Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Huijuan You; Shimin Le; Hu Chen; Linyan Qin; Jie Yan

doi:10.3791/56328

JoVE Journal > Biochemistry

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Biyokimya

磁気ピンセットで G quadruplexes の単一分子マニピュレーション

Published: September 19, 2017

doi:

10.3791/56328

Huijuan You*¹, Shimin Le*^2,3, Hu Chen^2,4, Linyan Qin¹, Jie Yan^2,4,5

¹School of Pharmacy, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, ²Mechanobiology Institute,National University of Singapore, ³Fizik Bölümü,National University of Singapore, ⁴Research Institute for Biomimetics and Soft Matter, Fujian Provincial Key Lab for Soft Functional Materials Research, Department of Physics,Xiamen University, ⁵Center for Bioimaging Sciences,National University of Singapore

Özet

G quadruplexes を操作する単一分子磁気ピンセットプラットフォームによって報告されます、G4 の安定性と制御の研究によって、様々なタンパク質。

Abstract

非正規の核酸の二次構造 G quadruplexes (G4) は、DNA 複製、転写、RNA プロセシング、テロメア伸長などの多様な細胞プロセスに関与しています。これらのプロセスの中に様々な蛋白質はバインドし、職務の遂行に G4 構造を解決します。G4 の関数は、多くの場合その折り畳まれた構造の安定性に依存、G4 結合蛋白質が G4 の安定性を調節する方法を調査することが重要です。この作業は、リアルタイムで G4 分子に G4 結合タンパク質の制御の研究を可能にする磁気ピンセットを使用して単一の G4 分子を操作するためのメソッドを示します。一般的には、このメソッドは、タンパク質・リガンド相互作用の様々な DNA または RNA 二次構造に規制研究アプリケーションの広い範囲に適しています。

Introduction

4 本鎖 DNA や RNA の G4 の構造は、多くの重要な生物学的プロセス¹に重要な役割を果たします。多くの蛋白質は、G4 のバインディングとテロメア結合タンパク (テロメラーゼ、POT1、RPA、TEBPs、TRF2) などの規制に関与している¹^,², 転写因子 (ヌクレオリン化における PARP1)³、RNA プロセシング蛋白質 (hnRNP A1hnRNP A2)⁴ヘリカーゼ (BLM、FANCJ、RHAU、警告、Dna2、Pif1)⁵、DNA 複製関連蛋白質 (Rif1、REV1, PrimPolymerase)⁶に。蛋白質の結合を安定化したり G4 構造を不安定にします。したがって後続の生体機能を調節します。G4 の安定性は、熱溶融性 uv (紫外線) や円偏光二色性 (CD) の方法⁷を使用して測定しました。ただし、そのような条件は、生理学的な関連、タンパク質⁷のバインドの効果の研究に適用することは困難。

1 分子操作技術の急速な発展は、折りたたみとリアルタイム⁸ナノメートルの分解能での単一分子レベルでのタンパク質や DNA など、生体分子のアンフォールディングの研究を可能にしました。原子間力顕微鏡 (AFM)、光ピンセットや磁気ピンセットは、最も一般的に使用される単一分子操作方法です。原子間力顕微鏡、光ピンセット⁹と比較して、磁気ピンセットはドリフト防止法¹⁰^,¹¹を使用して、日間折り畳み展開単分子動態の安定した測定を許可します。

ここでは、結合蛋白質による G4 安定性の規制を検討する磁気ピンセットを用いた単一分子操作プラットフォームは報告された¹²^,¹³です。この作品では、サンプルと流れチャネルの準備、磁気ピンセットのセットアップ力校正など、基本的な方法について説明します。コンスタント・フォース (力クランプ) など、さまざまな力のコントロールの下で長い時間測定を可能にする力の制御とドリフト防止プロトコルに記載されている手順 3 として、読み込み定数 (力ランプ)、速度し力ジャンプ測定。手順 4 で説明した力校正プロトコルによりの力校正 < 広い力短い綱を 1 μ m の範囲まで 100 pN は、10% 以内の相対誤差と。RNA ヘリカーゼの安定性の規則の例は、RNA G4 はこのプラットフォームの¹³のアプリケーションをデモンストレーションするために使用の解決に重要な役割を果たしている AU 豊富な要素 (RHAU) ヘリカーゼ (別名 DHX36、G4R1) に関連付けられています。

