNA e pode ser adaptada para controlar genomas virais durante a infecção. Nós antecipamos que essas abordagens podem ser mais modificadas para estudar qualquer aspecto da infecção herpética, incluindo latência e reativação e estudar outros vírus de DNA. Além disso, etiquetando com uridina 5-ethynyl (UE) pode permitir para a análise do genoma viral de RNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo inclui várias etapas que, se não seguido com atenção, podem resultar em rendimento de proteína significativamente reduzida ou contaminação com o DNA celular. É fundamental que células fixas são utilizadas para todas as experiências para garantir que o DNA celular não é rotulado e purificado. Isto pode ser confirmado pela ausência de polimerases de DNA celulares na amostra de proteína porque HSV-1 não utiliza DNA-polimerase celular para a síntese do genoma. Durante EdC rotulagem e núcleos …
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos a Hannah Fox pela ajuda na preparação deste manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01AI030612.
Materials
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | stocks with titers greater than 1×109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| freezing buffer | prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2X Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail – Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
Referanslar
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