Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Huijuan You; Shimin Le; Hu Chen; Linyan Qin; Jie Yan

doi:10.3791/56328

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biyokimya

Одноместный молекула манипуляции G-quadruplexes, Магнитные пинцеты

Published: September 19, 2017

doi:

10.3791/56328

Huijuan You*¹, Shimin Le*^2,3, Hu Chen^2,4, Linyan Qin¹, Jie Yan^2,4,5

¹School of Pharmacy, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, ²Mechanobiology Institute,National University of Singapore, ³Fizik Bölümü,National University of Singapore, ⁴Research Institute for Biomimetics and Soft Matter, Fujian Provincial Key Lab for Soft Functional Materials Research, Department of Physics,Xiamen University, ⁵Center for Bioimaging Sciences,National University of Singapore

Özet

Одной молекулы Магнитные пинцеты платформу для манипулирования G-quadruplexes сообщается, что позволяет для изучения G4 стабильность и регулирование различных белков.

Abstract

Non канонические нуклеиновой кислоты вторичная структура, которую G-quadruplexes (G4) участвуют в различных клеточных процессах, таких как репликация ДНК, транскрипция, обработки РНК и удлинение теломер. В ходе этих процессов различные белки связывают и разрешить G4 структуры для выполнения их функций. Как функция G4 часто зависит от стабильности ее складчатые структуры, важно исследовать, как белки, связывающие G4 регулировать стабильности G4. Эта работа представляет метод для обработки одной молекулы G4, используя Магнитные пинцеты, который позволяет исследования регулирования G4 связывания белков на одной молекулы G4 в режиме реального времени. В общем этот метод подходит для широкий спектр применений в исследованиях для взаимодействия белков/лигандов и правил на различных вторичных структур ДНК или РНК.

Introduction

Четыре мель ДНК или РНК G4 структуры играют решающую роль в многих важных биологических процессов¹. Многие белки участвуют в привязке G4 и регулирования, включая белки, связывающие теломер (теломеразы, РПА, TEBPs, Аппл1, TRF2)¹^,², факторы транскрипции (nucleolin, PARP1)³, РНК, белков (hnRNP А1, обработки hnRNP A2)⁴, Хеликазы (BLM, FANCJ, RHAU, предупреждение, Dna2, Pif1)⁵и репликацию ДНК, связанных белков (Rif1, Rev. 1, PrimPolymerase)⁶. Связывание с белками может стабилизировать или дестабилизировать G4 структур; Таким образом, регулирующих последующие биологические функции. Стабильность G4 измерялась тепловой плавка с использованием ультрафиолетового (УФ) или круговой дихроизма (CD) методы⁷. Однако, такие условия не являются физиологические соответствующих и трудно применять к изучению воздействия связывания белков⁷.

Бурное развитие в одной молекулы манипуляции технологий позволило исследования складывания и раскладывания биомолекулы, такие как ДНК или белка, на уровне одной молекулы с резолюцией нанометров в реальном времени⁸. Атомно-силовой микроскопии (АСМ), Оптический пинцет и Магнитные пинцеты являются наиболее часто используемые методы манипуляции одной молекулы. По сравнению с AFM и Оптический пинцет⁹, Магнитные пинцеты позволяют стабильные измерения складные разворачивается динамики одной молекулы дней, используя технику анти дрейф¹⁰^,¹¹.

Здесь один молекула манипуляции платформы, используя магнитные Пинцеты для изучения регуляции G4 стабильности путем связывания белков-сообщил¹²^,¹³. Этой работе излагаются основные подходы, включая подготовку образца и потока канала, установки Магнитные пинцеты и калибровки силы. Управления сил и против дрейфа протоколов, как описано в шаге 3 позволяют на долгое время измерения при различных сил элементы управления, например постоянная сила (силы зажима) и постоянной загрузки оценить (сил рампы) и сила прыжок измерения. Протокол калибровки силы, описанные в шаге 4 позволяет калибровки силы < 1 мкм короткие тросов над большой силой диапазон до 100 pN, с относительной погрешностью в пределах 10%. Пример регулирования устойчивости Helicase РНК, связанные с AU-богатые элемент (RHAU) helicase (псевдоним DHX36, G4R1), который играет существенную роль в урегулировании что РНК G4 используется для демонстрации применения этой платформы¹³.

Protocol

1. Подготовка G4 ДНК для одной молекулы растяжение подготовить 5 '-тиоловых помечены и 5 '-биотин, помечены dsDNA ручки методом ПЦР с помощью DDNA полимеразы на шаблоне ДНК фага лямбда, используя 5 '-тиоловых и 5 '-биотин Праймеры 14 ( рис. 1). Обе ручки dsDNA им…

Representative Results

Настройки эксперимента для растяжения одной молекулы G4 показан на рисунке 4. Последовательность формирования G4 одноцепочечной интервале между двумя ручками dsDNA был привязанный между coverslip и парамагнитными шарик. Чтобы найти шарик привязанный единый ds…

Discussion

Как описано выше, платформу для изучения механическая стабильность G4 ДНК и взаимодействий протеина G4 с помощью одной молекулы Магнитные пинцеты сообщается. Сопроводительных платформа, разработаны высокоэффективные протоколы нахождения G4 ДНК троса и измерение динамики складной разв?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Meng Pan за корректуру рукопись. Эта работа поддерживается, Сингапур министерства от образования академических исследований Фонд Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) до Д.Ю; Национальный исследовательский фонд через Сингапур Mechanobiology института для Д.Ю; Национальный исследовательский фонд, офис премьер-министра, Сингапур, в рамках своей программы Investigatorship СР (СР № Investigatorship премии СР-NRFI2016-03 для Д.Ю; Фонд фундаментальных исследований университетов Центральной H. Y (2017KFYXJJ153).

Materials

DNA PCR primers	IDT		DNA preparations
DNA PCR chemicals	NEB		DNA preparations
restriction enzyme BstXI	NEB	R0113S	DNA preparations
coverslips (#1.5, 2232 mm, and 2020 mm)	BMH.BIOMEDIA	72204	flow channel preparation
Decon90	Decon Laboratories Limited		flow channel preparation
APTES	Sigma	440140-500ML	flow channel preparation
Sulfo-SMCC	ThermoFisher Scientific	22322	flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidin	ThermoFisher Scientific	11205D	flow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm	Polysciences, Inc	17145-5	flow channel preparation
2-Mercaptoethanol	Sigma	M6250-250ML	flow channel preparation
Olympus Microscopes IX71	Olympus	IX71	Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721	Physik Instrumente	P-721	Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X	Olympus	MPLAPON-Oil 100X	Magnetic tweezers setup
CCD/CMOS camera	AVT	Pike F-032B	Magnetic tweezers setup
Translation linear stage	Physik Instrumente	MoCo DC	Magnetic tweezers setup
LED	Thorlabs	MCWHL	Magnetic tweezers setup
Cubic Magnets	Supermagnete		Magnetic tweezers setup
Labview	National Instruments		Magnetic tweezers setup
OriginPro/Matlab	OriginLab/MathWorks		Data analysis

Referanslar

Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Biyokimya. 49 (45), 9706-9714 (2010).
Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?. Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).

Etiketler

G-quadruplex Magnetic Tweezers Single-molecule Manipulation Folding And Unfolding Binding Proteins DNA-protein Interactions Helicase Activity DNA Tether Formation Paramagnetic Beads Nanometer-scale Dynamics

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (127), e56328, doi:10.3791/56328 (2017).