Protocol

1 です単一分子の伸張のための準備の G4 DNA 準備 5 '-チオールラベル及び 5 '-5 を使用してラムダファージ DNA テンプレートの DDNA ポリメラーゼを用いた PCR によるビオチン dsDNA ハンドル '-チオールと 5 '-ビオチン。プライマー 14 ( 図 1)。両方 dsDNA のハンドルがある高い GC の内容 (> 60%) DNA を防ぐために溶融高力または overstretching …

Representative Results

この図の拡大版を表示するのにはここ。 G4 の展開図 5: ジャンプ力測定。力中にビード高さ変化 (A) 代表的な時間トレース 1 pN と 54 pN 10 DmRHAU、なしで測定のサイクルをジャンプ nM DmRHAU が、ATP、なしと両方が 10 nM DmRHAU と 1 mM ATP、図パネルに記載されています。(B…

Discussion

上記、G4 DNA の力学的安定性と G4 を使用して蛋白質の相互作用を研究するためのプラットフォームとして、単一分子磁気ピンセットが報告されます。プラットフォームを伴い、G4 DNA テザーと折り畳み展開ダイナミクス計測とナノメートル特別決議と G4 の構造安定性を見つけることの非常に効率的なプロトコルが開発されています。フォーカルプレーンロックにより非常に安定したのドリフ?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者が原稿を校正孟パンをありがちましょう。この作品はサポートによってシンガポール省の教育学術研究基金第 3 層 (MOE2012-T3-1-001) J.Y.; にJ.Y.; ことシンガポールメカノバイオロジー研究所を通じて国立研究財団国立研究財団、その NRF Investigatorship プログラム (NRF Investigatorship 賞号の下で総理大臣のオフィス、シンガポール、J.Y.; に NRF-NRFI2016-03H. Y に中央大学 (2017KFYXJJ153) の基礎的研究基金。

Materials

DNA PCR primers	IDT		DNA preparations
DNA PCR chemicals	NEB		DNA preparations
restriction enzyme BstXI	NEB	R0113S	DNA preparations
coverslips (#1.5, 2232 mm, and 2020 mm)	BMH.BIOMEDIA	72204	flow channel preparation
Decon90	Decon Laboratories Limited		flow channel preparation
APTES	Sigma	440140-500ML	flow channel preparation
Sulfo-SMCC	ThermoFisher Scientific	22322	flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidin	ThermoFisher Scientific	11205D	flow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm	Polysciences, Inc	17145-5	flow channel preparation
2-Mercaptoethanol	Sigma	M6250-250ML	flow channel preparation
Olympus Microscopes IX71	Olympus	IX71	Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721	Physik Instrumente	P-721	Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X	Olympus	MPLAPON-Oil 100X	Magnetic tweezers setup
CCD/CMOS camera	AVT	Pike F-032B	Magnetic tweezers setup
Translation linear stage	Physik Instrumente	MoCo DC	Magnetic tweezers setup
LED	Thorlabs	MCWHL	Magnetic tweezers setup
Cubic Magnets	Supermagnete		Magnetic tweezers setup
Labview	National Instruments		Magnetic tweezers setup
OriginPro/Matlab	OriginLab/MathWorks		Data analysis

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G-quadruplex Magnetic Tweezers Single-molecule Manipulation Folding And Unfolding Binding Proteins DNA-protein Interactions Helicase Activity DNA Tether Formation Paramagnetic Beads Nanometer-scale Dynamics

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You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (127), e56328, doi:10.3791/56328 (2017).