Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Shubhendu Sen Roy; Huy Cong Xuan Nguyen; Thomas A. Angelovich; Anna C. Hearps; Diana Huynh; Anthony Jaworowski; Theodoros Kelesidis

doi:10.3791/56325

JoVE Journal > Immunology and Infection

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İmmünoloji ve Enfeksiyon

Sin células bioquímico análisis enzimático fluorométrico para medición de alto rendimiento de la peroxidación lipídica en lipoproteínas de alta densidad

Published: October 12, 2017

doi:

10.3791/56325

Shubhendu Sen Roy¹, Huy Cong Xuan Nguyen¹, Thomas A. Angelovich^2,3, Anna C. Hearps², Diana Huynh^1,4, Anthony Jaworowski^2,4, Theodoros Kelesidis¹

¹University of California, Los Angeles, ²Centre for Biomedical Research,Burnet Institute, ³School of Health and Biomedical Sciences,RMIT University, ⁴Department of Infectious Diseases,Monash University

Özet

Describimos aquí un ensayo fluorométrico sin células bioquímico para la determinación de la peroxidación lipídica HDL. Este ensayo rápido y reproducible puede ser utilizado para determinar la función del HDL en estudios a gran escala y puede contribuir a nuestra comprensión de la función del HDL en enfermedad humana.

Abstract

Los niveles de colesterol (HDL-C) bajo lipoproteína de alta densidad son uno de los más poderosos predictores independientes negativos de enfermedad aterosclerótica cardiovascular (ECV). La estructura y la función del HDL en lugar de C-HDL pueden predecir con mayor precisión la ateroesclerosis. Varios HDL proteína y lípidos composición que deterioran la función del HDL cambios en Estados inflamatorios tales como la ateroesclerosis. Función de HDL suele determinarse por célula basado en ensayos tales como ensayo de eflujo de colesterol pero estos ensayos tienen falta de desventajas numerosas de estandarización. Ensayos libres de células pueden dar medidas más sólidas de la función del HDL en comparación con ensayos de célula. Oxidación de HDL deteriora la función del HDL. HDL tiene un papel importante en el transporte de peróxido de lípido y alta cantidad de peróxidos de lípidos está relacionado con la función de HDL anormal. Deben considerarse las interacciones lípido-sonda cuando ensayos de interpretación de los resultados de fluorescencia no enzimáticos para la medición del estado oxidativo de lípidos. Esto nos motivó a desarrollar un método enzimático sin células bioquímico para evaluar HDL peróxido contenido en lípidos (HDLox) que contribuye a la disfunción del HDL. Este método se basa en la enzima peroxidasa de rábano (HRP) y el fluorocromo rojo Amplex que puede cuantificar (sin colesterol oxidasa) el contenido de peróxido de lípido por mg de HDL-C. Aquí un protocolo es describedfor determinación de la peroxidación de lípidos HDL usando el reactivo de fluorocromo. Variabilidad del ensayo puede reducirse por la estricta normalización de condiciones experimentales. HDLox los valores más altos están asociados con la función de antioxidante de HDL reducida. La lectura de este ensayo se asocia con lecturas de ensayos basadas en celdas validados, medidas sustitutas de enfermedades cardiovasculares, inflamación sistémica, disfunción inmune y fenotipos de riesgo cardiovascular y metabólico. Este enfoque técnico es un método robusto para evaluar la función de HDL en las enfermedades humanas donde systemic inflamación, estrés oxidativo y lípidos oxidados tienen un papel clave (como la ateroesclerosis).

Introduction

La enfermedad aterosclerótica cardiovascular (ECV) es la principal causa de muerte en todo el mundo¹^,². Estudios epidemiológicos han mostrado que niveles bajos de colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL) son generalmente inversamente asociados con el riesgo para el desarrollo de ateroesclerosis¹^,². Aunque varios estudios apoyan un papel ateroprotectores para HDL¹^,², el mecanismo por el cual HDL atenúa la iniciación y progresión de la aterosclerosis es complejo ³^,⁴. Así, se ha sugerido que la compleja estructura y función de HDL más que absoluta pueden predecir más exactamente ateroesclerosis ⁵^,⁶^,⁷^,⁸. Varios HDL proteína y lípidos composición que deterioran la función del HDL cambios en Estados inflamatorios tales como la ateroesclerosis. Estos i) reduce su potencial del eflujo de colesterol ⁹, ii) disminuir el antiinflamatorio y aumento de proteínas proinflamatorias asociadas a HDL ⁶^,⁷, iii) disminución de niveles del factor antioxidante y actividad y esferoides capacidad de inhibir la oxidación de la lipoproteína de baja densidad (LDLox)¹⁰ y iv) aumentar el lípido hidroperóxido contenido y redox actividad (HDLox)⁹^,¹¹. Sólidas pruebas que evalúan las funciones de pleotropic de HDL (como el eflujo de colesterol, función antioxidante) pueden complementar la determinación de HDL-C-HDL en la clínica.

Función del HDL es evaluada generalmente por métodos basados en la célula como el eflujo de colesterol ensayo de⁸^,¹³^,¹²^,¹⁴. Estos métodos tienen limitaciones importantes, incluyendo una heterogeneidad significativa en cuanto a tipos de células utilizadas, tipo de lectura registrado, falta de estandarización y los efectos de confusión de triglicéridos ⁷^,¹⁵. Estos inconvenientes plantean dificultades para los estudios clínicos grandes¹⁶. Ensayos libres de células pueden dar medidas más sólidas de la función del HDL en comparación con ensayos de célula. El eflujo de colesterol es una de las funciones más importantes de HDL pero sólo puede ser determinado por ensayos de célula. Otros enfoques para determinar la función de HDL como proteómica¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³^,ensayos de quimiotaxis celular monocito de HDL función ¹⁷^,²²^,²⁵ y ²⁴ no se han estandarizado y no puede usarse en estudios a gran escala en seres humanos.

HDL cuenta con importantes antioxidantes ateroprotectores efecto⁵^,⁶^,⁷^,⁸. Se ha determinado la función antioxidante de las HDL en presencia de LDL en el anterior celular gratis análisis fluorométrico ²⁶. Estos métodos fluorométrico bioquímicos de la función de antioxidante de HDL fueron desarrollados originalmente por Mohamad Navab y Alan Fogelman y sus colegas²⁶. Aunque muchos estudios en humanos han utilizado estos métodos para determinar HDL función ¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³ ^,²⁴, lípidos (HDL)-lípidos (LDL) y las interacciones lípido-fluorocromo pueden limitar la reproducibilidad de estos ensayos bioquímicos no enzimáticos gratis celular de HDL función²⁷^,²⁸.

El interés reciente se ha centrado en las consecuencias funcionales de la oxidación de HDL que es el resultado de la oxidación de lípidos y proteínas dentro de HDL ²⁷^,²⁹^,³⁰. Estudios anteriores han demostrado que oxidación de HDL deteriora la función de HDL ²⁷^,²⁹^,³⁰. HDL tiene un papel importante en el transporte de peróxido de lípido y alta cantidad de peróxidos de lípidos está relacionado con la función de HDL anormal. Así contenido en peróxido lipídico HDL puede ser utilizado para determinar HDL función ⁹^,¹⁷^,²⁰^,³¹ y dado las limitaciones conocidas de anteriores ensayos de HDL función⁷^, ¹⁵^,²⁷^,³², hemos desarrollado un método fluorométrico alternativo que cuantifica HDL lípido contenido en peróxido (HDLox) ³². Este método se basa en la enzima peroxidasa de rábano (HRP) y el fluorocromo rojo Amplex que puede cuantificar (sin colesterol oxidasa) el contenido de peróxido de lípido por mg de HDL-C ³². El principio bioquímico de la prueba se muestra en la figura 1. Hemos demostrado que este enfoque basado en la fluorescencia no tiene las limitaciones del previo análisis del función de HDL de²⁷^,²⁸. Este ensayo ha sido seguir perfeccionando y estandarizados en nuestro laboratorio, por lo que puede ser utilizado confiablemente en estudios humanos de gran escala incluso con plasma criopreservados ³²^,³³^,³⁴^, ³⁵ ^, ³⁶ ^, ³⁷ ^, ³⁸ ^, ³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹ ^, ⁴². la lectura de este ensayo se asocia con lecturas de ensayos basadas en celdas validados, medidas sustitutas de enfermedades cardiovasculares, inflamación sistémica, disfunción inmune y fenotipos de riesgo cardiovascular y metabólico ³² ^, ³³ ^, ³⁴ ^, ³⁵ ^, ³⁶ ^, ³⁷ ^, ³⁸ ^, ³⁹. aquí, se describe este método, sencillo y robusto para medir contenido en peróxido lipídico HDL (HDLox). Este ensayo puede utilizarse como una herramienta para responder a preguntas importantes de investigación sobre el papel de la función del HDL en enfermedad humana donde systemic inflamación, estrés oxidativo y lípidos oxidados tienen un papel clave (como la ateroesclerosis)³².

Protocol

todos los experimentos con muestras biológicas humanas fueron realizados con la aprobación ética de la Universidad de California en Los Ángeles, Los Ángeles y el Comité de ética humana de Alfred Hospital, Melbourne. Nota: hay muchas variaciones de la función de fluorocromo HDL ensayo (véase discusión) 32. A continuación describimos el protocolo que da los resultados más consistentes y reproducibles. Un resumen del ensayo se muestra en la <strong class="xf…

Representative Results

Se añaden 50 μl de cada muestra de HDL en cada pozo como en el paso 7.3. 50 μl de solución HRP 5 U/mL (0,25 U) se añaden en cada pozo como en el paso 7.5. Las muestras se incuban durante 30 min a 37 ° C como en el paso 7.6. Entonces se añaden 50 μl de reactivo de fluorocromo en cada pozo como en el paso 7.7 (concentración final de 300 μm). La lectura fluorescente (en oscuro) entonces se evalúa cada minuto durante 120 minutos a 37 ° C con un lector de placa fluorescente (530/59…

Discussion

El protocolo aquí descrito ofrece una herramienta robusta para responder a preguntas de la investigación sobre el papel de la función de HDL en la aterosclerosis y la enfermedad humana. El ensayo cuantifica el contenido en peróxido lipídico HDL por mg de HDL-C mediante amplificación enzimática (HRP). Este enfoque evita limitaciones conocidas de anteriores ensayos de función de HDL (p. ej. ensayo de eflujo de colesterol) incluyendo una heterogeneidad significativa en cuanto a tipos de células utilizadas, tipo de …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen con gratitud el trabajo de Dr. Mohamad Navab, Alan Fogelman y Srinivasa Reddy por su papel clave en el desarrollo de iteraciones anteriores de este modelo. T.A.A. es apoyado por Beca Postdoctoral un RMIT Universidad del rector. AJ y AH son apoyados por el NHMRC proyecto grant 1108792. TK es apoyado por subvenciones de NIH NIH K08AI08272, subvención del NIH/NCATS # µL1TR000124.

Materials

Experimental Reagents
HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent	Pointe Scientific	H7511
Amplex Red reagent.	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light
DMSO.	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light
Horse Radish Peroxidase (HRP)	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light
Cholesterol Esterase.	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light
Cholesterol Reference standard	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light
Resorufin fluorescense Reference standard	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light
5x Reaction Buffer.	Life Technologies, Grand Island, NY	A12216	Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light
HDL Cholesterol Automated Reagent	ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.	TR39601
Name	Company	Catalog Number	Yorumlar
Plasticware
96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear).	Sigma Aldrich	M0687
96-well plates (polypropylene, flat bottom, black).	Sigma Aldrich	M9936
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 125.150
ClipTip 200, sterile	ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.	14-488-058
Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125	ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.	14-387–955
Name	Company	Catalog Number	Yorumlar
Software
Gen5 2.01 software	Biotek, Vermont, USA	NA
Name	Company	Catalog Number	Yorumlar
Equipment
Gen5 Plate reader	Biotek, Vermont, USA	NA

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Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay High-throughput Lipid Peroxidation High Density Lipoprotein HDL Function Cardiovascular Disease Metabolic Abnormalities Inflammatory Diseases HDL-C HDLox Pooled Quality Control HDL Cholesterol Precipitating Reagent HRP Fluorochrome Reagent DMSO

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Sen Roy, S., Nguyen, H. C. X., Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Huynh, D., Jaworowski, A., Kelesidis, T. Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (128), e56325, doi:10.3791/56325 (2017).